열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화

안녕하세요, 저는 Alex Hoge입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과의 gym Hall 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 전기 천공법(electroporation)을 이용해 전기적 컴피턴트(electrically competent) E. coli를 형질전환하는 방법을 보여드리겠습니다.

오늘은 제브라피쉬의 전체 마운트 면역형광염색(whole mount immunization) 실험을 위한 프로브 제작을 위해, 라이게이션 산물을 이용해 대장균(coli)을 형질전환시키는 기술을 사용하겠습니다. 이제 형질전환을 시작하겠습니다. 우선 항온수조(water bath) 또는 드라이 배스(dry bath)를 42 °C로 설정해야 합니다.

메인 배양액에서 막 꺼낸 박테리아를 얼음 위에 두어야 합니다. 오늘은 시판되는 전기 천공 능력을 가진 컴피턴스 셀과 얼음 위에 둔 DNA를 사용합니다. 또한 실온 또는 37°C로 유지한 SOC 배지가 든 튜브와 항생제가 포함된 LB 배지 플레이트가 필요합니다.

이제 박테리아에 DNA를 첨가하겠습니다. 박테리아의 오염을 방지하기 위해 화염 옆에서 작업하겠습니다. 박테리아가 포함된 용액을 첨가합니다.

박테리아 50 µL를 넣은 후 즉시 다시 얼음에 넣습니다. 박테리아와 DNA가 섞이도록 가볍게 튕겨준 다음, 얼음 위에서 최대 15분 동안 둡니다. 이제 15분이 지났으므로, 박테리아를 42 °C에서 45초 동안 처리하는 히트 쇼크(heat shock)를 수행할 준비가 되었습니다. 튜브를 얼음에서 꺼내 즉시 42 °C 설정 장치에 넣고 타이머를 45초로 맞춥니다. 그 다음 매우 빠르게 다시 얼음에 넣어, 42 °C에서 즉시 얼음 위로 옮깁니다.

그런 다음 2분 동안 기다립니다. 이제 박테리아에 SOC 배지를 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양하겠습니다. SOC 배지 500 µL를 취해 박테리아에 넣고, 임시로 만든 작은 챔버에 넣습니다.

따라서 인큐베이터로 eend 튜브와 임시 챔버를 사용할 경우, eend 튜브를 수평으로 놓아야 더 효율적으로 흔들어 섞을 수 있습니다. 이제 튜브를 셰이커에 넣을 준비가 되었습니다. 그렇기 때문에 37 °C의 소형 챔버에서 30분 동안 보관하는 것입니다.

이제 37°C에서의 배양을 마쳤으며, 항생제가 첨가된 lb 배지에 박테리아를 도말하겠습니다. 제 경우에는 chloral을 사용합니다. 각 샘플에서 50 µL를 취하여 플레이트에 접종합니다.

남은 500 µL를 소형 원심분리기로 원심 분리하여 박테리아를 침전시킵니다. 원심 분리 후 깨끗한 펠렛(pellet)이 형성되면, SOC 배지를 거의 모두 제거하고 50 µL만 남깁니다. 그런 다음 농축된 박테리아 50 µL를 도말할 수 있습니다. 따라서 약 450 µL를 덜어냅니다.

이 정도 양만 남깁니다. 이제 남은 50 µL의 SOC 배지에 펠릿을 현탁하겠습니다. 그 후 이 50 µL를 다른 플레이트에 도말할 수 있습니다.

각 팰릿을 저항시킨 후, 이를 퍽펫팅하여 도말합니다. 결과적으로 샘플당 두 개의 플레이트가 준비됩니다. 이제 LB 플레이트에 박테리아를 도말해야 합니다.

이제 오토클레이브 멸균된 유리 구슬을 사용할 것입니다. 하지만 파이펫 팁을 스プレ더 모양으로 만들어 사용할 수도 있습니다. 이제 페트리 접시에 유리 구슬 몇 개를 넣겠습니다. 저는 이 방법을 선호합니다.

자, 10분에서 15분 정도입니다. 비즈를 추가한 후, 모든 플레이트를 이렇게 쌓아 놓고 가볍게 흔들어 비즈가 박테리아를 플레이트 전체에 고르게 퍼뜨리도록 합니다. 그리고 플레이트가 마를 때까지 옮겨 둡니다.

따라서 비즈와 함께 이동할 때 액체가 크게 줄기 모양으로 나타나지 않아야 합니다. 예를 들어, 저 플레이트에서는 비즈가 서로 뭉쳐서 많은 줄기가 보입니다. 이쪽은 젖어 있어서 비즈가 자유롭게 움직이며, 저쪽은 건조한 상태입니다.

이제 플레이트가 말랐으므로 비즈를 제거할 수 있습니다. 이와 같이 당겨서 제거하면 비즈를 재활용할 수 있습니다. 이제 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양하며, 이때 플레이트를 뒤집어서 놓습니다. 37°C에서 12시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.

보시는 바와 같이, 50 µL를 도말한 플레이트는 나머지를 도말한 플레이트보다 콜로니 수가 더 적습니다. 박테리아를 형질전환할 때 중요한 것은 플레이트에 적절한 양의 콜로니, 즉 적절한 밀도를 확보하는 것입니다. 이 플레이트에는 콜로니가 매우 적지만, 더 많은 콜로니를 원하신다면 플레이트당 약 100개의 콜로니가 형성되어 정확히 적절한 밀도를 보여주는 이 플레이트의 사례를 참고하시기 바랍니다.

이 플레이트는 콜로니가 너무 많아 개별 콜로니를 선택할 수 없으므로 좋지 않은 예시입니다. 따라서 각 형질전환 과정을 통해 E. coli를 형질전환하는 방법을 보여드렸습니다. 이 기술에서 매우 중요한 점은 열 충격(shock) 전까지 모든 것을 얼음 위에서 차갑게 유지하는 것입니다.

그런 다음 45초 동안 일반 조건으로 진행하고, 42°C에서 더 처리한 후 다시 얼음에 넣습니다. 그리고 나머지 모든 과정은 따뜻한 온도 또는 37°C에서 이루어져야 합니다. 이제 PCR 스크리닝을 통해 콜로니를 선별하겠습니다.

또한 중요한 점 중 하나는 두 개의 플레이트를 준비하는 것입니다. 하나는 많은 콜로니가 형성될 것으로 예상되는 플레이트이고, 다른 하나는 콜로니가 적게 형성될 것으로 예상되는 플레이트입니다. 이때 비즈나 파이펫을 사용하여 플레이트를 매우 건조하게 유지하는 것이 중요합니다.

시청해주셔서 감사하며, 실험 결과 확인에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.