Methicillin 내성 황색 포도상 구균 아리 어스의 피하 감염 (MRSA)

다음 실험의 전반적인 목표는 메티실린 내성 황색포도상구균(MA)의 생존 및 전파뿐만 아니라 감염 부위의 케모카인 및 사이토카인 수치를 조사하는 것입니다. 이것은 관찰의 명확한 영역을 허용하기 위해 쥐의 등에서 털을 제거함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로.

현탁액의 MRSA는 감염 후 3일 후에 마우스에 피하로 투여되며, 감염 병리학 및 박테리아 수는 한천 플레이트의 조직 균질체에서 집락 형성 단위의 수를 결정하여 평가할 수 있습니다. 안녕하세요, 어떻게 지내세요? 제 이름은 De Lordon입니다.

저는 포스트 리서처입니다. 안녕하세요, 제 이름은 마리엘 산체스입니다. 저는 박사 과정 학생이고 Andrea Huda입니다.

저는 Cedar-Sinai Medical Center의 소아과 부서에 있는 George Lee의 연구실에 소속되어 있습니다. 이 방법은 근염, 다발성 근염 및 괴사성 근막염을 포함한 중증 감염의 모델링과 같은 의료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 심각한 응급 감염에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 A군 연쇄상구균 및 기타 유기체와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

또한 근염과 다발성 근염을 일으키는 다른 유기체의 기능과 발병 기전을 연구할 수 있습니다. 일반적으로 이 절차를 처음 접하는 개인은 코커스 지역 글로벌 규제 기관의 직원 중 한 명이 매우 가변적이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 주의를 기울이지 않으면 수집된 데이터에 상당한 변동이 있을 수 있으며, 이로 인해 데이터를 해석하는 데 날짜가 달라질 수 있습니다.

시작하자. BSL 2 시설에서 TSA 베이스에 양 혈액 한천 플레이트를 준비하고 냉동 블록을 사용하여 멸균 루프를 준비합니다. 재고 Mercer 배양물을 섭씨 영하 80도 보관소에서 옮깁니다.

그런 다음 멸균 루프를 사용하여 스톡 배양물에서 작은 얼음 조각을 플레이트로 부수십시오. Mercer 스톡 배양의 작은 칩을 구입한 후에는 즉시 스톡 배양액을 냉동고로 다시 옮겨 동결 및 해동을 반복하면 스톡 배양이 손상될 수 있으므로 해동을 피하십시오. 루프를 사용하여 한천을 줄무늬로 만들어 개별 Mercer 군체의 성장을 촉진합니다.

CO2 보충제 없이 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양하십시오. 다음 날. 새 시트 혈액 난자, TSA 플레이트, 3ml의 THB가 든 15ml 스냅 캡 튜브를 준비하고 라벨을 붙입니다.

하룻밤 사이에 배양된 M SSA 플레이트를 회수하고 군집의 용혈성 표현형을 검사합니다. 멸균 루프를 사용하여 이전 실험 콜로니와 일치하는 표현형을 가진 콜로니를 선택합니다. 동일한 루프 줄무늬를 사용하여 선택한 콜로니에 THB를 접종합니다.

플레이트는 THB 용액을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고 분당 220회 회전으로 진탕합니다. 이 박테리아는 이후 단계에서 마우스의 피하 감염을 위한 배양액을 접종하는 데 사용됩니다. 혈액 한천 플레이트도 인큐베이터에 넣습니다.

플레이트는 다음 날 아침에 THB 용액에 있는 박테리아의 용혈 표현형이 원래 선택한 집락의 형과 일치하는지 확인하는 데 사용됩니다. 용혈 표현형이 원래 클론과 일치하지 않으면 실험을 시작하지 마십시오. 마우스를 플랫폼으로 옮기고 등의 털을 면도합니다.

동물이 지나치게 공격적인 경우 불소로 진정제가 필요할 수 있습니다. 면도 부위에 NA와 같은 약 5입방 밀리미터의 제모 크림을 바릅니다. NA는 지역 약국에서 구입할 수 있습니다.

베이비 오일이 함유된 제모 크림은 베이비 오일이 없는 제품은 생쥐에게 너무 자극적이므로 반드시 구입하세요. 헤어 리무버 크림이 인큐베이팅하는 동안 크림이 약 1분 동안 피부 표면에서 배양하도록 하고 1분 후에 두 번 증류수로 종이 타월 몇 장을 적십니다. 젖은 종이 타월을 사용하여 면도한 부분을 깨끗이 닦습니다.

제모 크림이 피부에 없는지 확인하십시오 : 박테리아 인큐베이터에서 섭씨 37도의 50ml 나사 캡 튜브에 10ml의 THB를 4-10시간 동안 예열합니다. 20마이크로리터의 하룻밤 박테리아 배양을 예열 THB로 옮깁니다. 이렇게 하면 하룻밤 용병이 희석됩니다.

1에서 500까지의 서스펜션. 튜브를 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에 넣고 분당 220회 회전하며 배양 후 약 2시간 반에서 3시간 동안 놓습니다. 더 많은 THB를 사용하여 박테리아 현탁액을 1:10으로 더 희석하고 분광 광도계로 현탁액을 측정합니다.

514나노미터의 흡수율을 제공합니다. 1에서 10 희석 된 서스펜션이 0.25에 도달 할 때까지 분당 220 회전으로 흔들면서 섭씨 37도에서 서스펜션을 계속 배양합니다. M er 원심 분리기를 수집하려면 섭씨 4도에서 10 분 동안 3, 225 배 중력에서 50 밀리리터 튜브를 사용하여 supinate Resus를 버리십시오.

10ml의 DPBS에 박테리아 팔레트를 현탁시키고 이 심각한 감염 모델에 대해 원심분리 단계를 반복하여 박테리아를 다시 세척합니다. 박테리아 펠릿을 약 1ml의 DPBS에 다시 현탁시켜 밀리리터당 약 10에서 10 콜로니 형성 단위를 생성합니다. 양 혈액 A-R-T-S-A 플레이트를 조립하고 박테리아 10을 DPBS 플레이트의 1-10에서 8 배로 연속적으로 희석합니다.

연속적으로 희석된 박테리아 현탁액을 시트 혈액 한천 플레이트에 10마이크로리터 방울 3회. 밤새 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 플레이트를 16-18 시간 동안 배양 한 후 inocular의 용혈 표현형을 관찰하고 기록합니다.

플레이트에서 식민지 형성 단위를 세십시오. 감염 inocular는 집락 형성 단위를 기준으로 계산됩니다. 플레이트에 번호를 매깁니다.

앞서 준비한 DPBS에서 100마이크로리터의 박테리아 현탁액이 있는 주사기를 준비합니다. 주사하기 전에 쥐는 호흡 속도가 초당 한 번 정도가 되도록 진정제를 투여해야 합니다. 데모를 위해 안락사된 쥐가 이 비디오에 나와 있습니다.

주입 후 M ser을 한쪽 측면에 주입합니다. 마우스를 케이지로 다시 옮깁니다. 주사 후 3-5시간 동안 동물을 관찰하여 쥐가 살아 있는지 확인한 후 동물실로 다시 옮기십시오.

동물을 제물로 바친 후 매일 동물의 등에 있는 병변을 모니터링하십시오. 피부에 있는 병변의 크기와 상태를 측정하고 기록합니다. 피부와 근육 병변 부위는 모두 병변의 길이와 너비를 밀리미터 단위로 곱하여 정량화합니다.

불규칙한 모양의 병변은 더 작은 대칭 조각으로 분해해야 하며 각 조각은 동일한 방법으로 측정해야 합니다. 조직 채취를 위해 100마이크로리터의 DPBS가 있는 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 준비합니다. 멸균 면도날로 피부를 긁고 멸균 가위로 병변을 절제합니다.

병변을 절제할 때는 해당 부위를 둘러싼 약 2-5mm의 건강한 피부도 절제해야 합니다. 근육 병변을 분석하기 위해 조직 수집 튜브에 병변을 넣습니다. 피부를 조심스럽게 벗겨내어 크기를 측정하고 근육 조직의 병변 상태를 기록합니다.

비장과 신장을 수집합니다. 이러한 조직을 개별 수집 튜브에 넣습니다. 1ml 주사기로 약 30초 동안 교반하여 조직을 균질화합니다.

각 튜브에 900마이크로리터의 DPBS를 추가합니다. THA 플레이트를 조립하여 균질화된 조직 샘플을 5분 동안 와류로 만듭니다. 샘플을 연속적으로 희석합니다.

서스펜션은 1에서 10, 6 폴드로 경향이 있습니다. 96년에, 웰 플레이트는 10마이크로리터의 연속으로 희석된 각 현탁액을 플레이트에 분배합니다. 섭씨 37도의 박테리아 배양기에서 플레이트를 밤새 배양합니다.

다음날 아침, 플레이트에서 집락 형성 단위를 세고 희석 계수를 기반으로 집락 형성 단위의 수를 계산합니다. 감염이 올바르게 이루어지면 피하 주사 직후 피부 표면에 기포가 관찰됩니다. 기포가 관찰되지 않으면 주사가 너무 깊어 감염 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

병변 크기와 박테리아 생존율은 MSA 감염 후 다양한 시점에서 평가할 수 있습니다. 다음 피부 병변은 감염 후 3일째에 검사되었으며 CD에 병변이 있는 예이며, 한 측면에서 10배로 7개의 집락 형성 단위에 감염된 마우스 1마리입니다. 근육 병변은 일반적으로 피부 병변 아래 조직에서 발견됩니다.

다음은 이전에 표시된 피부 병변 사진에 대한 일치하는 근육 표면 병변의 예입니다. 이들은 7개의 집락 형성 단위에 10배의 10에 감염된 쥐에서 감염 후 3일째에 관찰되는 근육 병변입니다. 병변 부위는 밀리미터 단위로 측정된 병변의 길이 x 너비로 결정되며 피부 조직 손상을 평가하기 위해 측정될 수 있습니다.

감염 부위에 국한된 박테리아의 집락 형성 단위 수는 절제 병변에서 정량화할 수 있습니다. 군집 형성 단위 수는 독성 인자가 MSA에 생존 이점을 제공하는지 여부를 나타낼 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차를 따르는 바늘과 고병원성 미생물의 사용으로 인한 표준 안전 예방 조치를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

마지막으로 농양 모델로서 우리는 1, 000 배 더 낮은 안구를 사용하여 지속적인 RSA 감염을 촉진하는 S 요인이 무엇인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. Mars A로 채워진 주사기로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 주사기를 날카로운 곳에 직접 버리는 등의 예방 조치는 실수로 바늘에 찔리지 않도록 하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오. 또한 이 실험에서는 작업 영역의 적절한 소독을 보장하기 위해 표준 BS O2 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사합니다. 안녕, 안녕히 계세요.