Name: 열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 열 충격 방법을 사용하여 E. coli에 플라스미드 DNA를 도입하는 세포 변환 기술입니다. 이 방법은 분자생물학 및 유전공학 연구에 필수적인 신뢰할 수 있는 유전자 변형 기법을 제공합니다.

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열 충격 방법을 사용 e. 대장균에 플라스미드 dna의 변화

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

열 충격 방법을 사용하여 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화 분자 생물학의 기본 기술입니다. 그것은 박테리아에 외국 플라스미드 또는 결합 제품을 삽입 구성되어 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 Genlantis에서 상용 화학적으로 유능한 박테리아를 사용하여 변화의 전통적인 방법을 설명합니다. 얼음에 짧은 부화 후, 화학적 능력 박테리아와 DNA의 혼합물은 45 초 동안 42 ° C에 배치됩니다 (열충격) 후 얼음에 다시 배치. SOC 미디어가 추가되고 변형 세포 ° C 30 분 교반과 함께 37 incubated 수 있습니다. 관계없이 변환 효율의 식민지를 고립을 보장하기 위해서, 변형 박테리아의 두 수량은 도금 있습니다. 이것은 전통적인 프로토콜은 대부분의 상용 유능한 박테리아를 변환하기 위해 성공적으로 사용될 수 있습니다. Genlantis에서 turbocells이 설명서에 설명된 소설 3 분 변환 프로토콜에도 사용할 수 있습니다.

열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화

열충격법(heat shock method)을 이용한 E. coli 내 플라스미드 DNA 형질전환은 분자생물학의 기초 기술입니다. 이는 외래 ...

안녕하세요, 저는 Alex Hoge입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과의 gym Hall 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 전기 천공법(electroporation)을 이용해 전기적 컴피턴트(electrically competent) E. coli를 형질전환하는 방법을 보여드리겠습니다.오늘은 제브라피쉬의 전체 마운트 면역형광염색(whole mount immunization) 실험을 위한 프로브 제작을 위해, 라이게이션 산물을 이용해 대장균(coli)을 형질전환시키는 기술을 사용하겠습니다. 이제 형질전환을 시작하겠습니다. 우선 항온수조(water bath) 또는 드라이 배스(dry bath)를 42 °C로 설정해야 합니다.메인 배양액에서 막 꺼낸 박테리아를 얼음 위에 두어야 합니다. 오늘은 시판되는 전기 천공 능력을 가진 컴피턴스 셀과 얼음 위에 둔 DNA를 사용합니다. 또한 실온 또는 37°C로 유지한 SOC 배지가 든 튜브와 항생제가 포함된 LB 배지 플레이트가 필요합니다.이제 박테리아에 DNA를 첨가하겠습니다. 박테리아의 오염을 방지하기 위해 화염 옆에서 작업하겠습니다. 박테리아가 포함된 용액을 첨가합니다.박테리아 50 µL를 넣은 후 즉시 다시 얼음에 넣습니다. 박테리아와 DNA가 섞이도록 가볍게 튕겨준 다음, 얼음 위에서 최대 15분 동안 둡니다. 이제 15분이 지났으므로, 박테리아를 42 °C에서 45초 동안 처리하는 히트 쇼크(heat shock)를 수행할 준비가 되었습니다. 튜브를 얼음에서 꺼내 즉시 42 °C 설정 장치에 넣고 타이머를 45초로 맞춥니다. 그 다음 매우 빠르게 다시 얼음에 넣어, 42 °C에서 즉시 얼음 위로 옮깁니다.그런 다음 2분 동안 기다립니다. 이제 박테리아에 SOC 배지를 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양하겠습니다. SOC 배지 500 µL를 취해 박테리아에 넣고, 임시로 만든 작은 챔버에 넣습니다.따라서 인큐베이터로 eend 튜브와 임시 챔버를 사용할 경우, eend 튜브를 수평으로 놓아야 더 효율적으로 흔들어 섞을 수 있습니다. 이제 튜브를 셰이커에 넣을 준비가 되었습니다. 그렇기 때문에 37 °C의 소형 챔버에서 30분 동안 보관하는 것입니다.이제 37°C에서의 배양을 마쳤으며, 항생제가 첨가된 lb 배지에 박테리아를 도말하겠습니다. 제 경우에는 chloral을 사용합니다. 각 샘플에서 50 µL를 취하여 플레이트에 접종합니다.남은 500 µL를 소형 원심분리기로 원심 분리하여 박테리아를 침전시킵니다. 원심 분리 후 깨끗한 펠렛(pellet)이 형성되면, SOC 배지를 거의 모두 제거하고 50 µL만 남깁니다. 그런 다음 농축된 박테리아 50 µL를 도말할 수 있습니다. 따라서 약 450 µL를 덜어냅니다.이 정도 양만 남깁니다. 이제 남은 50 µL의 SOC 배지에 펠릿을 현탁하겠습니다. 그 후 이 50 µL를 다른 플레이트에 도말할 수 있습니다.각 팰릿을 저항시킨 후, 이를 퍽펫팅하여 도말합니다. 결과적으로 샘플당 두 개의 플레이트가 준비됩니다. 이제 LB 플레이트에 박테리아를 도말해야 합니다.이제 오토클레이브 멸균된 유리 구슬을 사용할 것입니다. 하지만 파이펫 팁을 스プレ더 모양으로 만들어 사용할 수도 있습니다. 이제 페트리 접시에 유리 구슬 몇 개를 넣겠습니다. 저는 이 방법을 선호합니다.자, 10분에서 15분 정도입니다. 비즈를 추가한 후, 모든 플레이트를 이렇게 쌓아 놓고 가볍게 흔들어 비즈가 박테리아를 플레이트 전체에 고르게 퍼뜨리도록 합니다. 그리고 플레이트가 마를 때까지 옮겨 둡니다.따라서 비즈와 함께 이동할 때 액체가 크게 줄기 모양으로 나타나지 않아야 합니다. 예를 들어, 저 플레이트에서는 비즈가 서로 뭉쳐서 많은 줄기가 보입니다. 이쪽은 젖어 있어서 비즈가 자유롭게 움직이며, 저쪽은 건조한 상태입니다.이제 플레이트가 말랐으므로 비즈를 제거할 수 있습니다. 이와 같이 당겨서 제거하면 비즈를 재활용할 수 있습니다. 이제 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양하며, 이때 플레이트를 뒤집어서 놓습니다. 37°C에서 12시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.보시는 바와 같이, 50 µL를 도말한 플레이트는 나머지를 도말한 플레이트보다 콜로니 수가 더 적습니다. 박테리아를 형질전환할 때 중요한 것은 플레이트에 적절한 양의 콜로니, 즉 적절한 밀도를 확보하는 것입니다. 이 플레이트에는 콜로니가 매우 적지만, 더 많은 콜로니를 원하신다면 플레이트당 약 100개의 콜로니가 형성되어 정확히 적절한 밀도를 보여주는 이 플레이트의 사례를 참고하시기 바랍니다.이 플레이트는 콜로니가 너무 많아 개별 콜로니를 선택할 수 없으므로 좋지 않은 예시입니다. 따라서 각 형질전환 과정을 통해 E. coli를 형질전환하는 방법을 보여드렸습니다. 이 기술에서 매우 중요한 점은 열 충격(shock) 전까지 모든 것을 얼음 위에서 차갑게 유지하는 것입니다.그런 다음 45초 동안 일반 조건으로 진행하고, 42°C에서 더 처리한 후 다시 얼음에 넣습니다. 그리고 나머지 모든 과정은 따뜻한 온도 또는 37°C에서 이루어져야 합니다. 이제 PCR 스크리닝을 통해 콜로니를 선별하겠습니다.또한 중요한 점 중 하나는 두 개의 플레이트를 준비하는 것입니다. 하나는 많은 콜로니가 형성될 것으로 예상되는 플레이트이고, 다른 하나는 콜로니가 적게 형성될 것으로 예상되는 플레이트입니다. 이때 비즈나 파이펫을 사용하여 플레이트를 매우 건조하게 유지하는 것이 중요합니다.시청해주셔서 감사하며, 실험 결과 확인에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 여기서 우리는 플라스미드를 사용 표준 시약에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

출처: Stefan, A., et al., 대장균에서 단백질 공동 발현의 다면적인 이점. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포 준비, 전기천공, 회수 및 형질전환체 선택을 포함하여 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드로 대장균 을 형질전환하는 절차를 보여줍니다.

고전압 전기천공법을 이용한 박테리아의 제조 및 형질전환

이 프로토콜은 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 샤페론 활성을 보여줍니다. 대장균 dnaK756 세포는 기능적으로 손상된 Hsp70을 가지고 있어 열 스트레스에 취약하기 때문에 분석의 모델 역할을 합니다. 기능성 Hsp70의 이종 도입은 세포의 성장 결핍을 구제합니다.

열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

In vivo assembly는 박테리아의 고유 DNA 복구 효소에 의존하여 상동 재조합에 의한 DNA 단편을 조립하는 결찰 독립적 클로닝 방법입니다. 이 프로토콜은 시약이 거의 필요하지 않고 클로닝 효율이 99%에 달하기 때문에 시간과 비용 면에서 모두 효율적입니다.

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이 기사에서는 C41(DE3) 발현 시스템에서 독성 뉴클레아제인 재조합 Nsp15를 과발현한 다음 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 태그가 지정된 단백질을 정제하는 방법론에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 다른 까다로운 독성 단백질에 적용될 수 있습니다.

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Qiagen Miniprep 키트를 사용하여 세균의 플라스미드 식민지에서 DNA를 정화

이 작품은 염색체 수준에서 RNA / DNA 복합체를 형성하고 효모 세포의 게놈 DNA와 RNA의 유전 정보의 전송을 공개하는 방법을 보여줍니다.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.

에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

이 프로토콜은 효율적으로 병렬에서 설명 및 플라스미드 DNA의 정화를위한 비용 효율적인...

Prokaryotic 문화 플라스미드 DNA의 유선형 정화

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

배우세요 열 충격 방법을 사용하여 E. coli에 플라스미드 DNA를 도입하는 세포 변환 기술입니다. 이 방법은 분자생물학 및 유전공학 연구에 필수적인 신뢰할 수 있는 유전자 변형 기법을 제공합니다.

열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화

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