Name: 씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis thaliana의 극성 지질 프로파일링 방법을 TLC와 GLC를 결합하여 분석하는 기술입니다. 이 단순하고 견고한 방법은 대규모 돌연변이체 선별에 효율적이며 식물 지질 대사 연구에 유용합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 크리스토프 베닝을 부여하여 지원됩니다.

1. 지질 추출 <ol><li> 한천의 성장 식물에서 4 주 된 Arabidopsis 잎 중간이나 흙을 확정하고 1.5 ML의 폴리 프로필렌 반응 튜브에 그들을 전송 30 MG를 수확하여 지질 추출을 시작합니다. 신선한 잎은는 플래시 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> , 클로로포름과 개미의 산성 (20시 10분 1초, V / V / V) 각 시료에 메탄올로 구성된 용매 300 μL 추출을 추가합니다. 5 분 (페인트 통 또는 이와 유사한 사용) 적극적으로 흔들어. </li><li> 0.2 M의 인산 (H 3 PO 4), 1 M의 칼륨 염화물 (KCl)와 소용돌이 간략 150 μL를 추가합니다. </li><li> 1 분 실온에서 13,000 XG에서 원심 분리기. 낮은 클로로포름 단계에 녹아있는 Lipids는 TLC 플레이트에 발견됩니다. </li></ol> 2. 얇은 레이어 크로마 토그래피 (TLC) 15 <ol><li> 잠수함 0.15 M의 암모늄 황산 ((NH 4) 2 SO 4) 용액에 30 초에 대한 스트립을 읽어와 20cmx20cm 실리카 겔 코팅 TLC 판을 TLC 번호판을 준비하려면 30 초 동안 잠수함이 잠수 후 최소 2 일 동안 번호판을 건조 대상 컨테이너. 인증하는 동안 암모늄의 승화는 다른 glycerolipids로부터 분리에 필요한 phosphatidylglycerol을 protonates 황산, 뒤에 잎. </li><li> 실험 당일, 활성화 120에서 오븐에 굽고하여 번호판을 TLC 2.5 시간에 대한 ° C. </li><li> 상온에 활성 접시를 냉각 후, 크로마토 그램의 기원에 접시에 걸쳐 직선 (접시의 가장자리에서 1.5 cm)을 그리는 연필을 사용합니다. </li><li> 펌 두건에서, 천천히 N 2의 느린 흐름에 따라 200 μL 노란색 플라스틱 팁을 20 μL 피펫을 사용하여 낮은 클로로포름 단계 3 X에게 지질 추출물 20 μL를 제공합니다. 이를 위해 Tygon 튜빙은 N 2 탱크 조절기에 연결되어 있습니다. 지름 1cm보다 작은 자리를 유지. 각 판은 10 샘플 (후속 GLC 분석이 계획되어 경우)까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 지방질이 퓸 후드 완전히 건조 명소로서, 아세톤, 톨루엔, 물 (: 30 ML : 7.5 ML 91 ML)로 구성된 개발 용매를 준비합니다. 주위 공기 상대 습도가 높으면 분리에 영향을 수 있습니다. 원하는 분리를 달성하기이 경우 물을 (7.0 ML : : 30 ML 91 ML)를 제공하기 위해 감소되어야합니다. </li><li> 아래로 향하게 샘플 엔드와 탱크에 장소 플레이트 챔버 (H : W = 27.0 : 26.5 7.0 cm / cm / cm L) 개발 sealable TLC에 용매 개발 80 ML 하거라. 클램프를 사용하여 탱크를 밀봉합니다. 솔벤트는 접시를 계승하고 lipids가 분리됩니다. 개발 시간은 실온에서 약 50 분 거리에 있습니다. </li><li> 용매 전면 판의 상단에서 1cm에 도달했습니다 때, 신중하게 탱크에서 접시를 제거하고 약 10 분 퓸 후드 완전히 건조. </li><li> TLC로 구분 Lipids도 reversibly 정량 분석​​ 또는 황산 또는 α - 나프톨와 irreversibly 스테인드에 대한 요오드와 함께 간략하게 물들일 수 있습니다. <ol><li> 황산의 차링 : 15 분 (그림 2A) 120 ° C에서 퓸 후드 구워에서 유리 스프레이 병에 물이 50% 황산과 스프레이 접시. </li><li> glycolipids에 대한 α - 나프톨 얼룩 : 120 ° C에서 2.4 % (W / V) 10 % α - 나프톨 (V / V) 황산, 80 % (V / V) 에탄올 구워 함께 접시에 스프레이 3-5위한 glycolipid 밴드까지 분 (그림 2B) 분홍색이나 보라색 얼룩이 있습니다. Overtreatment은 시약에 황산의 존재로 인해 모든 lipids의 차링으로 이어질 것입니다. </li><li> 요오드 얼룩 : 퓸 후드에 요오드 결정이있는 폐쇄 TLC 탱크 (lipids 볼 때까지 요오드 증기와 분위기의 채도로 이어지는 하단에 트레이)에 접시를 놓습니다. 너무 오래 요오드가 covalently 고도 불포화 지방산 (그림 2C)을 수정할 수 있으므로 요오드에 접시를 노출시키지 마십시오. 또는, 샘플 차선과 interspersed는 표준 차선이 유리 울 N 2는 각각 표준 차선 이상의 폭격을 받았고이를 통해 요오드 결정과 파스퇴르 피펫을 연결을 사용하여 스테인드해야 lipids의 산화를 방지합니다. </li></ol></li></ol> 3. 지방산 아실 Methylester (명성) 반응 16 <ol><li> 면도날과 TLC 판에서 실리카 주변 식별 지질 명소를 제거합니다. 지질이 포함된 실리카을 다쳤고과 테플론 (PTFE) - 줄지어 나사 마개와 유리관에 깔때기를 사용하여 실리카 분말을 전송할 수 있습니다. </li><li> 유리 피펫 각 샘플에 무수 메탄올 1 ML 1 N 염산 (HCL)을 추가합니다. </li><li> 200 μL 노란색 플라스틱 팁과 200 μL 피펫을 사용하여 내부 표준으로 각각의 시료 200 μL 피펫을 사용하여 100 μL 50 μg ML -1 pentadecanoic 산성 (15시)를 추가합니다. 튜브 컨트롤로 methanolic HCL에서만 pentadecenoic 산성과 함께 보관하십시오. 테플론 - 줄지어 모자와 밀접하게 유리 튜브를 닫습니다. </li><li> 부화 GL25 분 80 ° C의 물을 욕조에 엉덩이가 튜브. 용매가 증발하지 않도록 튜브 봉인해야합니다. </li><li> 튜브가 냉각되면 적극적으로 한 ML의 헥산과 와동 다음 1 ML 0.9 %의 나트륨 염화물을 추가합니다. 3 분 1000xg에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 펌 모자, 파스퇴르 피펫으로 시료의 헥산 / 상위 레이어를 제거하고 새로운 13x100 mm의 유리관에 넣습니다. </li><li> 완전히 건조하지 않고 N 2의 느린 흐름에 따라 헥산을 증발. </li><li> 60 μL 헥산의 결과 지방산 아실 methylesters s를 디졸브. autosampler 튜브와 긴밀하게 모자에 샘플을 전송합니다. 샘플 ° C 단기 및 -20 ° C에 대한 몇 일 동안 4 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC) 10 <ol><li> GLC를 시작하기 전에, 헬륨, 수소와 공기 실린더가 가득 있는지 확인합니다. </li><li> 충분한 헥산은 용매 저수지에 추가되어야하고 폐기물 컨테이너가 비어 있어야합니다. 지방산 아실 methylesters 분리 들어, 시스템에 DB - 23 컬럼을 연결합니다. </li><li> autosampler에 플레이스 유리병. 시스템 컴퓨터에 GLC에 대한 Chemstation 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 250 ° 헬륨 유량 48.6 ML 분 -1에서 속도와 21.93 PSI의 압력 C.에서 입구 온도를 설정 분할 비율은 30.0입니다 : 1. </li><li> 오븐 온도는 2 분 140 ° C에서 초기 설정 ° C 25 ° C 분 -1의 속도로 160 증가합니다. 다음 160의 증가로 온도를 설정할 ° C 250 ° C 8 속도 ° C 분 -1 250에서 개최 ° 140 감소 뒤에 4 분에 대한 C ° C 38 ° C 비율 분 - 1. 하나의 실행 약 21 분 정도 소요됩니다. </li><li> 불꽃 이온화 검출기의 온도는 270입니다 ° 30.0 ML 분 -1, 400 ML 분 -1과 헬륨 유량 30.0 ML 분 -1시에서 공기 흐름 속도의 수소 유량과 C. </li><li> 튜브 및 실행 시퀀스 테이블에 샘플 이름의 번호를 입력합니다. 유리병 당 2 μL 시료를 주입하기 위해 10 μL 주입기를 설정합니다. </li><li> 악기가 준비되면, 실행 순서를 시작합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 4 주 된 Arabidopsis의 모종의 TLC로 구분 lipids의 돌이킬 수없는 얼룩의 예는 그림 2에 표시됩니다. 황산 스테인드 lipids (그림 2A)가 탄과 갈색 반점으로 나타납니다 있습니다. α - 나프톨 다른 극지 lipids은 (그림 2B) 노란색 얼룩 동안 α - 나프톨은 분홍색 - 보라색 색상을 가지고 물들일 등 Glycolipids을 SQDG, DGDG 같은 MGDG 같은 glycolipids을 얼룩이 좋습니다. 요오드 얼룩도 가능해과 lipids에게 요오드 증발 (그림 2C)로 짧은 시간이 지남에 따라 사라집니다 노란 색상을 제공합니다. 흠없는 lipids가 lipids의 분해 감소 것이 바람직 있지만 간단히 요오드 스테인드 lipids는 GLC 분석의 대상이 될 수 있습니다. 성공적으로 완료하면, 다른 지방산 아실 methylester를 나타내는 독특한 신호는 (그림 3) GLC 후 관찰됩니다. 짧은 탄소 사슬과 적은 더블 채권과 지방산 아실 methylester은 DB - 23 컬럼을 사용하여 짧은 체류 시간이 있습니다. 지방산 아실 methylester 프로 파일링이 변경 지질 성분과 돌연변이를 식별하는 중요한 도구입니다. 그림 4에서 MGDG18 : 3 지방산 어금니 비율은 야생 유형 18 비교 tgd4 - 1 돌연변이 감소됩니다. 모든 지질 클래스의 몰스 하나의 지질 클래스 지방산 아실 methylester의 몰스을 나누어 각 지질의 어금니 비율 계산됩니다. 예를 들어, MGDG의 어금니 비율을 계산 : (MGDG) 몰 %는 = Σ [FAMEs (MGDG)] / Σ [FAMEs (총)] x100의 % 야생 유형과 돌연변이 모두에서 각 지질 클래스의 결과 어금니 비율을 비교할 수 있습니다. 예를 들어, tgd4 - 1 돌연변이 MGDG와 PG의 상대적인 양의 증가하지만 DGDG 및 PE (그림 5) 18 양을 감소했다. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> Arabidopsis 모종을 사용하여 극성 지질 분석 그림 1. 플로우 차트. 총 lipids 4 주 된 Arabidopsis의 모종에서 추출한 및 TLC로 구분됩니다. 구분 lipids는 GLC 분석 다음 transesterification에 대한 TLC 플레이트에서 까진 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. TLC 플레이트에 lipids의 분리. 35 MG의 지질 추출물는 (신선한 무게) 야생 유형 모종은 TLC로 구분하여 황산 (A), α - 나프톨 (B) 또는 요오드 증기 (C)로 물들어있다. 세 반복은 각 얼룩 방법으로 표시됩니다. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, PC, phosphatidylcholine, PE, phosphatidylethanolamine, PG, phosphatidylglycerol, PI, phosphatidylinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 지방산 Methylesters의 GLC 분석 (FAMEs)은 야생 유형의 MGDG에서 파생. FAMEs는 30m 모세관 컬럼을 분리하여 불꽃 이온화에 의해 감지됩니다. Pentadecanoic 산성 (15시)는 내부 표준으로 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 야생 유형 Col2 (흰색 열)과 tgd4 - 1 돌연변이 (검은 열)에 MGDG의 지방산 프로파일. 지방산은 이중 채권의 수에 따라 탄소의 번호로 제공됩니다. 세 반복은 평균이며, 표준 편차가 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 야생 유형 Col2 (흰색 열)의 폴라 lipids 구성 및 tgd4 - 1 돌연변이 (검은 열). 세 반복은 평균이며 표준 편차는 오류 막대로 표시됩니다.

<ol><li>Ajjawi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+reverse+genetics+in+Arabidopsis%3A+case+studies+from+the+Chloroplast+2010+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project.</a> Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).</li>
<li>Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+cytosolic+lipases+in+converting+phosphatidyl+choline+to+substrate+for+galactolipid+synthesis+in+the+chloroplast+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).</li>
<li>Awai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidic+acid-binding+protein+of+the+chloroplast+inner+envelope+membrane+involved+in+lipid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).</li>
<li>Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lipid+transport+involved+in+organelle+biogenesis+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).</li>
<li>Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+leaf+lipids+determined+after+combined+digestion+and+fatty+acid+methyl+ester+formation+from+fresh+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue.</a> Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).</li>
<li>Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+galactolipid+biosynthesis+and+lipid+trafficking+mediated+by+DGD1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1.</a> Science. 284, 2181-2181 (1999).</li>
<li>Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosystem+II+at+2.9-A+resolution+and+the+role+of+quinones%2C+lipids%2C+channels+and+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride.</a> 16, 334-334 (2009).</li>
<li>Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGD1-independent+biosynthesis+of+extraplastidic+galactolipids+after+phosphate+deprivation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).</li>
<li>James, A. T., MARTIN, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+partition+chromatography%3B+the+separation+and+micro-estimation+of+volatile+fatty+acids+from+formic+acid+to+dodecanoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid.</a> Biochem. J. 50, 679-679 (1952).</li>
<li>Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution.</a> Nature. 411, 909-909 (2001).</li>
<li>Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-B+monogalactosyldiacylglycerol+synthases+are+involved+in+phosphate+starvation-induced+lipid+remodeling%2C+and+are+crucial+for+low-phosphate+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation.</a> Plant J. 57, 322-322 (2009).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+ATPase+protein+of+Arabidopsis%2C+TGD3%2C+involved+in+chloroplast+lipid+import%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import.</a> J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).</li>
<li>Ohlrogge, J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid biosynthesis.</a> Plant Cell. 7, 957-957 (1995).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography%3B+methods%2C+influencing+factors+and+an+example+of+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use.</a> Pharmazie. 11, 633-633 (1956).</li>
<li>Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+chromatography+of+highly+unsaturated+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).</li>
<li>Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+scan+modes+for+plant+chloroplast+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids.</a> Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+between+the+endoplasmic+reticulum+and+the+plastid+in+Arabidopsis+requires+the+extraplastidic+TGD4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein.</a> Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+TGD1+chloroplast+envelope+protein+affects+phosphatidate+metabolism+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permease-like+protein+involved+in+ER+to+thylakoid+lipid+transfer+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis.</a> EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

GLC와 TLC 결합하여 식물의 극지 lipids의 정량 분석​​을위한 강력하고 신속한 도구를 제공합니다. 지질 구성에 약간의 변화는 확인할 수 있으므로이 방법은 북극 지질 대사 경로 1,20에서 장애인 돌연변이의 대규모 심사에 사용되고 있습니다. 이 방법은 널리 기판으로 극지 lipids을 이용한 효소의 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 2,6,7 단풍 게다가, 같은 뿌리와 씨앗이나 chloroplasts 및 mitochondria와 같은 subcellular 분수와 같은 다른 식물 조직의 지질 조성도 같은 방법으로 결정하실 수 있습니다. 여기에 사용되는 용매 시스템 (아세톤, 톨루엔, 물) 공장에서 glycolipids 및 phospholipids의 분리에 최적입니다. tetragalactosyldiacylglycerol는 PC에서 실행하는 동안 그러나, tgd1, 2,3,4 돌연변이 및 절연 chloroplasts에서 TGDG은 PE와 함께 실행됩니다. 이 경우에는 클로로포름, 메탄올, 초산과 물 (85 : 20 : 10 : 4, V / V / V / V)와 용매 시스템은 13 사용됩니다. 때로는 두 개의 서로 다른 용매 시스템을 사용하여 2 차원 TLC은 추가 별도의 glycolipids 및 phospholipids 19 수행됩니다. 또한, 식물의 조직 직접 TLC 5 초기 분리하지 않고 전체 지방산 프로파일을 결정하는 GLC 다음 명성 반응을 받다 수 있습니다. 시연 TLC - GLC 시스템 게다가, 지질 프로파일에 사용되는 다른 방법은 직접 전기 분무 이온화 질량 분석계 협동 17 기반으로합니다. 이 방법에서는 추출에 lipids의 초기 색층 분리가 생략됩니다. 그러나,이 방법은 실험실이나 돌연변이 검사에 대한 일상적인 분석을 위해 덜 유용하게 고가의 장비와 숙련된 인력을 필요로합니다.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naphthol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>3N 메탄올성 HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>메탄올로 1N까지 희석</td></tr><tr><td>Si250-PA TLC 플레이트</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>전흡착제 포함</td></tr><tr><td>TLC 챔버</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡 튜브</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 디스크</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>GLC 시스템</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>DB-23 컬럼</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>GLC 바이알</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>GLC 바이알 캡</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

씬 크로마 토그래피 (tlc)에 의해 arabidopsis thaliana 폴라 glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (glc)와 결합

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

환경에서 생물 세포막 분리 세포. 이러한 phosphatidylcholine 또는 phosphatidylethanolamine, 셀과 주변 사이의 화학 교류 모두 경계와 인터페이스 역할을 양식 이중층의 점막과 같은 다세포 식물과 동물, glycerolipids에 하나의 세포에서. 동물과 달리 식물 세포는 광합성을위한 특별한 organelle, 엽록체 있습니다. monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4 : 엽록체의 복잡한 멤브레인 시스템 즉 고유 glycerolipids 인이 부족해 glycolipids가 포함되어 있습니다. 이러한 lipids의 역할은 단순히 구조적인 이상입니다. 이러한 glycolipids 및 기타 glycerolipids는 photosystem I 및 II는 광합성 8,11에서 glycerolipids의 참여를 나타내는의 결정 구조에서 발견되었습니다. 인산염 기아 동안 DGDG는 phospholipids 9,12의 손실을 보상하기 위해 extraplastidic 세포막로 전송됩니다. 대부분 이러한 lipids의 생합성 및 기능을 우리의 지식은 Arabidopsis thaliana의 14 유전과 생화 학적 연구의 조합에서 파생되었습니다. 이러한 연구하는 동안, 북극 lipids의 분석을위한 간단한 절차는 지질 돌연변이의 검사 및 분석을위한 필수되었으며 자세하게 설명됩니다. 잎 지질 추출물 먼저 얇은 층 크로마 토그래피 (T​​LC)로 구분되며 glycerolipids는 요오드 증기로 reversibly 스테인드 있습니다. 개인 lipids은 TLC 판에서 스크랩한 및 불꽃 이온화 검출 (FID - GLC) (그림 1)과 함께 기체 - 액체 크로마 토그래피로 분석 아르 지방산 아실 methylesters (FAMEs)로 변환됩니다. 이 방법은 돌연변이 검사에 대한 안정적인 도구로 입증되었습니다. 예를 들어, tgd1, 2,3,4 endoplasmic reticulum - 투 - plastid 지질 인신 매매 돌연변이가 비정상 galactoglycerolipid의 축적을 기반으로 발견되었습니다 : trigalactosyldiacylglycerol (TGDG)와 18시 3분의 상대적 금액이 감소 (탄소 더블 채권) 멤브레인 lipids 3,13,18,20의 지방산 아실 그룹. 이 방법은 기판을 6으로 lipids를 사용하여 단백질의 효소 활동을 결정하는 적용됩니다.

극지 지질 추출물의 조성과 개별 glycerolipids의 지방산 조성은 간단하고 강력한 지질 프로파일 실험에서 결정됩니다. 이를 위해 glycerolipids는 얇은 층 크로마 토그래피에 의해 격리되고 그들의 아실 그룹의 transmethylation를 받게. 지방산 아실 methylesters는 기체 - 액체 크로마 토그래피에 의해 계량입니다.

씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

생체막은 세포를 외부 환경으로부터 분리합니다. 단세포 생물부터 다세포 식물 및 동물에 이르기까지, ...와 같은 글리세로지질은

이 실험 절차의 전반적인 목표는 애기장대 유묘의 극성 지질 조성을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 유묘에서 지질을 추출함으로써 수행됩니다. 그 후, 박층 크로마토그래피를 통해 극성 지질을 분리합니다.다음으로 박층 크로마토그래피 판에서 특정 지질 스팟을 분리하고 에스테르 교환 반응을 통해 지방산 메틸 에스테르로 전환합니다. 이 절차의 마지막 단계는 가스-액체 크로마토그래피를 통해 지방산 메틸 에스테르의 조성을 정량화하는 것입니다. 최종적으로 야생형과 변이체에서 각 극성 지질의 몰 비율과 지방산 프로파일을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Christophe Benning입니다. 많은 분께서 극성 지질의 정량 분석 방법에 대해 문의해 주셨습니다. 저희는 모델 식물인 Arabidopsis thaliana 또는 RG kilometer motors의 돌연변이 대규모 스크리닝 과정에서 유용하게 활용한 매우 간단하고 강력한 방법을 사용하고 있습니다.질량 분석 기반의 지질 프로파일링과 같은 다른 우수한 방법들은 고가의 장비와 많은 경험 및 훈련을 필요로 합니다. 본 연구에서는 변이주 분리 후 단순 박층 크로마토그래피와 지방산 메틸 에스테르 정량을 결합한 2단계 절차를 사용합니다. 일반적으로는 더 정밀한 정량 분석이 요구됩니다.이는 박층 크로마토그래피(thin layer plate)에서 막 지질을 분리하고 지방산 메틸 에스테르를 준비한 후, 이를 액체 가스 크로마토그래피로 정량하여 수행합니다. 이 방법은 재현성이 매우 높으며, 결과가 더 복잡한 질량 분석 기반 기술들과 비교 가능하여 본 절차의 유효성을 입증합니다. 제 연구실의 대학원생인 Zen Wang이 시연하겠습니다. 한천 고체 배지 또는 토양에서 재배한 4주 된 Arabidopsis 잎 30 mg을 수확하여 지질 추출을 시작하십시오. 수확한 잎을 1.5 mL 프로필렌 반응 튜브에 옮깁니다.메탄올, 클로로포름 및 포름산으로 구성된 추출 용매 300 µL를 각 시료에 첨가하십시오. 시료를 5분 동안 격렬하게 흔들어 섞어줍니다. 다음으로, 0.2 M 인산 150 µL와 1 M 염화칼륨을 첨가하고 볼텍싱하십시오.샘플을 13,000 ×g에서 1분 동안 짧게 원심 분리합니다. 하층의 클로로포름 상에 용해된 지질을 실온에서 박층 크로마토그래피 플레이트에 점적합니다. TLC 플레이트를 준비하기 위해 로딩 스트립이 있는 20 by 20 cm 실리카겔 코팅 TLC 플레이트를 0.15 M 황산암모늄 용액에 담급니다.30초 동안 담근 후, 덮개가 있는 용기에서 최소 이틀 동안 플레이트를 건조시킵니다. 활성화 과정 중에 암모늄이 승화되면서 황산이 남게 되며, 이는 인산염과 글리세롤을 양성자화하여 다른 글리세롤 지질로부터 분리하는 데 필요한 역할을 합니다. 실험 당일, TLC 플레이트를 120 °C의 오븐에서 2시간 30분 동안 가열하여 활성화합니다.활성화된 플레이트를 실온으로 식힌 후, 연필을 사용하여 크로마토그램의 원점에 직선을 긋습니다. 흄 후드 내에서 질소 탱크의 레귤레이터에 연결된 티곤 튜브를 통해 질소 가스 흐름을 제공하며, 200 µL 노란색 플라스틱 팁이 장착된 20 µL 피펫을 사용하여 하층의 클로로포름 상에서 지질 추출물 20 µL를 3회에 걸쳐 천천히 플레이트에 분주합니다. 이때 질소 가스를 천천히 흘려줍니다. 반점의 지름을 1 cm 미만으로 유지하기 위해 20 µL 피펫을 사용합니다.지질 반점이 완전히 마르는 동안 각 플레이트에는 최대 10개의 시료를 담을 수 있습니다. 흄 후드 내에서 아세톤, 톨루엔, 물로 구성된 전개 용매를 준비합니다. 밀폐 가능한 TLC 전개 챔버에 전개 용매 80 milliliters를 붓고 플레이트를 탱크 안에 넣습니다.시료 끝부분이 아래를 향하도록 하여 탱크를 밀봉합니다. 클램프를 사용하면 용매가 플레이트를 타고 올라가면서 지질이 분리됩니다. 전개 시간은 실온에서 약 50분입니다.용매 전선이 플레이트 상단에서 1cm 지점에 도달하면, 탱크에서 플레이트를 조심스럽게 꺼내 흄 후드 내에서 10분 동안 완전히 건조시킵니다. TLC로 분리된 지질은 정량 분석을 위해 요오드로 짧게 가역 염색하거나, 황산 또는 alpha natal로 불가역 염색할 수 있습니다. 불가역 염색을 하려면 황산 탄화법을 통해 플레이트를 염색하십시오.흄 후드 내에서 유리 스프레이 병에 담긴 50% 황산 수용액을 플레이트에 분무한 후, 120 °C에서 15분 동안 가열하십시오. 반대로, 당지질의 alpha natal 염색을 수행할 때는 10% v/v 황산과 80% v/v 에탄올 혼합액에 2.4% w/v alpha natal을 포함한 용액을 플레이트에 분무하십시오. 당지질 반점이 분홍색 또는 보라색으로 염색될 때까지 플레이트를 120 °C에서 3~5분 동안 가열하십시오.요오드 염색을 수행합니다. 흄 후드 내에서, 탱크 바닥의 트레이에 요오드 결정을 넣은 밀폐된 LC 탱크를 준비하여 탱크 내부 분위기가 요오드 증기로 포화되도록 합니다. TLC 플레이트를 탱크에 넣어 지질이 보일 때까지 요오드에 노출시킵니다. 요오드가 공유 결합할 수 있으므로 너무 오랫동안 노출시키지 마십시오.다불포화 지방산을 변형합니다. 면도날을 사용하여 TLC 플레이트에서 확인된 지질 반점 주변의 실리카를 제거하고, 지질이 포함된 실리카를 긁어냅니다. 깔때기를 사용하여 실리카 분말을 테플론 라이닝 스크루 캡이 있는 유리 튜브로 옮깁니다.유리 피펫을 사용하여 각 시료에 무수 메탄올에 용해된 1M 염산을 1 mL씩 첨가합니다. 그런 다음 200 µL 옐로우 플라스틱 팁이 장착된 200 µL 피펫을 사용하여 각 시료에 내부 표준물질로서 50 µg/mL 펜타데칸산(pentadecanoic acid) 100 µL를 첨가합니다. 또한 대조군으로 염산 메탄올에 펜타데칸산만 포함된 튜브를 준비합니다.테플론 라이너 캡을 사용하여 유리관을 단단히 닫습니다. 유리관을 80 °C 항온수조에서 25분 동안 배양합니다. 관이 식은 후에도 용매가 증발하지 않도록 유리관이 밀봉되어야 합니다.0.9% sodium chloride 1 mL를 가한 다음 hexane 1 mL를 첨가하고, 격렬하게 vortexing한 후 샘플을 1000 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 흄 후드 내에서 pasta peppe를 사용하여 샘플의 상층부인 hexane 층을 제거하고 이를 새로운 13 × 100 mm 유리 튜브에 옮깁니다. 질소 기류를 천천히 흘려 hexane을 증발시키되 완전히 건조하지 말고, 생성된 fatty acid methyl ester를 60 µL의 hexane에 용해합니다. 샘플을 오토샘플러 바이알로 옮긴 후 캡을 단단히 닫습니다.시료는 단기 보관 시 4°C에서, GLC를 시작하기 전 며칠 동안은 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 헬륨, 수소 및 공기 실린더가 충분히 채워져 있는지 확인하십시오. 지방산 메틸 에스테르 분리를 위해 용매 저장조에 헥산이 충분히 채워져 있어야 하며 폐액 컨테이너는 비어 있어야 합니다. 기기에 DB 23 컬럼을 장착하십시오.바이알을 오토샘플러에 넣습니다. 시스템 컴퓨터에서 GLC용 ChemStation 소프트웨어를 실행합니다. 입구 온도를 250 °C로 설정하고, 헬륨 유량을 48.6 mL/min, 압력을 21.93 PSI로 설정합니다.분할비는 30:1입니다. 오븐 온도는 처음에 140 °C로 2분 동안 설정하고, 분당 25 °C의 속도로 160 °C까지 올립니다. 그 후 온도가 160 °C에서 250 °C까지 분당 8 °C의 속도로 상승하도록 설정하고, 250 °C에서 4분 동안 유지한 다음, 분당 38 °C의 속도로 140 °C까지 낮춥니다.이 온도 프로파일을 사용하면 1회 분석에 약 21분이 소요됩니다. 불꽃 이온화 검출기의 온도는 270 °C이며, 수소 유량은 30 mL/min입니다. 공기 유량은 400 mL/min, 헬륨 유량은 30 mL/min으로 설정합니다.분석 시퀀스 표에 바이알 수와 시료 이름을 입력하십시오. 10 µL 인젝터가 바이알당 2 µL의 시료를 주입하도록 설정하십시오. 기기가 준비되면 분석 시퀀스를 시작하십시오.4주 된 Arabidopsis 유묘에서 TLC로 분리한 지질의 염색 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 황산으로 염색된 지질은 탄화되어 갈색 반점으로 나타납니다. M-G-D-G-D-G-D-G 및 SQ dg와 같은 당지질을 염색하는 데는 Alpha natal이 선호됩니다.alpha natal로 염색된 당지질은 분홍색 또는 보라색을 띠는 반면, 다른 극성 지질은 노란색으로 염색됩니다. 요오드 염색은 가역적이며, 지질에 노란색을 부여하지만 요오드가 증발함에 따라 짧은 시간 내에 사라집니다. 요약하면, 요오드로 염색된 지질도 GLC 분석이 가능하지만, 성공적으로 수행된다면 지질의 분해를 줄이기 위해 염색되지 않은 지질을 사용하는 것이 더 바람직합니다.GLC를 통해 서로 다른 지방산 메틸 에스테르를 나타내는 독특한 신호들이 관찰될 것이며, 탄소 사슬이 더 짧고 이중 결합이 더 적은 지방산 메틸 에스테르일수록 머무름 시간이 더 짧습니다. DB 23 컬럼을 사용하십시오. 지방산 메틸 에스테르 프로파일링은 지질 조성이 변화된 돌연변이체를 식별하는 민감한 도구입니다.야생형과 비교하여 TGD 4-1 돌연변이체에서는 MGDG 18 세 지방산 몰비가 감소하였습니다. 이는 특정 지질 클래스의 지방산 메틸 에스테르 몰수를 전체 지방산 메틸 에스테르 몰수로 나누어 계산한 결과입니다. 모든 지질 클래스에 대해 각 지질의 몰비를 계산하였으며, 이를 통해 야생형과 돌연변이체 양쪽의 지질 클래스별 몰비를 비교할 수 있습니다. TGD 4-1 돌연변이체에서 MGDG와 PG의 상대적 양은 증가한 반면, DGDG와 NPE의 양은 감소했음이 분명히 나타납니다. 박층 크로마토그래피를 통해 많은 샘플을 병렬로 검사할 수 있으며, 지질 프로필의 주요 차이점을 시각적으로 확인할 수 있습니다.또한, TLC를 살펴보면 기본적으로 지질 합성에 필요한 많은 효소와 유전자, 그리고 그에 따른 지질 프로파일을 조사하는 것입니다. 이 영상을 시청하신 후, TOC와 GOC를 통해 극성 지질의 조성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물 표피 물 절약의 기본 역할을뿐만 아니라, 병원성 미생물의 항목에 대한 중요한 장애가 식물에 밀랍 외부 덮개입니다. 이 비디오에서는, 우리는 순방향 및 역방향 유전학 방법으로 식별 식물 표피의 돌연변이의 분석을 보여줍니다.

식물 표피의 생합성을 탐구 Arabidopsis eceriferum 돌연변이의 이용

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

포유류의 외피는 개별 종의 화학 성분 특성을 제공 할 수있는 용매 추출 지질이 포함되어 있습니다. 이 논문은 박막 크로마토 그래피를 사용하여 외피 조직으로부터 격리 광범위한 지질 클래스 분리 및 매트릭스 - 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분광 분석에 의해 triacylglyceride 프로파일을 결정하기위한 통상적 인 방법을 제시한다.

제조 박층 크로마토 그래피 및 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 박쥐 외피 지질의 Triacylglyceride 내용을 프로파일 링

체관부 수액의 조성뿐만 아니라 로딩 및 장거리 전송 메커니즘의 지식은 식물의 개발과 스트레스 / 병원균 응답 및 전송 동화의 장거리 신호의 이해를 위해 필수적이다. 이 원고는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 체관의 삼출물의 컬렉션을 설명합니다.

의 수집과 분석<em&gt; 애기 장대</em&gt; 사부는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 삼출물

지질 폴리에스터는 두 개의 세포벽 변형, 즉 식물 큐티클과 수베린 함유 확산 장벽의 구조적 구성 요소를 구성합니다. 이 비디오에서는 탈지된 잎 전체에서 큐틴을 탈중합하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 큐틴 또는 수베린 생합성에서 손상된 돌연변이를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

많은 예측된 (포스포) 리파제는 기질 특이성 및 생리학적 기능과 관련하여 제대로 특성화되지 않았습니다. 여기에서 우리는 효소 활성을 최적화하고, 천연 기질을 검색하고, 이러한 효소에 대한 생리학적 기능을 제안하는 프로토콜을 제공합니다.

리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의

하나의 샘플을 사용하여 생물학적 조직에서 지질, 대사 산물 및 단백질을 포괄적으로 추출하기위한 프로토콜이 제시됩니다.

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략

여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

학습하세요 Arabidopsis thaliana의 극성 지질 프로파일링 방법을 TLC와 GLC를 결합하여 분석하는 기술입니다. 이 단순하고 견고한 방법은 대규모 돌연변이체 선별에 효율적이며 식물 지질 대사 연구에 유용합니다.

씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

더 많은 동영상 탐색