열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화

안녕하세요, 저는 알렉스 호지입니다. 저는 University of California Irvine의 생리학 및 생물물리학과의 체육관 Hall Lab에서 일하고 있습니다. 그리고 오늘은 각 충격의 방법으로 전기 기능이 있는 대장균을 변형시키는 방법을 보여 드리겠습니다.

그래서 오늘 저는 이 기술을 사용하여 제브라피시에서 전체 마운트 화를 수행하기 위해 prob를 수행하고 있기 때문에 lation 제품으로 대장균을 변형시키고 있습니다. 자, 이제 변환을 시작하겠습니다. 따라서 먼저 수조 또는 드라이 버스가 42도에서 필요합니다.

방금 주요 도시에서 제거한 박테리아가 얼음으로 되어 있어야 합니다. 오늘날 우리는 ities의 전기 역량 세포와 얼음 속의 DNA를 사용합니다. 또한 가정 온도 37도의 SOC 배지 튜브와 LV 플레이트와 항생제 배지가 필요합니다.

이제 박테리아와 DNA를 추가하겠습니다. 그래서 저는 박테리아를 오염시키지 않기 위해 불꽃 옆에서 일합니다. 그래서 나는 박테리아와 함께 lation을 추가합니다.

50마이크로리터의 박테리아가 있고 즉시 얼음 속으로 다시 들어가 박테리아와 DNA를 섞기 위해 약간 튕기면 얼음 속에서 최대 15분 동안 방치할 수 있습니다. 이제 15분이 지났고 박테리아를 42도에서 45초 동안 두는 열 충격을 할 준비가 되었습니다. 그래서 저는 42도 세트, 30 타이머 45초에서 얼음에서 튜브를 직접 꺼낸 다음 매우 빠르게 얼음에 다시 넣고 42도 중에서 얼음 위에 직접 넣습니다.

그런 다음 2분 동안 기다립니다. 이제 SOC 배지를 박테리아에 추가하고 30분 동안 37에 놓을 것입니다. 그래서 저는 500마이크로리터의 SOC 배지를 전자담배를 피우고 박테리아에 넣고 작은 임시 챔버에 넣습니다.

따라서 인큐베이터에 eend tubes와 임시 챔버를 사용하려는 경우 eend tubes를 수평으로 놓아야 합니다. 이제 튜브를 셰이커에 넣을 준비가 되었습니다. 그래서 우리는 이 작은 챔버를 30분 동안 37도에서 사용합니다.

이제 우리는 37도에서 배양을 마쳤고 박테리아를 lb와 항생제에 플레이트화할 것입니다. 그래서 제 경우에는 클로랄입니다. 그래서 나는 각 샘플의 50 마이크로 리터를 접시에 넣는다.

그래서 남은 500마이크로리터를 가지고 작은 탁상에 올려놓고 일부는 박테리아를 벗기기 위해 거부합니다. 그래서 ification 후에 우리는 좋은 펠릿을 얻게 되고 우리가 지금 할 일은 거의 모든 SOC 매체를 제거하고 50마이크로리터를 남겨둔 다음 이 50마이크로리터의 농축된 박테리아를 도금할 수 있습니다. 그래서 나는 약 450 마이크로 리터를 지불합니다.

나는 단지 이만큼 남겨 둔다. 이제 SOC 미디어의 왼쪽 50마이크로리터에 팔레트를 매달아 보겠습니다. 그 후에 이 50마이크로리터를 다른 접시에 넣을 수 있습니다.

그래서 나는 각 팔레트에 저항한 다음 인형을 만들고 플레이팅합니다. 따라서 끝에 표본 당 2개의 판이 있을 것입니다. 이제 우리는 박테리아를 LB 플레이트에 퍼뜨려야 합니다.

그래서 저는 오토클레이브 유리 구슬을 사용할 것이지만 파이프를 사용하여 스프레더로 모양을 만들 수도 있습니다. 그래서 페트리 접시에 구슬 몇 개를 넣겠습니다. 좋아요.

글쎄, 10 15. 그래서 구슬을 추가한 후 모든 접시를 그런 더미에 넣고 부드럽게 흔들어 구슬이 접시의 모든 곳에 박테리아를 고르게 퍼뜨리도록 합니다. 그래서 접시가 마를 때까지 접시를 움직입니다.

따라서 구슬과 함께 움직일 때 큰 액체 줄무늬가 보이면 안 됩니다. 예를 들어, 그 판에서 구슬은 함께 무너지는 경향이 있고 많은 줄무늬가 보입니다. 하나는 땀이고, 구슬은 자유롭게 움직이고, 하나는 건조합니다.

이제 접시가 건조되어 구슬을 버릴 수 있습니다. 그래서 저는 여러분이 그것들을 재활용할 수 있도록 그렇게 당깁니다. 이제 우리는 하룻밤 동안 37시에 플레이트를 인큐베이터에 넣고 37시에 12시간 동안 배양한 후 플레이트를 거꾸로 놓고 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.

그리고 보시다시피, 제가 50마이크로리터 더 많이 도금한 플레이트에는 나머지를 도금한 플레이트보다 더 적은 콜로니가 있습니다. 박테리아를 변형시킬 때 중요한 것은 접시에 적절한 양의 콜로니, 적절한 밀도를 갖는 것입니다. 따라서 이 곳에는 군체가 거의 없지만 더 많은 군체를 원한다면 이 판에서 판당 약 100개의 군체가 있는 정확한 밀도의 좋은 예를 가질 수 있습니다.

이 플레이트는 식민지가 너무 많아 개별 식민지를 선택할 수 없기 때문에 나쁜 예입니다. 그래서 저는 방금 각 변형으로 대장균을 변형시키는 방법을 보여드렸습니다. 따라서 이 기술의 매우 중요한 측면은 충격이 가해지기 전에 모든 것을 차갑게 유지하는 것입니다.

그런 다음 45 초 정상, 42도에서 얼음 속으로 돌아갑니다. 그리고 다른 모든 것은 따뜻한 온도 또는 37도에 있어야 합니다. 이제 PCR 선별 검사로 제 군체를 선별할 것입니다.

따라서 요점 중 하나는 두 개의 플레이트를 갖는 것입니다. 첫째, 우리는 많은 식민지가 있을 것으로 예상하고 그 식민지는 더 적을 것으로 예상합니다. 그리고 중요한 것은 구슬이나 파이프를 사용하여 접시를 매우 건조시키는 것입니다.

시청해 주셔서 감사드리며 확인에 행운을 빕니다.