전체 마운트를 사용하여 현장에서 하이브 리다이 제이션

이 절차의 전반적인 목표는 특정 발달 단계에서 제브라피시 배아의 유전자 발현 패턴을 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 표지된 안티센스 리브 프로브의 디 산소를 관심 MR mRNA에 혼성화하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 리보 프로브를 감지하는 것입니다.

항체에서 doxygen에 대한 항체를 사용하면 알칼리성 인산가수분해효소에 접합됩니다. 절차의 세 번째 단계는 NBT와 BCIP를 첨가하여 염색하는 것으로, 알칼리성 인산가수분해효소와 반응하여 불용성 자주색 침전물을 생성합니다. 절차의 마지막 단계는 비특이적 염색을 줄이기 위해 충분히 염색된 배아를 메탄올에 배양하는 것입니다.

궁극적으로, 특정 발달 단계에서 전체 얼룩말 물고기 배아에서 유전자 발현 패턴을 보여주는 결과는 전체 산 종자 2 교잡법을 사용하여 얻을 수 있습니다. 조직학 또는 해부의 전통적인 교실 시연과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 학생들에게 분자 생물학과 유기체 발달 및 진화 추세 사이에 개념적 다리를 놓을 수 있는 기회를 제공하여 진정으로 통합적인 경험을 제공한다는 것입니다. 이러한 방법은 전통적으로 몇 가지 모델 유기체의 발달을 연구하는 데 사용되었지만, 척추 분류군 전반에 걸친 발달 경로의 보존과 이러한 경로가 어디에서 벗어나 진화론적 참신함으로 이어지는지 이해하기 위해 다른 비모델 유기체에 쉽게 적용할 수 있습니다.

이 방법은 학부생에게 생소할 수 있으므로 일부 학생들은 처음에는 어려움을 겪을 수 있지만 이 방법을 배우면 학부 연구 경험과 상위 부문 과정에서 도움이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 이송 파이프를 사용하여 약 50개의 제브라피시 배아를 마이크로 쓰레기 튜브로 이식합니다. 여분의 액체를 제거한 다음 1.5ml의 4% 파라 포름알데히드를 튜브에 피펫으로 넣습니다.

배아 튜브를 실온의 교반기에 밤새 놓습니다. 다음 날 아침에 수정 사항을 제거하고 폐기하십시오. 0.1% 트윈 20을 함유한 인산염 완충 식염수 1.5ml를 배아에 첨가하여 세척합니다.

필요한 경우 끝이 가는 집게를 사용하여 배아를 수동으로 코팅하고, 전사 피펫을 사용하여 코팅된 배아를 깨끗한 미세 융합 튜브에 넣습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터의 25 % 메탄올과 PBST를 튜브에 피펫으로 넣습니다. 1시간 동안 배양한 후 배아를 방해하지 않고 이 용액을 최대한 많이 흡인합니다.

그런 다음 PBST에 1.5ml의 50% 메탄올로 교체하고 최소 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로 1.5ml의 100% 메탄올로 교체하고 섭씨 영하 20도에 놓습니다. 배아는 섭씨 영하 20도의 메탄올에 보관할 수 있습니다.

사용할 준비가 되면 튜브에서 메탄올을 피펫으로 넣고 피펫을 폐기합니다. PBST의 메탄올 50%를 튜브에 넣고 10분 동안 배양합니다. 이 작업을 반복하고 두 번 세척 한 다음 용액을 흡인하고 PBST에 25 % 메탄올로 배양을 반복합니다.

마지막으로 100% PBST에서 각각 10분씩 두 번 세척하고 PBST에서 10% 과산화수소 용액을 준비합니다. 제브라피시 배아를 배아의 나이에 따라 10-20분 동안 마이크로 흄 튜브 캡을 연 상태로 실온에서 이 용액에 담그십시오. 전사 피펫을 사용하여 어두운 색소 침착을 제거하려면 과산화수소 용액을 제거하고 폐기하십시오.

반응을 멈추기 위해 1.5ml의 PBST로 배아를 여러 번 헹굽니다. PBST에서 단백질 분해 효소 K 1 5, 000의 밀리리터 주식 해결책 당 50 밀리그램을 묽게 하십시오. 일반적으로 4.999 밀리리터의 PBST에 1 마이크로리터의 단백질 분해 효소 K.

배아에서 PBST를 제거합니다. 전사 피펫을 사용하여 1.5ml의 proteinase K 용액을 버리고 튜브에 추가합니다. 배아의 나이에 따라 실온에서 3-15분 동안 배아를 proteinase K 용액에 담급니다.

반응을 멈추기 위해 PBST로 여러 번 세척하십시오. 그런 다음 PBST를 제거하고 배아를 4% 파워 포름알데히드에 30분 동안 실온에서 담그고 다시 고정한 다음 전사 피펫을 사용하여 파라 포름알데히드를 제거한 후 폐기합니다. 배아에 PBST 1.5ml를 넣고 5분 동안 씻습니다.

바이알에서 PBST를 조심스럽게 피펫으로 넣고 버립니다. PBST를 두 번 더 사용하여 세척을 반복합니다. 그런 다음 프로브 혼성화를 rip하고 섭씨 70도로 예온한 수조를 진행하고 사전 혼성화 용액을 준비합니다.

그런 다음 전사 피펫을 사용하여 PBST를 제거하고 폐기합니다. 배아를 0.5ml의 사전 혼성화 용액에 담그고 섭씨 70도의 수조에서 2-3시간 동안 배양합니다. 배아를 방해하지 않도록 주의합니다.

마이크로 쓰레기 튜브에서 사전 혼성화 용액을 피펫팅하고 폐기합니다. 0.5ml의 혼성화 용액을 튜브에 부드럽게 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 이전에 합성된 doxygen을 라벨링된 ribo에 빠르게 첨가합니다.

튜브에 대한 프로브 리보 프로브 농도는 밀리리터당 약 1마이크로그램 범위입니다. 섭씨 70도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 2 배의 식염수 구연산 나트륨과 2 배의 SSC 및 0.2 배의 SSC 용액에서 75 % 50 % 및 25 % PHS의 용액을 준비합니다.

섭씨 70도의 수조에서 더 많은 용액을 데우십시오. 용액이 섭씨 70도에 도달하면 수조에서 회수하십시오. 그런 다음 튜브에서 혼성화 용액을 흡입하고 폐기합니다.

각 따뜻한 P-H-S-S-S-C 용액을 0.5ml씩 첨가하여 각 용액의 배아를 섭씨 70도에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로, 섭씨 68도에서 0.2배 SSC 용액에 30분 동안 배아를 배양합니다. 튜브에서 0.2배 SSC 용액을 흡입하고 폐기합니다.

배아를 실온에서 pH 7.5의 말산 완충액 1.5ml에 10분 동안 배아를 배양합니다. 이것을 반복하고 두 번 씻으십시오. 서면 프로토콜에 따라 차단 솔루션을 준비합니다.

MAB의 배아를 12의 각 웰로 옮깁니다. 웰 플레이트. 과도한 MAB를 제거하고 각각에 1-2ml의 차단 용액을 피펫으로 주입합니다.

적어도 3 시간 동안 교반과 함께 실온에서 잘 배양하십시오. 항체 1의 항원을 나머지 차단 용액에서 2000으로 희석합니다. 온화한 초목으로 최소 3시간 동안 실내 온도를 배양하십시오.

배아를 방해하지 않도록 주의합니다. 플레이트의 우물에서 차단 용액을 피펫으로 넣고 버립니다. 미리 준비한 항체 및 차단 용액을 부드럽게 피펫으로 주입하여 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 배양합니다.

다음 날, 1.5ml의 말산 완충액을 5번 갈아서 배아를 세척합니다. 배아가 말산 완충액에서 5분 동안 배양하도록 합니다. 먼저 버퍼 교체를 수행하고 10분 동안 두 번 배양합니다.

30분 간격과 60분 간격. 웰에서 메익산 완충액의 최종 세척을 흡인하고 피펫을 버립니다. 1.5-2 밀리리터의 알칼리성 인산가수분해효소가 웰에 완충되어 5분 동안 배양합니다.

이 과정을 두 번 반복합니다. 알칼리성 인산가수분해효소 완충액을 제거하고 웰에 1.5-2밀리리터의 염색 용액을 첨가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 접시 전체를 알루미늄 호일로 싸고 20분 간격으로 부드럽게 저어줍니다.

교반을 멈추고 해부 현미경으로 배아를 관찰하여 충분한 염색이 이루어졌는지 확인합니다. 충분한 염색이 보이면 웰에서 염색 용액을 피펫으로 주입하고 폐기합니다. PBST로 대체하여 염색 반응을 중단합니다.

다른 부피의 PBST로 세척 과정을 반복하고 우물에서 PBST를 피펫으로 분사한 다음 PBST의 25% 메탄올 1.5-2밀리리터를 배아를 웰로 탈수하고 10분 동안 배양합니다. PBST에 50% 메탄올을 넣고 10분 더 세척할 때마다 이 과정을 두 번 반복합니다. 그런 다음 배아를 100% 메탄올로 옮기고 최소 2시간 동안 배양하여 비특이적 염색을 줄입니다.

배양 후 우물에서 메탄올을 피펫으로 주입하고 배아를 재수화하기 위해 폐기합니다. PBST에 50%메탄올을 2회 세척한 다음 PBST에 25%메탄올을 각각 10분씩 세척합니다. 그런 다음 매번 10분 동안 100% PBST를 두 번 세척합니다.

마지막으로, 염색된 배아를 PBST에서 등급별 세척 과정을 거쳐 80% 글리세롤 용액으로 옮기고 올바르게 관찰할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 관심 유전자의 발현은 얼룩말 물고기 배아에 보라색 염색이 나타나는 것으로 표시됩니다. 이 이미지는 개인화 후 24시간 후의 얼룩말 물고기 배아를 보여주며, AAL DH one A 2개의 특정 염색을 볼 수 있는 눈, 뒷뇌, 가슴, 지느러미 새싹, ria 및 somites에 특이적인 RIBA 프로브와 교배되었습니다.

이 이미지는 이 사례의 FGF 8에 특이적인 프로브와 교배된 13개의 솜미트 발달 단계에 있는 얼룩말 제브라피시 배아를 보여줍니다 A.In. tline kelon, dorsal Dion, Kelon midbrain, hind brain boundary, somites, tail bud에서 특정 염색이 관찰됩니다. 이 이미지는 신경계를 시각화하는 데 유용한 PAX 2 A.A 강력한 마커에 특이적인 프로브와 교잡된 수정 후 22시간 얼룩말 물고기 배아를 보여줍니다.

특정 염색은 맥락막 열구, 중뇌, 뒷뇌 경계, 이낭 및 척수 뉴런에서 볼 수 있습니다. 이 기술은 과정 일정에 따라 여러 실험실 세션에서 수행하도록 수정할 수 있습니다. 교실 밖에서 시간과 노력이 강사에 의해 요구될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후 전체 마운트와 C 2 하이브리드화를 학부 실험실로 가져오는 아이디어에 더 익숙해지기를 바랍니다. 학생들이 이러한 기술을 개발함에 따라 이 기술에 대해 알면 상위 부문 또는 대학원 연구 경험으로 전환하는 데 도움이 될 수 있습니다.