Name: 전체 마운트를 사용하여 현장에서 하이브 리다이 제이션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 학습하세요 제브라피시 배아에서 전체 마운트 현장 하이브리다이제이션(WISH)을 이용한 유전자 발현 패턴 관찰 방법을. 이 기술은 분자생물학과 생물체 발달을 연결하는 통합적 교육 도구입니다.

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저자는 비교 척추의 생물학 과정의 관리에서 역할에 대한 시러큐스 대학교 박사 매릴린 커에서 생물학 학부를 인정하고 싶습니다. 알버스톤 연구실은 노화에 대한 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소에서 국립 치과와 Craniofacial 연구 보건 / 국립 연구소의 연구소뿐만 아니라 부여 R01AG031922에서 부여 R21DE019223에 의해 지원됩니다.

1. cDNA 플라스미드 대상의 변환 부품 I : 플라스미드의 변환 (소요 시간 : 3 시간 플러스 하룻밤 배양) <ol><li> 42 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 SOC 영양소 국물 (반응 당 500 μL) </li><li> 얼음 유능한 세포를 해동 </li><li> 25 μL 관할 세포에 플라스미드 1 μL 추가 </li><li> 20 분 동안 얼음 플레이스 </li><li> 45 초 동안 42 ° C의 물을 욕조에 열 충격 세포 </li><li> 바로 이분을 위해 얼음에 세포를 장소 </li><li> 세포의 각 유리병 42 ° C 영양 국물 500 μL 추가 </li><li> ° C 분당 255 회전에서 2 시간 동안 (RPM) 37시 쉐이크 </li><li> Luria Bertani (LB) 한천 플레이트 접시에 75 μL 변환 믹스 </li><li> 부화 플레이트 37 ° C에서 거꾸로 하룻밤 </li></ol> 부 II : E. 콜리 문화 (소요 시간 : 15 분 플러스 하룻밤 배양) <ol><li> 문화 튜브에 각각 반응 나누어지는 3 ML의 LB의 국물과 50 MG / ML 암피실린 3 μL를위한 </li><li> 한천 플레이트에서 1 박테리아 콜로니을 다쳤고, 각 문화 튜브에 추가 </li><li> 37 문화 튜브를 흔들어 ° C를 255 RPM 하룻밤에 </li></ol> 파트 III : 플라스미드 준비 (소요 시간 : 1.5 시간) <ol><li> 5 프라임 FastPlasmid 미니 키트 (카탈로그 # 2300000)를 사용하여 야간 문화 플라스미드 분리 </li><li> 준비 플라스미드의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드 물들일 1 % 트리스 - 아세테이트 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (태) 겔의 키트에서 eluted DNA를 실행 </li></ol> 2. 원위치 발굴 - 표시 RNA 프로브 합성에서 부품 I : 플라스미드의 선형화 (소요 시간 : 2.5 시간) <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : <table border="1"><tbody><tr><td> 플라스미드 준비 </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> 제한 효소 * </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> 버퍼 ** </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 10X (BSA) </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 디에틸 Pyrocarbonate (DEPC) 물 </td><td> 58 ML </td></tr><tr><td></td><td> 100 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 37 ° C 2 시간 동안 부화 * 플라스미드에 따라 다릅니다 ** 제한 효소에 따라 다릅니다 </li></ol> 부 II : 전사 (소요 시간 : 3 시간) <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : <table border="1"><tbody><tr><td> 플라스미드 선형 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> 10X 전송 버퍼 ** </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> Digoxigenin 라벨 믹스 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> 효소의 * </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> RNase 억제제 </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> DEPC 워터 </td><td> 24 ML </td></tr><tr><td></td><td> 40 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> 효소의 * 2 μL 추가 </li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> DNase 2 μL 추가 </li><li> 37 품어 ° C를 20 분 * 플라스미드에 따라 다릅니다 ** 효소와 다름 </li></ol> 파트 III : 강수 (소요 시간 : 하룻밤 사이에 부화 1 시간 5 분 플러스 2 시간 원심 분리기하고 다시 정지) <ol><li> 0.2M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 μL 추가 </li><li> 4M 염화 리튬의 5 μL 추가 </li><li> 얼음 차가운 100 % 에탄올 150 μL 추가 </li><li> 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화 </li><li> 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기 </li><li> 7분에 대한 건조 펠릿 </li><li> 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지 </li><li> 37 품어 ° C를 5 분 </li></ol> 파트 IV : 분별화은 - 프로브 크기가 0.6 킬로바이트보다 큰 경우에만 수행 (소요 시간 : 대개, 프로브의 크기에 따라 20여 분 다름 없음) <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : <table border="1"><tbody><tr><td> RNA 프로브 </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> DEPC 워터 </td><td> 12 ML </td></tr><tr><td> 중탄산 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> 나트륨 탄산염 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td></td><td> 40 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 60 ° C의 물을 욕조에 품어. 방정식에서 배양 시간을베이스 : 시간 (min.) = (KB 시작 - 킬로바이트을 원하는가) / (KB X를 시작 0.11 x는 킬로바이트를 원하는) 평균 원하는 크기 = 0.6 킬로바이트 </li></ol> 파트 V : 최종 강수량 (소요 시간 : 5 분하룻밤 부화, 1 시간 백인 군대가 플러스 2 시간)을 원심 분리기 및 겔 전기 영동을 다시 중단 1 시간 <ol><li> 40 μL DEPC 물을 추가 </li><li> 8 μL 아세트산 나트륨을 추가 </li><li> 1.04 μL 빙초산 추가 </li><li> 240 μL 얼음 차가운 100 % 에탄올 추가 </li><li> 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화 </li><li> 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기 </li><li> 7분에 대한 건조 펠릿 </li><li> 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지 </li><li> 섞어 소용돌이 </li><li> riboprobe의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드와 1 %의 태 젤 자국에 다시 정지 솔루션을 실행 </li></ol> 3. 원위치 하이브리드화에서 전체 마운트 부품 I : 태아의 고정 및 Proteinase K의 소화 (소요 시간 : 수정 하룻밤 플러스 4시간 저장 다음날, 2.5 시간 창고에서 파트 II까지) <ol><li> zebrafish 배아를 개최 수집하고 4 박 4 % paraformaldehyde (PFA)에서 해결 ° C </li><li> 인산염에서 수정 배아를 씻어은 10 분마다 트윈 - 20 (PBSt) 3 회 0.1 %를 포함하는 호수 버퍼 </li><li> 세부적으로 밀고 집게를 사용하여 실험 시약 수동 dechorionate 배아 (필요한 경우)에 태아의 노출을 보장하기 위해 </li><li> 한 시간 만이라도 각 세척을 25 % 등급 일련의 세탁과 PBSt의 50 % 메탄올에 의해 배아를 탈수 후 -20 ° C에서 100 % 메탄올에 저장 </li><li> 때 사용할 준비가 50 % (2 회) 25 % (1 회) 10 분마다 PBSt의 메탄올로 세척하여 PBSt에서 배아를 rehydrate. 마지막으로 100 % PBSt 10 분만에 각 2 번 씻는다. 정확한 타이밍 PBSt / 메탄올 세척을위한 중요하지 않다 </li><li> 어두운 안료를 제거하는 PBSt에 10 % 과산화수소 용액, 필요한 경우에 블리치 배아. 배아는 배아의 연령에 따라 약 10-20 분 과산화수소 용액에 부화해야하며, microfuge 튜브의 뚜껑이 공기 압력의 빌드 - 업 방지하기 위해 열린 남아 </li><li> 50 MG / ML Proteinase K와 다이제스트 배아가 배아의 연령에 따라, 3-15 분 동안 PBSt에서 1:5000 희석 </li><li> 다음 다시 수정의 30 분 4퍼센트 PFA의 배아, 그리고 5 분 각각에 대해 PBSt 3 번 씻어 </li></ol> 부 II : Riboprobes의 하이브리드화 (소요 시간 : 3 시간 플러스 하이브 리다이 제이션을위한 야간, 1.5 시간 파트 III에 다음날) <ol start="9"><li> 2~3시간에 대한 preheated 70 ° C 물 목욕에 prehybridization 솔루션 (PHS)와 배아를 Prehybridize </li><li> , PHS를 제거 70 ° C 하룻밤에 품어 0.5 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션과 1.5 μL 이전 합성 Digoxigenin 표시된 riboprobes를 추가합니다. 온도 riboprobe 대상에 따라 몇도 이내에 수시로 바뀔 수 있습니다 </li><li> 그 다음날, 70 배아를 씻어 ° C 십분 각 2X 살린 - 나트륨 구연 산염 (SSC)의 PHS 75 % 50 %, 25 %의 등급 솔루션 후 68시 30 분 0.2X SSC의 세척 ° C </li><li> 상온 10 분 각 Maleic 산성 버퍼 (MAB) 2 회 세척 </li></ol> 파트 III : 안티 Digoxigenin (α - 발굴) 항체 인큐베이션 (소요 시간 : 3 시간 더하기 차단하는 숙박, 2.5 시간 파트 IV에 다음날) <ol start="13"><li> 12 잘 접시에 배아를 전송 </li><li> 상온에서 최소 3 시간 동안 1-2 ML 차단 솔루션에 사전 차단 배아 </li><li> 동시에,이 솔루션에서 차단 솔루션의 두 번째 볼륨을 준비하고 안티 - digoxigenin 항체를 1:2000 diluting하여 항체를 사전 차단 </li><li> 사전 블록을 제거하고 1-2 ML 사전 차단 α - 발굴 솔루션을 추가, 4 밤새 품어 ° C </li><li> 그 다음날, MAB에서 배아를 씻으십시오. 배아 처음 5 분 MAB에 부화 허용, 다음 버퍼 변경을 수행하는 두 십분 한 삼십분 한 60분 간격에 대한 부화. 정확한 타이밍이 필요하지 않습니다 </li><li> 오분 알카라인 인산 가수 분해 효소 (AP) 버퍼에 각 태아에게 3 회 와시 </li></ol> 파트 IV : 스테 이닝 및 최종 처리 (소요 시간 : 얼룩을 위해 하루 1 시간 사용 riboprobe에 따라 글리세롤의 세척, 글리세롤 세척 당 6-10시간의 시작 4 시간은 글리세롤에 저장되어있을 수 있습니다) <ol start="19"><li> 얼룩이 충분 때까지 배아에 1-2 ML의 얼룩 솔루션을 추가 호일로 접시를 포장하고, 정기적으로 (매 20 분)에 염색법 확인 </li><li> 얼룩 반응을 중지 5 분마다 PBSt 2 회와 배아 와시 </li><li> 배경 얼룩을 제거하는, 100 % 메탄올에 다음 25%에서 십분 세척 (1 시간) 50 % (2 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 배아를 탈수 </li><li> 배아는 상온에서 최소 2 시간 동안 100 %의 메탄올에 부화 허용 </li><li> 50 % 십분 세척 (2 회) 25 % (1 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 PBSt에 Rehydrate 다음 백퍼센트에 PBSt 2 번 씻어 </li><li> 스테인드 E를 전송4 등급 세척 일련의, 그리고 저장을 사용하여 PBSt에 80 % 글리세롤 솔루션 mbryos, ° C. </li></ol> 요리법 : <ul><li> LB 한천 플레이트 - 10g의 LB 한천 + 250 ML 증류수, 압력솥이 때 시원한 각 배양 접시에 15-20 ML 따뜻한 솔루션을 부어, 250 μL 암피실린를 추가, 한천이 응고 수 </li><li> LB의 국물 - 12.5 g의 LB 스프 + 200 ML 증류수, 압력솥은 사용하기 전에 냉각 허용 </li><li> 1% 태 젤 - 0.4 g 아가로 오스, 40 ML 1X 태, 2 μL ethidium의 브로마이드, 부하 7 μL 플라스미드 (cDNA 대상의 플라스미드 변환) 또는 3 μL riboprobe 4 μL DEPC 물 (현장 발굴 - 표시 RNA 프로브 합성에서) + 1 μL 로딩 염료, 5 μL DNA 사다리 </li><li> Prehybridization 솔루션 50 % 포름 아미드, 배 SSC, 9.2mM 구연산, 1 % 트윈 - 20 </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션 prehybridization 솔루션 플러스 500 μg / ML tRNA 50 μg / ML의 헤파린 </li><li> MAB - 100mM Maleic 산성, 150mM NaCl, 0.2M NaOH, 0.1 % 트윈 - 20, 7.5 산도 </li><li> MAB에 차단 솔루션 - 3 부품 MAB, 1 일부 10% Boehringer 차단 시약 1 일부 열 양고기 혈청을 비활성화 </li><li> 9.5에 AP 버퍼 60mM 트리스 - HCL의 산도, 60mM NaCl, 30mM MgCl 2, 0.1 % 트윈 - 20 </li><li> 얼룩 솔루션 - 5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - 인돌릴 인산염 (BCIP) 및 니트로 파란색 tetrazolium (NBT) AP 버퍼 </li></ul> 4. 대표 결과 제대로 수행되면, NBT, BCIP, 그리고 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 반응은 자주색 얼룩으로 zebrafish 배아에 나타납니다 보라색 침전물을 형성합니다. Riboprobes는 이전에 다음 ID로 관심의 유전자에 해당하는 cDNA의 합성해야합니다. 따라서, 그것은 어떤 얼룩 시각 관심의 유전자가 특정 발달 단계에서 베꼈는데되어있는 zebrafish의 영역을 나타냅니다 체결하실 수 있습니다. fgf8a (Reifers 외, 1998,,. 그림 2) deltaC (오츠 외, 2005).이 과정의 목적을 위해 riboprobes는 aldh1a2 (; Begemann 외, 2001;. 그림 1 이전 raldh2)에서 합성되었다; myod1 (와인버그 외, 1996.) shha (. 크라우스 외, 1993), pax2a (브랜드 외, 1996;. 그림 3)과 myl7 (이전 cmlc2;. Yelon 외, 1999) cDNA. 얼룩은 정중선과 somites, tailbud, myotome, 뇌, 심장을 포함한 해부 학적 구조를 예상했다. Ace/fgf8a의 돌연변이가 이러한 구조의 많은 결함을 가지고 것으로 예상했다. 얼룩이 쉽게 표준 해부 현미경을 사용하여 시각되었습니다. (Schoenwolf 2009.; D' 코스타 외, 2009;, Schmoldt 외, 2009. 클락, 2003) 추가 소스는 여기에 설명된 것과 유사한 기법을 기원에 대한 자세한 내용 및 문제 해결을 포함합니다. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> aldh1a2 특정 riboprobes와 hybridized되어 그림 1. zebrafish 배아 24 시간 게시물 수정. 구체적인 얼룩은 눈, hindbrain, 가슴 지느러미 봉오리 primordia 및 somites에서 볼 수 있습니다. 앞쪽에이 최고입니다, 후부는 바닥입니다. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. fgf8a위한 프로브 특정 함께 hybridized되었습니다 발전 13 체절 단계에서 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 telencephalon, 지느러미 diencephalon, midbrain - hindbrain 경계, somites 및 tailbud에서 본 것입니다. 복부의 왼쪽이며, 지느러미는 올바른 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. pax2a, 신경 시스템을 시각화하는 데 유용 강력한 마커에 대한 riboprobe의 특정과 hybridized되었습니다 22 시간 게시물 수정의 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 맥락막의 균열 (fissure), midbrain - hindbrain 경계, 귀의 소포 및 척수에있는 뉴런에서 볼 수 있습니다. 왼쪽 앞쪽에와 도설 볼 수 있습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

원하는데로 학생 알려진 유전자 발현 패턴의 시각화를 통해 해부 개발 유전자의 역할을 이해하는 데 도움을 비교 척추의 생물학 실험실 과정에 사용되었다. 과정의 첫번째 부분을 위해, 학생들은 그들이 충분한 시간이, 공부 이해 비교 및​​ 대비 척추의 해부학 수 있도록 여러 가지 chordate의 taxa를 대표하는 생물체에 대한 해부를 수행했습니다. 과정의 두 번째 부분에 대한 소개로, 학생들은 zebrafish 개발과 해부학을 설명하는 공식적인 강의를 제공했다. 기원 실험의 방법과 예상 결과도 논의되었습니다. 학생들은 다음 somitogenesis과 발전의 프림 - 6 단계에서 라이브 zebrafish을 받았고, 2 5 일 포스트 수정 (DPF)의 해부 현미경으로 검사합니다. 이것은 학생들에게 zebrafish 배아는 생김새의 더 나은 이해와 ontogeny 이상 발생하는 형태학의 변경 사항의 유형을 제공하는 것이었다. 다음 실험실 세션에서, 학생들은 좋겠는 이전에 다음 ID로 수행했다하는 zebrafish 배아를 부여했다. 그들은 관심의 각 유전자 (riboprobe 사용)에 대한 유전자 발현 패턴을 연구하고 설명하도록 요청했다. 좋겠어에 사용되는 배아는 heterozygous ace/fgf8a 라인의 구성원 사이에 matings에서 파생되었습니다. Mendelian 상속에 따르면, ace/fgf8a의 matings에서 배아의 25 %가 homozygous 돌연변이로이 과정에서 집중 해부 구조의 많은 결함을 전시 것으로 예상했다. 알버스톤 실험실에 게시된 보고서 및되지 않은 관찰 결과에 따르면, 뇌 및 부적 절한 심장 루핑의 결함뿐만 아니라 somites 결함 (.; 알버스톤과 Yelick, 2005; 개인 관측 브랜드 외, 1996)으로 예상했다. 학생들은 제시 각 유전자 발현 패턴에 대한 모든 표본, 야생 종류 (heterozygous 동물이 개발의 초기 단계에서 야생 타입 형제로부터 구별할 수 있습니다) 및 homozygous 돌연변이를 조사하도록 요청했다. 그들은 그들의 결과를 설명하는 실험실 보고서를 작성하도록 요청하고, 결함이있는 유전자 발현은 해부 학적 기형을 시켰던 수 있습니다 방법은 해부학과 유전학의 지식을 바탕으로했다. 학생들은 흥분과 호기심이 실험실 연습을받을 것 같았다. 대부분의 이전 좋겠 사용하지 못한 매우 과정의이 부분에 관심이 있었다. 학생들은 흥미로운 zebrafish 배아의 유전자 표현의 다양한 패턴을 발견, 일부도 설명 얼룩 패턴은 웃는 얼굴로 잘 알려진 디자인과 기호, 그들을 연결하여 시각. 그 결과 검사 결과는 학생들이 소원 프로토콜과 특정 해부 학적 구조 유전자의 표현에 대한 일반적인 이해를했다 보여주었다. . Huelsken 외, 2002,,. Geetha - Loganathan 외, 2008a;.. Geetha - Loganathan 외, 2008b 학생은 또한 유전자의 특정 기능을 이해하는 데 필요한하던 연구실 (스틱니 외, 2000 동안 소원을 사용하는 공부 ). 그것은 일부 학생들이 제한된 배경 신호 경로에 대한 지식과 관심의 유전자를했다, 그러나 분명했다. 이러한 개념에 대한 자세한 내용은 기초 강의 향후 비교 척추의 생물학 과정에있는 소망의 사용에 오신 것을 환영합니다 외에도 수 있습니다 좋겠어. 프로토콜은 일반적으로 과정의 일정에 따라 연속 4 일 걸리므로, 학생은 수업 및 강사는 나머지에 대한 책임 있어야합니다에서 실험의 일부를 완료하실 수 있습니다. 교육 도우미는 모든 앞의 단계를 수행하는 동안 우리의 비교 척추 생물 수업에서 학생들은 실험실에서 얼룩 반응을 완료했습니다. 그것이 수행 수업 시간에 원하는 학생을 위해 선호하는 경우, 프로토콜은 클래스의 기간에 따라 여러 실험실 세션을 통해 수행할 수 있습니다 subunits로 나눌 수 있습니다. 여기 연구실 회의 한 번만 일주일에 의한되면서 학생들이 전체 프로토콜을 수행하는 것이 가능하지 않으면, 학생들이 사용 riboprobe에 따라 클래스의 시작 부분에 얼룩 솔루션을 추가할 수 있고, 얼룩이 완료했습니다 한 시간. 그것이 개발에 얼룩을 위해 소요되는 시간은 각 riboprobe 및 실험 조건의 다양한 크게 다르며, 그리고 수업 전에 정해진해야합니다. 특히, 학생은 실험실에있는 얼룩을 개발 될 경우, 교원은 교실 밖에서 상당한 시간과 노력을 요구할 것입니다 모든 이전 단계에 대해서는 책임을지지 않습니다. 원하는 경우, 소원을 짧은 대안은 그러나 현재로서는, 발달 유전자에 대한 zebrafish 특정 항체가 쉽게 사용할 수 없습니다, 단백질 지방화를 시각화하는 항체 레이블을 사용하여 immunohistochemistry 수 있습니다. 또 다른 옵션은 다른 척추 동물의 소원을 수행하는 것입니다ND는 학생들이 다른 생물에서 같은 유전자의 표현 패턴을 비교했습니다 (.; 아라 마키 외, 2007;. 이머징 모델 생물 2008; Pizard 외, 2004 신흥 모델 생물, 2010). 사용 overarching 목표는 비교 척추의 생물학 과정에서 분자 생물 학적 기법 해부 개발을 연구하는 데 사용되는 방법을 학생들에게 보여주는 좋겠어요. 또한 유전자 발현뿐만 아니라 발달 기형뿐만 아니라 진화의 변화가 발생할 수 있습니다 방법 변경에 대해서 추측 학생들을위한 기회를 제공했습니다. 진화 발달 생물학 (종종 &quot;에보 (Evo) - devo&quot;이라고 함)과 같은 공식, 연구의 빠르게 성장하는 분야는 개발을 통해 유전자형 및 표현형를 연결하고, 진화 변화의 잠재적인 기계론의 기지를 명료하게하다하는 것을 목표로하고있다. 이 분야의 상승으로 더 많은 생태학, organismal 생물학 및 physiologists들은 연구에 분자 기술을 채용하고 있습니다. 우리는 비교 척추의 생물학 과정에있는 소망의 사용이 연구에 현재의 기술 및 개념적 발전과 날짜, 및 생물 학적 subfields를 결합하여 상위 수준의 생물학 과정의 더 나은 수평 정렬을 촉진하기 위해 교과 과정을 유지하는 데 도움이됩니다 주장하고있다. 또한,이 통합 방식은 좀 더 다양 교육과 미래 학제 과학 연구의 진흥에 선도적인 학생 한 과정에서 생물 학적 연구 기법의 구색를 배울 수있는 기회를 제공할 것입니다.

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

현장 하이브리드화의 전체 마운트 (소원) 전체 마운트 표본 내의 특정 mRNA의 성적의 지방화를 통해 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 분자 생물학 연구소에서 일반적인 기법입니다. 이 기술은 (알버스톤와 Yelick, 2005 적응) 시러큐스 대학에서 상위 수준의 학부 비교 척추의 생물학 실험실 교실에서 사용되었습니다. 비교 척추의 생물 실험실 코스의 처음 두 3가 학생들에게 주로 전통적인 해부와 모델의 사용을 통해 다양한 chordate의 taxa를 대표하는 여러 생물의 발생학 및 총 해부학을 공부하는 기회를 주었다. 코스의 마지막 부분 소원이 zebrafish 배아에서 수행어진 분자 기법을 고용 척추 개발의 관찰을 통해 해부학을 가르치고하는 혁신적인 접근 방식을 참여. heterozygous fibroblast의 성장 인자 8 (fgf8a) 돌연변이 라인, 에이스가 사용되었습니다. Mendelian 상속으로 인해, 에이스 제작 야생 유형, heterozygous 및 1시 2분 1초 비율 homozygous ace/fgf8a의 돌연변이를 intercrosses. 정중선과 같은 심장, somites, tailbud, myotome, 그리고 두뇌와 같은 해부 학적 구조를 개발 알려진 표현식 패턴과 RNA 프로브가 사용되었습니다. 원하는데로 학생들이 수업 시간에 얼룩 반응을 수행과 함께, 13 체절과 프림 - 6 단계에서 zebrafish를 사용하여 수행되었습니다. 개발의 다른 단계에 zebrafish 배아의 연구는 학생들에게 이러한 해부 학적 구조 ontogeny 이상의 변화 모습을 관찰하는 능력을했다. 또한, 일부 ace/fgf8a의 돌연변이가 부적 절한 심장 반복하고, 체절과 두뇌 개발에 결함이 표시됩니다. 이 실험실에있는 학생들은 모두 외부 해부학뿐만 아니라 유전자 발현 패턴을 사용하여 여러 장기 시스템의 정상적인 발전을 관찰했다. 그들은 또한 부적 절한 해부 개발과 유전자 발현을 (즉, putative 돌연변이) 표시 배아를 파악하고 설명했다. 이미 필요한 장비를 소유하지 기관이나 연구소 및 curricular 혁신을위한 자금이 부족한 지도자 들어, 시약 및 장치의 금융 비용으로 시간과 노력이 부분에 필요한 것입니다 고려하는 요소 수 관계 설정의 강사. 그럼에도 불구하고, 우리는 교실 실험실 설정이 유형의 소망의 사용이 발달 유전 해부학 사이의 중요한 연결을 제공할 수 있다고 주장. 기술 진보와 분자 수준에서 organismal 개발을 연구하는 능력보다 쉽게​​, 저렴하고, 점점 인기가되면서, 많은 진화 생물학, 생태학, 그리고 physiologists는 분자 생물학 분야의 연구 전략에 의존하고 있습니다. 비교 척추의 생물학 연구실 교실에서 사용하면 좋겠 분자와 해부학 하나의 코스 내에 수렴하는 방법의 한 예입니다. 이것은 상위 수준의 대학 학생들에게보다 다양 교육과 미래 학제 과학 연구의 진흥에 선도적인 현대 생물 학적 연구 기법을 연습할 수있는 기회를 제공합니다.

전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브 리다이 제이션 (좋겠어)는 해부를 척추 이외에 상위 레벨의 본과 비교 척추의 생물학 과정에 사용되었다. 이것은 학생들이 한 과정 내에서 분자와 organismal 생물학의 연구를 연결뿐만 총 해부학과 같은 유전자 발현 패턴을 연구하는 기회를 주었다.

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

전체 마운트 인시투 하이브리다이제이션(Whole mount in situ hybridization, WISH)은 ...의 위치 파악을 통해 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 분자생물학 실험실의 일반적인 기술입니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제브라피쉬 배아의 특정 발달 단계 동안의 유전자 발현 패턴을 관찰하는 것입니다. 이는 우선 관심 있는 mRNA에 digoxigenin으로 표지된 antisense 리보프로브를 하이브리드화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 해당 리보프로브를 검출하는 것입니다.항체에 결합된 doxygen용 항체는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 효소와 접합되어 있습니다. 절차의 세 번째 단계는 NBT와 BCIP를 추가하여 염색하는 것이며, 이들은 알칼리성 포스파타아제 효소와 반응하여 불용성 보라색 침전물을 형성합니다. 절차의 마지막 단계는 충분히 염색된 배아를 메탄올에서 배양하여 비특이적 염색을 줄이는 것입니다.결과적으로, 전신 마운트-인-시투 하이브리다이제이션(whole mount in situ hybridization)을 통해 발달 단계별 제브라피쉬 배아 전체에서의 유전자 발현 패턴을 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술이 기존의 조직학적 시연이나 해부와 같은 전통적인 수업 방식보다 갖는 주요 장점은, 학생들이 분자 생물학과 유기체의 발달 및 진화 경향 사이의 개념적 가교를 형성할 기회를 제공함으로써 진정으로 통합적인 경험을 가능하게 한다는 점입니다. 이러한 방법들은 전통적으로 소수의 모델 생물 연구에 사용되어 왔으나, 다른 비모델 생물에도 쉽게 적용하여 척추동물 분류군 전반에 걸친 발달 경로의 보존성과, 이러한 경로가 어떻게 편차를 일으켜 진화적 참신함으로 이어지는지를 이해하는 데 활용될 수 있습니다.이 방법은 학부생들에게 생소할 수 있어 처음에는 어려움을 겪는 학생들이 있을 수 있지만, 이 방법을 익히면 학부 연구 경험과 전공 심화 과정에서 큰 도움이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 전송 파이프를 사용하여 약 50개의 제브라피쉬 배아를 마이크로 폐기물 튜브로 옮깁니다. 과잉 액체를 제거한 다음, 4% para formaldehyde 1.5 milliliters를 튜브에 피펫으로 넣습니다.배아가 든 튜브를 실온의 교반기에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날 아침, 고정액을 제거하여 버립니다. 세척을 위해 0.1% tween 20이 포함된 1.5 milliliters의 인산염 완충 식염수를 배아에 첨가합니다.필요한 경우 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 배아를 수동으로 코팅하고, 전송 피펫을 사용하여 코팅된 배아를 깨끗한 마이크로 퓨즈 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 25% methanol과 PBST 1.5 milliliters를 튜브에 피펫팅합니다. 1시간 동안 배양한 후, 배아를 건드리지 않고 이 용액을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다.그런 다음 PBST 내 50% methanol 1.5 milliliters로 교체하고 최소 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로 100% methanol 1.5 milliliters로 교체한 후 minus 20 degrees Celsius에 보관합니다. 배아는 minus 20 degrees Celsius의 methanol에 보관할 수 있습니다.사용 준비가 되면, 튜브에서 메탄올을 피펫으로 흡입하여 제거하고 피펫을 폐기하십시오. 튜브에 50% methanol/PBST를 넣고 10분 동안 배양합니다. 이 과정을 반복하여 두 번째 세척을 수행한 후, 용액을 흡인하고 25% methanol/PBST로 배양을 반복하십시오.마지막으로, 100% PBST에서 10분씩 두 번 세척한 후, PBST에 10% 과산화수소 용액을 준비합니다. 배아의 연령에 따라 10분에서 20분 동안, 마이크로 튜브 캡을 열어둔 상태로 제브라피쉬 배아를 실온에서 이 용액에 담급니다. 어두운 색소 침착을 제거하기 위해, 전이 피펫을 사용하여 과산화수소 용액을 제거하고 버립니다.반응을 중단시키기 위해 배아를 1.5 milliliters의 PBST로 여러 번 헹굽니다. 50 milligram per milliliter 농도의 proteinase K 스톡 용액을 PBST로 1:5,000 비율로 희석합니다. 일반적으로 4.999 milliliters의 PBST에 1 microliter의 proteinase K를 혼합합니다.배아에서 PBST를 제거합니다. 전이 피펫을 사용하여 기존 용액을 버리고 1.5 milliliters의 proteinase K 솔루션을 튜브에 추가합니다. 배아의 연령에 따라 실온에서 3분에서 15분 동안 배아를 proteinase K 솔루션에 침지시킵니다.PBST로 여러 번 세척하여 반응을 중단시킵니다. 그런 다음 PBST를 제거하고 배아를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 30분 동안 실온에서 담가 재고정시킨 후, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 파라포름알데히드를 제거하고 버립니다. 배아에 PBST 1.5 milliliters를 첨가하고 5분 동안 세척합니다.바이알에서 PBST를 조심스럽게 피펫으로 옮겨 제거합니다. PBST를 사용하여 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 그 다음 rip 프로브 하이브리다이제이션을 진행하기 위해 워터배스를 70 °C로 예열하고 하이브리다이제이션 전 처리 용액을 준비합니다.그런 다음 전이 피펫을 사용하여 PBST를 제거하고 버립니다. 배아를 0.5 milliliters의 사전 하이브리드화 용액에 담그고 70 °C 항온수조에서 2~3시간 동안 배양합니다. 이때 배아가 흐트러지지 않도록 주의하십시오.마이크로 폐기물 튜브에서 전-잡종화 용액을 피펫으로 흡입하여 제거합니다. 잡종화 용액 0.5 milliliters를 튜브에 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 라벨이 붙은 ribo에 미리 합성된 doxygen을 빠르게 첨가합니다.튜브 내 프로브 농도가 약 1 µg/mL인 ribo 프로브를 사용합니다. 70 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 2× saline sodium citrate 내의 75%, 50% 및 25% PHS 용액과 2× SSC 및 0.2× SSC 용액을 준비합니다.70°C 항온수조에서 추가 솔루션들을 가온합니다. 솔루션의 온도가 70°C에 도달하면 항온수조에서 꺼냅니다. 그다음 튜브에서 하이브리드화 솔루션을 흡입하여 폐기합니다.각각의 가온된 P-H-S-S-S-C 용액 0.5 milliliters를 첨가하고, 각 용액에서 배아를 70 degrees Celsius로 10분 동안 배양합니다. 마지막으로, 0.2 times SSC 용액에서 배아를 68 degrees Celsius로 30분 동안 배양합니다. 튜브에서 0.2 times SSC 용액을 흡입하여 제거합니다.배아를 pH 7.5의 말산 완충액 1.5 mL에 넣고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이 과정을 반복하여 두 번째 세척을 수행합니다. 작성된 프로토콜에 따라 블로킹 용액을 준비합니다.MAB에 담긴 배아를 12-well plate의 각 웰로 옮깁니다. 과량의 MAB를 제거하고, 각 웰에 블로킹 용액 1~2 mL를 피펫으로 넣습니다.상온에서 교반하며 최소 3시간 동안 배양하십시오. 항원을 남은 블로킹 용액을 사용하여 1:2000 비율로 항체에 희석하십시오. 상온에서 부드럽게 교반하며 최소 3시간 동안 배양하십시오.배아를 건드리지 않도록 주의합니다. 플레이트의 웰에서 블로킹 솔루션을 피펫으로 흡입하여 제거합니다. 이전에 준비한 anti-doxygen 항체와 블로킹 솔루션을 웰에 조심스럽게 피펫팅한 후, 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 배아를 1.5 milliliters의 말산 완충액으로 다섯 번 세척합니다. 배아를 말산 완충액에서 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 완충액을 교체하고 10분씩 두 번 배양합니다.30분과 60분 간격으로 각각 한 번씩 수행합니다. 웰에서 최종 세척액인 meic acid 완충액을 흡입하여 제거하고 피펫을 버립니다. 1.5에서 2 mL의 알칼라인 포스파타아제 완충액을 웰에 넣고 5분 동안 배양합니다.이 과정을 두 번 반복합니다. 알칼라인 포스파타아제 완충액을 제거하고 웰에 1.5~2 mL의 염색액을 첨가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트 전체를 알루미늄 호일로 감싸고 20분 간격으로 부드럽게 흔들어 줍니다.교반을 중지하고 해부 현미경으로 배아를 관찰하여 염색이 충분히 되었는지 확인합니다. 충분한 염색이 확인되면 웰에서 염색 용액을 피펫으로 흡입하여 제거합니다. 염색 반응을 중지시키기 위해 PBST로 교체합니다.다른 부피의 PBST로 세척 과정을 반복한 후, 웰에서 PBST를 피펫으로 옮겨 버려 배아를 탈수시킵니다. 25% methanol/PBST 1.5~2 mL를 웰에 넣고 10분 동안 배양합니다. 50% methanol/PBST로 이 과정을 두 번 더 반복하며, 각 세척 시 10분 동안 배양합니다. 그 후 비특이적 염색을 줄이기 위해 배아를 100% methanol로 옮겨 최소 2시간 동안 배양합니다.배양 후, 웰에서 메탄올을 피펫으로 흡입하여 제거함으로써 배아를 재수화합니다. 50% 메탄올이 포함된 PBST로 2회 세척하고, 이어서 25% 메탄올이 포함된 PBST로 각 10분씩 세척합니다. 그 다음 100% PBST로 10분씩 2회 세척합니다.마지막으로, 단계별 세척 과정을 거쳐 염색된 배아를 PBST 내 80% glycerol 용액으로 옮긴 후, 관찰 시까지 4°C에서 보관합니다. 제대로 수행되었다면, 목적 유전자의 발현은 제브라피시 배아에 나타나는 보라색 염색으로 확인할 수 있습니다. 이 이미지는 개인화 후 24시간이 지난 제브라피시 배아를 보여주며, AAL DH one A two에 특이적인 RIBA 프로브로 하이브리드화되었습니다. 눈, 후뇌, 가슴지느러미 눈(pectoral fin bud), ria 및 체절(somites)에서 특이적 염색을 확인할 수 있습니다.이 이미지는 FGF eight A 특이적 프로브로 하이브리드화한 발달 13 체절 단계의 얼룩말 제브라피쉬 배아를 보여줍니다. 이 경우, tline kelon, dorsal Dion, Kelon 중뇌, 후뇌 경계, 체절 및 꼬리 싹에서 특이적 염색이 관찰됩니다. 이 이미지는 PAX two A 특이적 프로브로 하이브리드화한 수정 후 22시간 된 제브라피쉬 배아를 보여줍니다. 이는 신경계를 시각화하는 데 유용한 강력한 마커입니다.숙련되면 맥락막틈, 중뇌, 후뇌 경계, 귀포 및 척수 뉴런에서 특이적 염색을 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 강의 일정에 따라 여러 번의 실험 수업에 걸쳐 수행하도록 수정할 수 있습니다. 강사의 판단에 따라 수업 시간 외의 시간과 노력이 필요할 수 있습니다.이 영상을 시청함으로써 학부 실험실에 전 표본(whole mount) 및 C2 하이브리드화를 도입하는 개념에 대해 더 친숙해지셨기를 바랍니다. 학생들이 이러한 기술을 습득함으로써 본 기법을 익히는 것은 상급 과정이나 대학원 연구 경험으로 이행하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

마우스 조직에서 데이터 수집을 최대화하기 위해 다양한 기술의 조합이 제공됩니다.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

학습하세요 제브라피시 배아에서 전체 마운트 현장 하이브리다이제이션(WISH)을 이용한 유전자 발현 패턴 관찰 방법을. 이 기술은 분자생물학과 생물체 발달을 연결하는 통합적 교육 도구입니다.

전체 마운트를 사용하여 현장에서 하이브 리다이 제이션

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