에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila 모델

이 절차의 전반적인 목표는 성체 Drosophila melanogaster의 학습과 기억을 연구하는 것이며, 우선 파리가 운동 능력 결손을 겪고 있는지 확인하는 것입니다. 파리들은 음의 지자기성(negative geotaxis) 분석을 통해 테스트됩니다. 그 다음, 파리를 T-미로에 넣고 선호하는 밝은 챔버로 이동하는 데 걸리는 잠복기를 기록함으로써 양의 광택성(positive phototactic) 행동을 검증합니다.

그 후 양성 광택성을 가진 초파리들이 빛이 들어오는 챔버를 퀴닌의 쓴맛과 연관시키도록 조건화합니다. 최종적으로, 초파리들이 혐오 자극을 빛이 들어오는 챔버와 얼마나 잘 연관시키는지 테스트하여 학습 및 기억 능력을 측정합니다. Ola, X 실험실에 오신 것을 환영합니다.

오늘은 초파리의 신경퇴행을 연구하기 위해 흔히 사용되는 두 가지 행동 분석법을 시연하겠습니다. 먼저 저희 실험실의 학부생인 Wil Fredo sala와 제가 혐오 광택성 억제 분석법(aversive phototaxis suppression assay)을 보여드린 후, 이어서 저희 실험실의 대학원생인 kaiwan이 음성 지각성 분석법(negative geotaxis assay)을 시연하겠습니다. 초파리는 25 °C의 온도와 12시간 명-암 주기 조건에서 표준 옥수수 가루-한천-당밀-효모 배지(standard cornmeal agar molasses yeast medium)를 사용하여 사육하십시오.

폐색 당일에 처녀 파리를 20마리씩 그룹으로 분류합니다. 처녀 파리는 밝은 색상과 복부 아래쪽에 위치한 짙은 녹색 반점으로 식별할 수 있습니다. 파리는 3일마다 새 바이알로 옮겨주어야 하며, 유전적 배경으로 인한 차이를 최소화하기 위해 형제 파리를 사용해야 합니다.

지오택시스(geo taxes) 연구에서는 유전자형 또는 처리군당 10-20개 그룹을 테스트해야 합니다. 우선 암컷과 수컷 파리를 10마리씩 그룹으로 분류하십시오. 이 파리들은 각각 별도로 테스트해야 합니다.

행동은 성별에 의해 상당한 영향을 받으므로, 운동 능력이 저하되지 않았는지 확인하기 위해 마취 후 최소 한 시간을 기다린 다음 진행하십시오. 초파리가 완벽하게 준비되면, 두 개의 빈 폴리스티렌 바이알의 입구를 하단 바이알 위에 수직으로 결합하여 정렬하십시오.

바닥에서 8cm를 측정한 후 둘레를 따라 원을 그립니다. 장치 조립이 완료되면, 파리 10마리 한 그룹을 하단 바이알로 옮깁니다. 즉시 바이알들을 다시 연결하고, 테스트 전 1분 동안 파리들을 적응시킵니다.

초파리가 안정된 후, 가볍게 두드려 바이알 바닥으로 내리고 10초 이내에 8cm 표시선 위로 올라오는 초파리의 수를 측정합니다. 이 표시선을 통과한 그룹당 초파리 수를 전체 초파리 수에 대한 백분율로 기록합니다. 이 절차를 그룹당 10회 반복하며, 각 시험 사이에 초파리가 1분 동안 휴식할 수 있도록 합니다.

PS 분석 6시간 전에 암컷 초파리를 물을 적신 여과지가 들어 있는 폴리스티렌 바이알에 분류하여 넣습니다. 이 단계는 초파리를 굶겨 혐오미에 더 민감하게 반응하도록 하기 위함입니다. 본 분석에서는 퀴닌 용액이 혐오 자극제로 사용됩니다.

0.1 M 스톡 용액으로부터 1 µM 농도의 작업 용액을 준비합니다. T-미로(T maze)는 트랩 도어가 있는 중앙 기둥과 어두운 챔버 및 밝은 챔버의 두 가지 측면 챔버로 구성됩니다. 2 mm 지점에서 수동 톱을 사용하여 15 mL 플라스틱 원심분리 튜브 2개의 막힌 끝부분을 잘라내고, 양 끝에 커넥터 어댑터를 장착한 후 파라폼으로 연결 부위를 밀봉합니다.

암실 역할을 하도록 튜브 하나를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 중앙 기둥의 양쪽에 명실과 암실을 나사로 조여 TMA를 조립합니다. 중앙의 트랩 도어를 닫은 상태에서, 광원을 명실의 어댑터에 직접 연결하여 설정을 완료합니다. 분석을 수행하기 전, 각 그룹의 파리 10마리를 각각 빈 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 탈출을 방지하기 위해 캡을 가볍게 닫습니다.

다음으로, TMA에서 암실 챔버를 돌려 분리합니다. 초파리 한 마리를 튜브로 옮긴 후 즉시 미로에 다시 삽입합니다. 실내 조명을 끄고 적색등을 켭니다.

초파리가 암실에서 30초 동안 적응하도록 둔 다음, 명실을 비추는 광원을 천천히 켭니다. 조명이 켜지면 두 챔버를 구분하는 트랩 도어를 엽니다. 초파리가 10초 이내에 명실로 걸어 들어가면 양성 광택성(positively photo tactic)이 있는 것으로 간주하며 학습 준비가 된 것입니다.

이러한 방식으로 반응하지 않는 것은 시각 체계에 문제가 있음을 나타내며, 분석 대상에서 제외해야 합니다. 양성 광택성이 확인되면, 파리를 가볍게 쳐서 다시 암실로 보내고, 32초의 휴식 시간 동안 트랩 도어를 닫고 조명을 끕니다. 여과지를 조명 챔버에 넣고 퀴닌 용액 1 mL를 여과지에 피펫팅하여 혐오 자극제를 준비합니다.

모든 여과지가 혐오 자극제로 완전히 적셔졌는지 확인합니다. 조건화를 시작하려면 트랩 도어를 천천히 열고 조명을 켭니다. 초파리가 퀴닌 향이 나는 조명 챔버 안으로 걸어 들어가게 합니다.

1분 후, 파리를 쳐서 다시 암실로 되돌립니다. 이 과정을 9번 반복하여 총 10회의 조건화 시도를 수행합니다. 일반적으로 타입 파리들은 3~5회의 훈련 시도 후, 훈련 직후에 명실을 피하는 경향을 보입니다.

5회의 테스트 시험을 실시합니다. 훈련된 초파리가 10초 이내에 챔버의 빛 속으로 걸어 들어가지 않으면 통과로 기록합니다. 5회 연속 시험의 통과율을 기록하고 지정합니다.

PC 0 단계입니다. 훈련 및 초기 PC 0 기록이 완료된 후, 각 초파리를 원래의 번호가 매겨진 먹이 병에 다시 넣고 6시간 동안 따로 보관합니다. 훈련 6시간 후에 앞서 시연한 것과 같이 5회의 추가 테스트 시행을 실시하며, 이 통과율이 PC 6을 나타내며 단기 기억의 측정값이 됩니다.

음성 지오택시스(negative geotaxis) 분석에서, 8cm 표시선을 통과하는 초파리의 수는 백분율로 환산되어 등반 통과율로 제시됩니다. 오른쪽에서 볼 수 있듯이 10회의 반복 실험 결과, Human tau를 과발현시킨 10일 된 수컷 또는 암컷 초파리는 왼쪽의 연령이 동일한 GFP 과발현 초파리에 비해 유의미한 운동 능력 저하를 보입니다.

혐오 광택성 억제 분석(aversive phototaxis suppression assay)의 성적은 평균 통과율 또는 성공적인 회피 시험의 백분율로 나타냅니다. 오른쪽의 tau 과발현 초파리는 왼쪽의 대조군과 비교했을 때, 훈련 직후와 6시간 후 테스트 시 모두 빛과 쓴맛을 연합시키는 능력이 떨어지는 것으로 나타났습니다. 이 절차 이후, 형태학적 차이에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 면역조직화학 분석용 샘플을 채취할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 초파리 모델을 이용한 학습 및 기억 연구 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

그리고 기억하세요, 모든 것은 당신에게 달려 있습니다.