Name: 반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 학습하세요 단클론 항체를 이용한 Histoplasma capsulatum 감염 예방법을 C57BL/6 마우스 모델에서. 이 연구는 체액성 면역이 진균 감염에 대한 보호 역할을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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1. H.의 성장 Capsulatum <ol><li> 20 분 자외선 조사에 의해 다음 10 % 표백제와 캐비닛을 청소하여 곰팡이와 함께 일을 biosafety 캐비닛을 준비합니다. H.이 금형 양식 BSLIII을 필요로하는 동안 효모 단계에 capsulatum은 Biosafety 레벨 (BSL) II 관행이 필요합니다. 다음 단계에서 효모 양식을 사용하십시오. </li><li> 다음 PBS 5 ML과 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. H.의 식민지를 수확 BHI 혈액 한천 플레이트 [포도당 10g / L, 시스테인 0.1 g / L, 페니실린 - 스트렙토 마이신 1퍼센트 및 양 적혈구 50 ML / L (콜로라도 세럼 (주), 콜로라도, 미국)에서 capsulatum (변형 HC ATCC G217B) ] 37 ° C에서 재배 또는 -80 ° C에서 냉동 효모 주식에서 나누어지는을하고 PBS에 추가합니다. 적극적으로 소용돌이 세포를하고 실온에서 10 분 1,100 XG를위한 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 제거하고 신선한 PBS의 10mL를 추가합니다. 이 절차를 세 번 반복합니다. 50 ML 원뿔 관에 PBS 및 tranfer의 5mL에있는 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 집계 세포를 중단하려면, 10mL 주사기에게 biosafety 캐비닛 (안면 보호를 사용하여)에서 5 번 노래 26 G1 / 2 바늘 U를 통해 효모 세포 현탁액을 전달합니다. 작은 균일 크기의 효모를 분리, 상온에서 1 분 55 XG에있는 세포를 원심 후 상위 1 ML를 제거합니다. </li><li> 16g / L 포도당, 1g / L 글루탐산, 8.4mg / L 시스틴, 6g / L 글루탐산 후 37 세포의 성장과 함께 보충 햄 F12 매체의 100 ML (GIBCO)를 포함하는 멸균 erlenmeyer 플라스크에 세포 현탁액을 추가 ° 150rpm 잡고 인큐베이터에서 48 H를위한 C. </li></ol> 2. 단클론 항체의 하이 브리 도마 성장과 정제 <ol><li> 10% 태아 송아지 혈청, 10 % NCTC, 1 %가 아닌 필수 아미노산, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 포함한 DMEM 매체로 선택한 hybridomas을 전송합니다. 37 5~7일위한 세포 배양 플라스크 (백톤 디컨슨)에 세포를 성장 ° C / 5 % CO 2. </li><li> 그런 다음 실온에서 10 분 1,100 XG에서 매체를 원심과 알약을 중단하지 않고 모든 표면에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 다음 단백질 FPLC로 A / G 수지를 사용하여 셀 무료 뜨는 정화. </li><li> mAb 농도는 다음 표준으로 IgG의 isotype 제어 (그림 1B)를 사용하여 캡처 엘리사 (1)로 계산하실 수 있습니다. </li></ol> 3. Histoplasma Capsulatum의 Inoculum 준비 <ol><li> 햄 F - 12 중간에서 자란 48 H Histoplasma capsulatum (변형 HC ATCC G217B) 효모 위상 문화를 가져가라. </li><li> 10 분 1,100 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 신선한 PBS를 추가합니다. </li><li> 3.2 프로 시저에게 3 번 반복합니다. </li><li> 주사기를 사용하여 26G1 / 2 바늘을 통해 효모 세포 현탁액에게 5 번 패스. </li><li> 펠렛 잔여 세포 클러스터 1 분 55 XG의 현탁액을 원심 분리기. 새로운 튜브로 단일 세포 현탁액을 포함하고있는 뜨는을 전송합니다. </li><li> hematocytometer를 사용하여 단일 세포 현탁액을 열거합니다. </li><li> 1.25 X 10 7 효모 (서바이벌) 또는 5.0 × 10 6 (CFU, 크린 시토킨 및 조직학) &lt;50 μL (그림 2)의 suspention에 달성하기 위해 세포 농도를 조정합니다. </li></ol> 4. MAbs의 Intraperitoneal 관리 <ol><li> 꼬리와 목의 아저씨 (그림 3A)에서 마우스를 선택하십시오. 가능한 theears (; 그림 3B와 3C 마우스 그것을 취급하는 사람을 물려고 머리를 cannotturn 있도록 충분히 피부를 차지해야합니다)에 가까운로서 목의 아저씨로 마우스를 고정. </li><li> 부드럽게 손 (그림 3D)의 손바닥에 대해 누르면 꼬리 withthe 작은 손가락을 안정. </li><li> 면봉 바늘과 주입하기 전에 혈액을 찾아 대기음로 배치하기 전에 70 %의 에탄올로 분사 영역입니다. </li><li> 함께 thelower의 왼쪽이나 오른쪽 아래 복부 사분면 (intraperitoneal 구멍)에 500μg을 (PBS, isotype 제어 항체 또는 mAb 1 ML PBS에 희석, 테스트)를 포함하는 mAb 솔루션을 주입하기 위해 피부와 abdominalmuscles을 piercethe하는 26G1 / 2를 사용하여 격막 andother 내장 (그림 3E)을 피하기 위해 돌보는 위치 아래 머리에 동물. </li><li> needleto가 누출의 가능성을 줄일 수 철수하기 전에 잠시 만요. </li><li> 다음 단계로 진행하기 전에 2 시간 최소 기다립니다. </li></ol> 5. 마우스 마취과와 비강 감염 <ol><li> 100 MG / kg, 10 MG / kg, 각각의 마취제와 xylazine을 사용하여 마취를 준비합니다. intraperitoneal PBS의 행정, isotype 제어 항체 또는 동행하는 서면 프로토콜에서 설명한대로 실험 항체를 수행합니다. 마우스를 anesthetizing과 비강 감염하기 전에 mAb 주입 후 두 시간 기다려. 100 MG / kg, 10 MG / kg, 각각 (7)에서 사용하는 마취 마취제와 xylazine를 준비합니다. </li><li> 2 시간 대기 기간 동안 같이 동행하는 서면 프로토콜에 설명되어있는 Histoplasma capsulum의 inoculum을 준비합니다. </li><li> 5.5 itens 5.1에 따라 진행합니다. 트위터와 함께 동물을 공략 발가락과 반사의 부재를 확인하고 마취가 작동 확인합니다. anaesthetization 후, 부드럽게 나일론이나 목화 문자열하기 위해 앞니로 마우스를 일시 중지합니다. 동물을 중지하기 위해 문자열을 묶어 2 열 스탠드를 사용하십시오. </li><li> 천천히 밀접하게 마우스의 호흡 속도를 모니터링하면서 micropipette를 사용하여 nare로 약 50 μl inoculum을 관리할 수 있습니다. 마우스 동물의 폐 (그림 3 층)에 효모의 증착을 촉진하기 위하여 비강 감염 후 2-5 분이 자리에서 휴식을 허용합니다. </li><li> 마우스가 감염된 후, 필요한 경우는 마취에서 회복까지 신중하게, 가열 램프를 활용, 모니터, 따뜻한 환경 (25 37 ° C 사이의 온도)에 마우스를 유지합니다. 때 마우스 깨우고, 음식과 물이 광고 libitum 접속 깨끗한 케이지로 돌아갑니다. 케이지는 우리 동물 시설에 반환하고 깨끗한 동물 방 (BLSI)에 보관됩니다. </li></ol> 6. 서바이벌 연구 <ol><li> tachypnea, 혼수, obtundation 및 체중 감량에 대한 임상 감염 모의 - 감염된 동물을 평가합니다. 동물 실험실 회원 및 동물 관리 인에 의해 매일에 의해 두 번 매일 확인하여야한다. </li><li> murine 히스토플라스마증로 삶의 끝에 닫을 때까지, 호흡 속도에 가벼운 증가 이외의 감염에 대한 명백한 신호는 일반적으로 없습니다. 보통 10~11일에서 일어나는 고급 질환으로, 마우스는 상당히 tachypneic되어 감소 활동을했습니다. 일반적으로 그들은 신속하게 죽어가는되어 만료됩니다. </li><li> 고민 동물 전용 실내의 CO 2와 적절한 euthanized해야 죽은 동물은 매일 열거해야합니다. </li></ol> 7. CFU 연구, 조직학 및 크린 시토킨 연구 <ol><li> 수집하는 각 기관에 대한 10mL PBS로 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. </li><li> 로 이전에 표시된 sublethal inuculum (5.0 × 10 6)과 동물 7 감염 후 14 일 안락사 즉시 폐, 비장과 간장을 제거하십시오. </li><li> 평가할 수있는 기관의 조각을 제거하고 포르말린 하룻밤에 고정을 수행합니다. 섹션은 병리 평가를 위해 현미경으로 검사됩니다. </li><li> 5mL PBS로 50 ML 원뿔 튜브 준비는 균질하는 각 기관은 70 μm의 세포 strainers 얹은. 무균 5mL 주사기의 plungers를 사용하여 50 ML 튜브에 별도로 장기 각각의 나머지 부분을 물에 담가서 부드럽게. </li><li> 다음 순차적으로 BHI - 혈액 한천 플레이트 (2) 장기 homogenates (1:100, 1:1000 1:5000과) 및 각 희석의 접시 100μL를 희석. </li><li> 제조의 지침 (로체, 독일)에 따라 homogenates에 테아제 억제제의 위패를 추가합니다. </li><li> ° C 십사일 및 열거 CFUs에 최대 37 번호판을 품어. </li><li> 10 분 4000xg에서 장기 homogenates을 원심 분리기 및 장기 supernatants 제거 위시는 제조 업체에 따라 표준 방법으로 수행 시토킨 assays에 사용에 사용됩니다. </li></ol> 8. H. 반대 단클론 항체 보호 Capsulatum는 항체 특이성 및 Isotype에 따라 달라집니다 <ol><li> MAb isotype은 H.에 대한 보호에 매우 중요합니다 capsulatum은 Hsp60에 IgG1 또는 IgG2a mAbs 취급 생쥐로 Hsp60에 IgG2b mAb를받는 생쥐 또는 어느 컨트롤 isotype mAb 또는 PBS (그림 4) 제어에 비해 상당히 장기간 생존 있습니다. </li><li> 또한, 보호 mAbs를받은 생쥐에 일 7 폐동맥과 지라 CFU의 수를 크게 감소가되었으며 일 14 (그림 5)에서 폐 효모 숫자 2와 2.5 로그 단위의 감소. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : H.의 성장 capsulatum 및 hybridomas. H.에서 얻은 하나의 식민지에서 (A) 액체 햄 F - 12 문화 준비 capsulatum는 BHI - 혈액 한천 플레이트에서 성장. 세포 배양 및 단백질 flasks A / G 수지를 사용 친화 cromatography에 의해 mAb 정화의 (B) 하이 브리 도마 성장. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : H. 비강 감염 capsulatum의 inoculum 준비. H. 후 얻은 세포 현탁액 주사기와 원심 분리에 의해 capsulatum 합산 장애는 hemocytometer에서 계수에 의해 열거됩니다. 세포 농도가 1.25 조정됩니다 × 10 7 (생존 실험) 또는 5 &lt;50 μL에서 X 10 6 (CFUs, 크린 시토킨 및 조직학). upload/2532/2532fig3.jpg "고도 ="그림 3 "/&gt; 그림 3 : mAb 관리하는 동안 마우스 처리. (A) 마우스는 꼬리가 데리러와 (B 및 C) theears에 가까운로서 목의 아저씨를 개최하여 움직일 수 있습니다. (D) 꼬리는 작은 손가락과 손바닥 사이에 개최됩니다. (E) mAb 솔루션 26G1 / 2 바늘을 사용하여 주입합니다. (F) H. capsulatum inoculum는 부드럽게 nare에 세포 현탁액을 pipetting하여 intranasally 관리합니다. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : Hsp60을 MAbs가 히스토플라스마증의 pathogenesis을 변경할 수 있습니다. 500 IgG1의 μg, 또는 이전에 감염이 크게 연장 생존 (컨트롤에 비해 P는 &lt;0.05)에 IgG2a mAbs 2 H 있지만, IgG2b mAb와 IP 주사. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 : 마우스 5x10 6 HC의 효모를 선택 Hsp60에 mAbs 또는없는 mAb 동물을 치료 mAbs IgG1과 IgG2a에 대한 곰팡이 부담의 감소를 보여주 취급 IP와 sublethal 비강 도전 후 CFU 7에서 폐에 결정 14 일. 블랙 바 일 7시 CFUs과 흰색 막대를 나타냅니다 십사일 후 감염 (* P 칠일에 &lt;0.001, 14 일 게시물 감염에 ** P &lt;0.001).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 프로토콜 mAb는 H.하는 걸 보여줍니다 capsulatum는 실험 murine 히스토플라스마증의 과정을 수정할 수 있습니다. 병원균의 세포 표면 항원에 MAbs는 호스트와 병원체 사이 상호 작용하는 동안 발생하는 복잡한 역학을 수정할 수 있습니다. 이 연구 intraperitoneally을 주입했을 때 mAbs는 치명적인 히스토플라스마증의 murine 모델의 보호를 중재 것을 수립하고는 H2B, M의 항원 (카탈 라 아제 표면) (3)와 Hsp60와 같은 백신 개발을위한 후보 단백질을 제안합니다. 생체내에서, HC Hsp60 및 H2B에 보호 mAbs의 행정 기관 곰팡이 부담과 염증과 감염된 생쥐의 장기 생존을 감소. 하지만 H.에 대한 백신 개발 그들은 반드시 면역 반응을 조정 수 없기 때문에 capsulatum 연구의 흥미로운 지역이며, 예방 접종, immunocompromised 개인 효과적으...

<table border="1"><tbody><tr><th> 재료의 이름 </th><th> 회사 </th></tr><tr><td> 생물 안전 캐비닛 (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 튜브 </td><td> 팔콘, BD </td></tr><tr><td> 햄 F - 12 중간 </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C 흔드는 </td><td></td></tr><tr><td> 와동 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 원뿔 튜브 </td><td> 팔콘, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 바늘 </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 ML 주사기 </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 ML의 flasks </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (고속 단백질 액체 크로마 토그래피) 시스템 </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> 엘리사 리더 </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> 마취 (마취제와 Xylazine) </td><td></td></tr><tr><td> 열 스탠드 </td><td></td></tr><tr><td> 나일론 문자열 </td><td></td></tr><tr><td> 가열 램프 </td><td></td></tr><tr><td> 70μm 세포 strainers </td><td> 팔콘, BD </td></tr><tr><td> BHI 한천 플레이트 </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

반대 단클론 항체의 수동적 관리 h. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

이 방법론의 사용 목적은 항체 또는 균류 Histoplasma capsulatum 2) 치료 대상으로 독성 요소의 역할을 검토로 인한 히스토플라스마증을 예방하거나 치료를위한 백신과 개인을 보호하기 위해 우리의 역량을 발전) 1입니다. mAbs를 생성하려면, 마우스가 예방 접종되고 면역 반응은 우리의 연구실에서 개발한 고체 위상 엘리사 시스템을 사용 평가하고 있으며, 최고의 응답의 마우스는 하이 브리 도마 세포와 융합을위한 splenocytes의 격리를 위해 선택됩니다. C57BL / 6 생쥐는 광범위 H. 연구하는 데 사용되었습니다 capsulatum pathogenesis하고 필요한 데이터를 얻기위한 최상의 모델을 제공합니다. 감염에 mAbs의 역할을 평가하기 위해서는, 마우스는 H.에 mAb 중과 관리 intraperitoneally 아르 capsulatum 또는 isotype도 정맥 주사 (IV), intraperitoneal (IP) 또는 비강 (인) 노선에 의해 제어 mAb와 일치하고 감염. 과학 문학, 마우스에 곰팡이 감염 mAbs의 효능은 이전 시간 지점에서 콜로니 formin 단위 (CFU) 평가와 함께, 끝점으로 사망률에 의존합니다. 그들은 최고의 인간의 질병을 대표로 생존 (사망 시간) 연구가 필요합니다. 따라서, 우리의 개입의 효능은 충분히 생존 곡선없이 설정할 수 없습니다 것입니다. 이것은 백신이나 독성에 대한 돌연변이 검사의 효능을 수립에도 적용됩니다. 히스토플라스마증와 생쥐는 종종 몇 시간 동안 죽은 활기찬되는 이동합니다. 이러한 mAb의 행정으로 개입의 용량은 처음에는 질병으로부터 동물을 보호 수 있지만, 질병은 짧은 CFU 실험의 재발을 실현 않을 수있는. 생존과 곰팡이 부담 assays 이외에, 우리는 감염 (조직학, 세포 채용, 시토킨 응답)로 염증 반응을 검사합니다. 생존 / 사망 실험 시간은 생쥐는 병적 상태의 흔적에 대해 최소한 회 감염 감시하고 있습니다. 곰팡이 부담, 조직 병리학, 그리고 시토킨 반응을 평가하기 위해, 생쥐는 감염 후 여러 시간에 euthanized 있습니다. 동물 실험은 의학의 알버트 아인슈타인 대학 동물 연구소의 지침에 따라 수행됩니다.

C57BL / 6 마​​우스는 HC의 pathogenesis을 연구하고 최상의 모델을 제공하는 데 사용되었습니다. 우리는이 곰팡이에 대한 체액성 면역의 가능성 혜택을 탐구하고 [히스톤 H2B와 열 충격 단백질 60kDa로] 여러 mAbs를 생성 우리가 intraperitoneal 행정부 이후에 그들의 보호 효능에 대한 테스트 것을.

반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

본 방법론을 사용하는 목적은 1) ...의 예방 또는 치료를 위한 항체 또는 백신으로 개인을 보호할 수 있는 역량을 증진하는 것입니다.

이 절차의 전반적인 목표는 히스토플라즈마증(histoplasmosis)의 예방 또는 치료를 위해 항체나 백신으로 개인을 보호하는 능력을 향상시키고, 질병의 병인에서 병원성 인자의 역할을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 표적 항원에 대한 단클론 항체를 분리하고 특성을 분석함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 선택한 단클론 항체를 비강 내 감염 2시간 전에 복강 내로 투여하는 것입니다.이러한 분자들이 체내 전체에 분포할 수 있는 시간을 확보하기 위해, 실험 절차의 세 번째 단계는 마우스를 마취시킨 후 원하는 접종물을 비강 내로 감염시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 동물의 건강 상태를 모니터링하는 것입니다. 동물들은 진균 부하량을 측정하고 염증 반응을 평가하기 위해 다양한 간격으로 안락사시키거나, 생존 여부를 추적 관찰합니다.최종적으로, 감염 전 복강 내로 보호 단클론 항체를 투여함으로써 치사량에 감염된 마우스의 생존 기간 연장 및 영향받은 장기의 병리학적 반응 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 본 절차는 진균 병원성 및 동물 감염 모델에 풍부한 경험을 가진 박사후 연구원인 ally emer가 시연합니다. 항진균제와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 단클론 항체가 숙주의 잠재적 인자와의 결합을 통해 작용하는 특이적 성질을 가진 분자라는 점입니다. 질병에 대한 반응을 본 방법으로 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요합니다.단클론 항체 투여 및 비강 내 감염 단계는 동물 취급에 관한 전문 지식이 필요하므로 학습하기 어렵습니다. 표백제로 캐비닛을 세척한 후 UV 조사를 통해 효모 형태의 진균 작업을 위한 생물안전 2등급 캐비닛을 준비하십시오. 15 mL 원심분리관에 5 mL의 PBS를 준비하십시오.-80 °C에서 냉동 보관된 스톡 분주액으로부터 H caps AUM 콜로니를 수확하여 PBS 볼텍스에 첨가하십시오. 세포를 강하게 볼텍싱하고 1100 ×g에서 10분 동안 원심분리하십시오. 상온에서 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거하고, 신선한 PBS를 최소 10 mL 첨가하십시오.마지막 세척 후 이 절차를 세 번 반복하십시오. 세포를 5 mL의 PBS에 다시 현탁하십시오. 모든 세척은 상온에서 수행해야 합니다. 응집된 세포를 분산시키기 위해, 10 mL 주사기와 26 gauge 1/2 바늘을 사용하여 효모 세포를 다섯 번 통과시켜 50 mL 원심분리관(conical tube)에 수집하십시오.크기가 균일한 작은 효모를 분리하려면, 세포를 55 ×g에서 1분 동안 원심 분리한 후 상층액 1 mL를 제거하십시오. 세포 현탁액을 HAM-F12 배지 100 mL가 들어 있는 멸균된 250 mL 유리 삼각 플라스크에 넣고, 실온의 이산화탄소 농도가 유지되는 진탕 배양기에서 37 °C로 48시간 동안 세포를 배양하십시오. 이 배양물은 접종원을 준비하는 데 사용되며, 다음 단계에서 생성된 단클론 항체의 효능을 평가하게 됩니다.선택된 하이브리도마를 DMEM에서 5~7일 동안 배양합니다. 배양 후, 세포 배양 플라스크에서 모든 배지를 수집하여 항체를 회수하고, 배지를 1100 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 효모 세포와 마찬가지로 항체는 실온에서 세척할 수 있습니다.펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 수집합니다. 다음으로, F-P-L-C-A 캡처를 통해 protein AG 레진을 사용하여 무세포 상층액을 정제합니다. 정제된 항체를 얼마나 주입해야 할지 결정하기 위해 Eli SA를 사용하여 단클론 항체 농도를 계산합니다.동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로 PBS Isotype 대조 항체 또는 실험 항체를 복강 내로 투여합니다. 단클론 항체 주입 후 2시간을 기다린 다음, 마우스를 마취하고 비강 내 감염 절차를 진행하십시오. 대기 시간 동안 *Histoplasma capsulatum* 접종액을 동봉된 서면 프로토콜에 따라 준비하고, 두 개의 컬럼 스탠드 사이에 나일론 또는 면사를 단단히 묶은 후 스탠드 사이를 벌려 실이 팽팽해지도록 하여 마우스 감염을 위한 스트링 장치를 조립합니다.마취제인 ketamine 100 mg/kg과 xylazine 10 mg/kg을 준비합니다. 항체가 충분히 확산될 수 있는 시간을 가진 후 이 시점에 함께 준비할 수 있습니다. 마우스를 마취시키고, 발가락 자극에 반응이 없는 것을 확인하여 진정 상태를 확인합니다.핀셋으로 잡습니다. 쥐의 앞니를 이용해 줄에 조심스럽게 매달아 고정합니다. 마이크로피펫을 사용하여 약 50 microliters의 접종액을 공기 중에 천천히 투여합니다.마우스의 호흡수를 면밀히 관찰하십시오. 비강 내 감염 후, 효모가 마우스의 폐에 잘 안착될 수 있도록 이 자세로 2~5분 동안 휴식을 취하게 합니다. 마우스가 마취에서 회복될 때까지 필요에 따라 가열 램프를 주의 깊게 사용하여 온도가 유지되는 관찰 환경에서 관리하십시오.마우스가 깨어나면 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록(ad libido) 제공하며, 감염된 동물과 모의 감염된 동물의 임상 상태를 평가합니다. 빈호흡, 무기력증의 최적화 및 체중 감소 여부를 확인하기 위해, 연구실 구성원은 하루에 두 번, 동물 사육사는 매일 동물을 점검해야 합니다.만성 히스토플라스마증(histoplasmosis)으로 인해 생애 말기에 다다를 때까지, 일반적으로 호흡률의 가벼운 증가 외에는 감염의 뚜렷한 징후가 나타나지 않습니다. 질병이 진행됨에 따라 마우스는 현저하게 체중이 감소하고 활동성이 저하됩니다. 일반적으로, 상태가 급격히 악화되며 폐사하게 됩니다.고통을 겪는 동물은 전용 챔버에서 이산화탄소를 이용하여 적절하게 안락사시켜야 합니다. 발가락 꼬집기 등에 대한 반사 반응이 없는 것을 통해 사망을 확인하며, 안락사된 동물 수는 매일 기록해야 합니다.수집할 각 장기당 10 mL의 PBS를 넣은 15 mL 원추형 튜브를 준비합니다. 이전에 보여준 바와 같이 5×10⁶의 아치사량 접종균으로 감염된 동물을 안락사시킨 후, 폐, 비장 및 간을 즉시 제거하고 5 mL의 PBS가 담긴 50 mL 원추형 튜브를 준비합니다.균질화할 각 장기별로 70 micron 세포 여과기가 장착된 페트리 접시를 준비합니다. 각 장기를 5 mL 플런저로 개별적으로 분쇄한 후 50 mL 튜브로 옮깁니다. 다음으로 장기 균질액을 1:100, 1:1,000, 1:5,000의 세 단계로 연속 희석하고, 100 µL를 BHI 배지에 도말합니다.혈액 한천 배지(Blood agar plates)를 이산화탄소 농도가 일반 실내 수준인 배양기에서 37 °C로 최대 14일 동안 배양하고, 단일클론 항체의 CFU를 계수합니다. Isotype은 hcaps Lotum에 대한 보호 작용에 있어 매우 중요합니다. HSP 60에 대한 IgG1 또는 IgG2 a 단일클론 항체로 치료한 마우스는 HSP 60에 대한 IgG2 b 단일클론 항체, isotype 대조군 단일클론 항체 또는 PS를 투여받은 대조군 마우스에 비해 생존 기간이 유의하게 연장되었습니다. 또한 보호성 단일클론 항체를 투여받은 마우스의 경우, 7일 차에 폐와 비장의 CFU 수가 유의하게 감소했으며, 14일 차에는 폐 내 효모 수가 2 및 2.5 log unit 감소했습니다. 이 절차 이후, 군락 형성 단위(colony forming unit)를 나타내는 진균 부하량 측정, 감염에 관여하는 사이토카인 분석 및 조직학적 평가와 같은 다른 방법들을 수행하여, 해당 절차를 시도하는 동안 항체에 의한 질병 수정의 작용 기전 정의와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.녹다운 개체를 취급할 때는 생물학적 안전 조건을 준수하며 작업하고, 비강 내 감염 시에는 동물 보호 규정에 따라 작업하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

DA 쥐에서 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 encephalomyelitis :이 비디오는 여러 경화증의 동물 모델의 유도 및 임상 채점을 보여줍니다. 전체 쥐의 척수하고 완전한 프로 인드의 도움이되는가 포함된 유제와 immunizing 쥐가 유도된 질병은, 인간의 질병을 닮은 임상 징후를 보여줍니다.

유도 및 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 Encephalomyelitis 임상 채점

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

이 비디오는 쥐 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위해 항원 보조 에멀젼을 생성하는 효율적인 균질화 기술을 보여줍니다. 에멀젼은 물 상태에 자가항원인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 함유하고 있으며, 불활성화된 병원성 박테리아로 구성된 연속적인 오일 상태로 둘러싸여 있습니다. 에멀젼은 장기적인 면역 반응을 위해 항원의 지속적인 방출을 보장합니다.

자가면역 뇌척수염을 유발하기 위한 항원 보조 에멀젼 제조

실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 다발성 경화증의 설립 동물 모델입니다. C57BL / 6 마우스는 중추 신경계 자기 반응성 면역 세포에 의해 야기 오름차순 이완성 마비를 초래 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) 펩티드 35-55 (MOG 35-55)로 면역화된다. 질병 유도 및 모니터링을위한 프로토콜이 논의 될 것이다.

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 유도

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

이 프로토콜은 마우스에서 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU)을 유도하는 단계를 설명합니다. 이 방법은 마우스 모델 시스템에서 신뢰할 수 있고 강력한 안구 염증을 생성하는 데 도움이 되는 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 면역학, 전사 및 단백질체학 분석을 통한 추가 평가를 위해 단일 동물에서 포도막 눈과 염증이 없는 동료 눈을 생성했습니다.

감염 후 포도막염의 모델로서의 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU)

다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.

실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

생쥐는 일반적으로 Mycobacterium abscessus에 의한 감염에 내성이 있으며, 이는 폐 감염에 대해 절실히 필요한 항생제의 발견 및 개발을 복잡하게 만듭니다. 여기에서는 면역 능력이 있는 마우스에서 지속적인 감염을 전달하는 것으로 나타난 접종 준비 및 기관 내 감염 방법에 대해 설명합니다.

면역 능력이 있는 마우스를 기관내로 접종하기 위한 한천 비드 내장 마이코박테리움 농양의 제조

학습하세요 단클론 항체를 이용한 Histoplasma capsulatum 감염 예방법을 C57BL/6 마우스 모델에서. 이 연구는 체액성 면역이 진균 감염에 대한 보호 역할을 이해하는 데 도움을 줍니다.

반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

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