Methicillin 내성 황색 포도상 구균 아리 어스의 피하 감염 (MRSA)

다음 실험의 전반적인 목표는 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA)의 생존 및 확산과 감염 부위의 케모카인 및 사이토카인 수치를 조사하는 것입니다. 이를 위해 마우스 등의 털을 제거하여 관찰 영역을 확보합니다. 두 번째 단계로,

현탁액 상태의 MRSA를 감염 3일 후 생쥐의 피하에 투여하며, 조직 균질액을 한천 배지에 도말하여 형성된 콜로니 형성 단위 수를 측정함으로써 감염 병리와 박테리아 수를 평가할 수 있습니다. 안녕하세요, 어떻게 지내시나요? 제 이름은 De Lordon입니다.

저는 박사후 연구원입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Mariel Sanchez입니다. 저는 박사 과정 학생입니다. 그리고 저는 Andrea Huda입니다.

저는 Cedar-Sinai Medical Center 소아과 George Lee 연구실의 연구원입니다. 이 방법은 근염, 다발성 근염 및 괴사성 근막염을 포함한 중증 감염 모델링과 같이 의료 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 방법은 중증 응급 감염에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, A군 연쇄상구균 및 기타 미생물과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

또한, 근염 및 다발성 근염을 유발하는 다른 유기체의 기능과 병원성을 연구할 수 있습니다. 일반적으로 이 절차에 익숙하지 않은 개인은 caucus areas global regulator의 구성원 중 하나가 매우 가변적이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 주의를 기울이지 않으면 수집된 데이터에 상당한 변동이 생겨 데이터 해석에 어려움이 있을 수 있습니다.

시작하겠습니다. BSL 2 시설에서 TSA 베이스의 양 혈액 한천 배지와 동결 블록을 이용한 멸균 루프를 준비하십시오. -80 °C 보관함에서 Mercer 균주 스톡을 꺼내십시오.

그런 다음 멸균 루프를 사용하여 스톡 배양액에서 작은 얼음 조각을 떼어 플레이트에 옮깁니다. Mercer 스톡 배양액 조각을 확보한 후에는 즉시 스톡 배양액을 냉동고로 다시 옮겨 해동을 방지하십시오. 반복적인 동결 및 해동은 스톡 배양액을 손상시킬 수 있기 때문입니다. 루프를 사용하여 한천 배지를 획선 도말함으로써 개별 Mercer 콜로니의 성장을 유도합니다.

플레이트를 CO2 보충 없이 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 새로운 sheep blood agar plate와 TSA plate를 준비하고 라벨을 붙이며, 15 mL snap cap tube에 3 mL의 THB를 준비합니다.

밤새 배양한 M SSA 플레이트를 회수하여 콜로니의 용혈 표현형을 확인합니다. 멸균 루프를 사용하여 이전 실험 콜로니와 일치하는 표현형을 가진 콜로니를 선택합니다. 동일한 루프 도말법을 사용하여 선택한 콜로니를 THB에 접종합니다.

THB 용액이 담긴 플레이트를 37°C에서 220 rpm으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 이 박테리아는 이후 단계에서 마우스의 피하 감염 배양 접종에 사용됩니다. 혈액 우뭇가사리 배지 플레이트 또한 인큐베이터에 넣습니다.

다음 날 아침, THB 용액 내 박테리아의 용혈 표현형이 처음에 선택한 콜로니의 표현형과 일치하는지 확인하기 위해 플레이트를 사용합니다. 용혈 표현형이 원래의 클론과 일치하지 않는 경우, 실험을 시작하지 마십시오. 마우스를 플랫폼으로 옮기고 등 부분의 털을 깎습니다.

동물이 지나치게 공격적일 경우, isof fluorine을 이용한 진정이 필요할 수 있습니다. 제모된 부위에 NA와 같은 제모 크림을 약 5 cubic millimeters 도포하십시오. NA는 지역 약국에서 구매할 수 있습니다.

베이비 오일이 포함되지 않은 제품은 마우스에게 너무 강한 자극을 줄 수 있으므로, 반드시 베이비 오일이 함유된 제모 크림을 구매하십시오. 크림을 피부 표면에 도포하고 약 1분 동안 방치합니다. 제모 크림이 작용하는 동안 몇 장의 페이퍼 타월을 2중 증류수로 적셔 둡니다. 1분 후, 적신 페이퍼 타월을 사용하여 제모 부위를 깨끗이 닦아냅니다.

피부에 제모 크림이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 50 mL 스크류 캡 튜브에 10 mL의 THB를 넣고 세균 배양기에서 37 °C로 4~10시간 동안 예열하십시오. 하룻밤 동안 배양한 세균 배양액 20 µL를 예열된 THB로 옮깁니다. 이렇게 하면 하룻밤 동안 배양된 merc가 희석됩니다.

1:500 비율로 현탁액을 조제합니다. 배양 기간 후, 튜브를 37 °C, 220 rpm의 진탕 배양기에 넣고 약 2.5~3시간 동안 배양합니다. THB를 더 사용하여 세균 현탁액을 1:10으로 추가 희석하고 분광광도계로 현탁액을 측정합니다.

514 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 1:10으로 희석한 현탁액의 흡광도가 0.25에 도달할 때까지 37 °C에서 분당 220회 회전으로 흔들어주며 계속 배양합니다. M er를 수집하기 위해, 50 milliliter 튜브를 4 °C에서 3,225 ×g로 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 재현탁합니다.

이 중증 감염 모델을 위해 10 milliliters의 DPBS에 세균 펠렛을 현탁하고, 원심분리 단계를 반복하여 세균을 다시 세척합니다. 세균 펠렛을 약 1 milliliter의 DPBS에 재현탁하여 약 1 × 10¹⁰ colony forming units per milliliter가 되도록 합니다. 양 혈액 A-R-T-S-A 플레이트를 준비하고, DPBS 플레이트에서 세균을 10¹에서 10⁸까지 순차적으로 희석합니다.

계열 희석된 세균 현탁액 10 µL를 혈액 한천 배지 플레이트에 세 번 반복하여 점적합니다. 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 16~18시간 동안 배양한 후, 접종균의 용혈 표현형을 관찰하고 기록합니다.

플레이트의 콜로니 형성 단위(colony forming units)를 계수합니다. 감염 접종량은 플레이트상의 콜로니 형성 단위 수를 기반으로 계산됩니다.

이전에 준비한 DPBS 내 박테리아 현탁액 100 µL를 주사기에 채웁니다. 주사 전, 마우스의 호흡수가 초당 약 1회 정도가 되도록 진정시켜야 합니다. 시연을 위해 본 영상에서는 안락사시킨 마우스가 사용되었습니다.

주사 후 한쪽 옆구리에 M ser를 주입하십시오. 마우스를 다시 케이지로 옮기십시오. 동물실로 다시 옮기기 전 마우스의 생존 여부를 확인하기 위해 주사 후 3~5시간 동안 동물을 관찰하십시오.

동물을 희생시킨 후 매일 동물의 등 부위에 나타난 병변을 관찰하십시오. 피부 병변의 크기와 상태를 측정하고 기록하십시오. 피부와 근육 병변 부위는 모두 병변의 길이와 너비를 밀리미터(mm) 단위로 곱하여 정량화합니다.

불규칙한 모양의 병변은 더 작은 대칭 조각으로 나누어야 하며, 각 조각을 동일한 방법으로 측정해야 합니다. 조직 수집을 위해 100 µL의 DPBS가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 준비합니다. 멸균 면도날로 피부에 절개선을 내고 멸균 가위로 병변을 절제합니다.

병변을 절제할 때, 해당 부위를 둘러싼 약 2~5mm의 건강한 피부가 함께 절제되도록 합니다. 근육 병변 분석을 위해 병변을 조직 수집 튜브에 넣습니다. 피부를 조심스럽게 벗겨내어 근육 조직에 나타난 병변의 크기를 측정하고 상태를 기록합니다.

비장과 신장을 채취합니다. 이 조직들을 각각 별도의 채취 튜브에 넣습니다. 1 mL 시린지로 약 30초 동안 흔들어 조직을 균질화합니다.

각 튜브에 DPBS 900 µL를 추가합니다. THA 플레이트를 준비하고, 균질화된 조직 샘플을 5분 동안 볼텍싱합니다. 샘플을 연속 희석합니다.

현탁액을 10⁶배까지 단계 희석합니다. 96-웰 플레이트에 각 단계 희석된 현탁액 10 µL를 분주합니다. 플레이트를 37 °C 세균 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 플레이트의 콜로니 형성 단위를 측정하고 희석 배수를 기반으로 콜로니 형성 단위 수를 계산합니다. 감염 과정이 올바르게 수행되었다면, 피하 주사 직후 피부 표면에 팽진(bleb)이 관찰될 것입니다. 팽진이 관찰되지 않는다면 주사 깊이가 너무 깊은 것일 수 있으며, 이는 감염 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

MSA 감염 후 다양한 시점에서 병변 크기와 세균 생존율을 평가할 수 있습니다. 다음은 감염 3일 차에 관찰한 피부 병변으로, 한쪽 옆구리에 1×10⁷ CFU를 접종한 CD-1 마우스의 병변 예시입니다. 근육 병변은 일반적으로 피부 병변 아래 조직에서 발견됩니다.

다음은 앞서 보여준 피부 병변 사진과 일치하는 근육 표면 병변의 예시입니다. 이는 1 × 10⁷ CFU를 접종한 감염 3일 차 마우스에서 관찰된 근육 병변입니다. 병변 부위는 밀리미터(mm) 단위로 측정한 병변의 길이 곱하기 너비로 결정하며, 이를 통해 피부의 조직 손상 정도를 평가할 수 있습니다.

감염 부위에 국소화된 박테리아의 콜로니 형성 단위(colony forming unit) 수는 절제된 병변에서 정량화할 수 있습니다. 콜로니 형성 단위 수는 독성 인자가 MSA에 생존 이점을 제공하는지 여부를 나타낼 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 바늘과 고병원성 미생물을 사용하므로 표준 안전 예방 조치를 준수하는 것이 중요합니다.

마지막으로, 농양 모델로서 우리가 사용한 것보다 1,000배 낮은 접종량을 사용하여 지속적인 RSA 감염을 촉진하는 S 인자는 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 구할 수 있습니다. Mars A가 충전된 주사기를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 주사기를 즉시 전용 손상성 폐기물 용기에 폐기하는 등의 예방 조치를 통해 바늘에 의한 우발적인 찔림 사고를 방지하는 것이 중요합니다. 또한, 본 실험에서는 작업 구역의 적절한 소독을 보장하기 위해 표준 BSL-2 프로토콜을 준수하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 안녕하세요. 안녕히 가세요.