Name: 확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 학습하세요 사람 말초혈 NK 세포의 효율적인 확장 및 정화 방법을 통해 기능적 세포독성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 21일간 21,000배의 세포 확장을 달성하여 암 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 초기 K562 aAPC 및 mIL21 퓨전 벡터를 만드는 그들의 작업에 로렌스 쿠퍼, Harjeet 싱, 그리고 렌카 Hurton 감사하고 싶습니다. 이 작품에 대한 자금은 UT MD 앤더슨 의사 과학 프로그램, 세인트 Baldrick의 재단, 그리고 프렌즈의 전설에 의해 제공되었다.

1. 버피 코트에서 PBMCs의 분리 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 leukapheresis에서 파생된 건강한 기증자 버피 코트를 샘플에서 Ficoll - Paque에 대한 낙관적인 밀도 원심 분리하여 얻을 수 있습니다. <ol><li> Ficoll - Paque 원심 분리는 사소한 수정 따라 제조 업체의 프로토콜로 이루어집니다. </li><li> 140 ML (일반 버피의 코팅 량이 40-70 ML합니다)의 최종 볼륨 혈액 은행 버피 코트를 정상 기증자에 PBS를 추가합니다. </li><li> 레이어 Ficoll - Paque (4 튜브) 15 ML에 버피의 외투 샘플 35 ML. </li><li> 브레이크없이 20 분 동안 400g의 원심 분리기. </li><li> Ficoll - Paque에서 PBMCs 복구 : 플라즈마 인터페이스를 Ficoll - Paque의 하단에있는 RBCs을 삭제하지 않습니다. </li><li> 10 분 400g 각 시간을 centrifuging, PBS로 PBMCs 세 번 씻으십시오. </li><li> PBMCs는 (제 4) RosetteSep에 의해 격리 수있는이 단계에서 NK 세포 확장 또는 NK 세포에 대한 직접 사용할 수 있습니다 </li><li> 남은 PBMCs는 액화 질소에 10 % DMSO를 포함 FBS에 냉동 수 있습니다. </li><li> Ficoll을 대기음 두 50 ML의 원심 관에 5 단계에서 RBCs를 수집, PBS (50 ML 표시 추가)로 세 번 씻어, 각 시간 RBC 계층의 맨 위에는 granulocytes를 제​​거 뜨는 감추고 대기음. </li><li> RBCs는 NK 세포의 RosetteSep  정화 (4 항 참조)에 즉시 사용 또는 4 알서버의 솔루션의 같은 볼륨에 저장할 수 있습니다 ° C 나중에 사용하기 위해 (RBCs 4 주 최대 저장할 수 있습니다.) </li></ol> 2. NK 셀 확장 NK 세포 확장이 PBMCs를 사용하거나 NK 세포를 정화 시작하실 수 있습니다. 확장에 사용 PBMCs의 금액이 세 주 확장의 끝에 원하는 NK 세포의 크기에 따라 다양 수 있습니다 자세한 내용은 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오. (참고 1 참조) 자극 하나 주 영 <ol><li> 확장 각 5x10 6 PBMCs, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 10x10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다. </li><li> 우편 조사, NK 세포 확장 미디어 (NKEM)에 PBS와 resuspend로 세포를 씻어. </li><li> 10x10 6 조사 K562 Cl9 T75 플라스크에 NKEM 40 ML에 mIL21 (1시 2분 비율)과 37 인큐베이터에 똑바로 놓으 ° C와 5% CO 2.와 종자 5x10 6 PBMCs </li></ol> 일 3과 5 <ol start="4"><li> 5 분 400g에 원심 분리하여 세포를 복구하고 신선한 NKEM으로 미디어의 절반을 교체 (전체 미디어 볼륨에 대한 신선한 IL2 추가)과 문화를 계속합니다. </li></ol> 자극이 일 6.25 <ol><li> 1 주일 끝에 문화에 세포의 수를 계산합니다. </li><li> 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5x10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두 </li><li> restimulated하는 각 5x10 6 셀, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 5x10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다. </li><li> (참고 3 참조) 2.5x10 5 총 세포 / ML에서 NKEM의 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율)과 resuspend의 동일한 숫자를 추가합니다. </li><li> T75 flasks의 종자 세포 (플라스크 당 최대 50 ML)를. </li></ol> 10 12 일 <ol start="6"><li> 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM로 전체 미디어를 변경합니다. </li></ol> 일 14 <ol start="8"><li> 확장 2 주의 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5x10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두 </li><li> 확장이 PBMCs에서 시작된 경우 NK 세포는 RosetteSep 정화 프로토콜 (제 IV 참조)를 사용하여 확장이 단계에서 정화 수 있습니다. 확장은 자극 3 진행 NK 세포를 정화로부터 시작되었습니다하십시오. </li><li> 정화는 NK 세포 (8 단계에서와 같이)의 순도를 확인 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 별도 5x10 5 세포를 설정하면. </li><li> 정화 NK 세포의 모든 (참고 4 참조)를 사용하여 자극 3 진행합니다. </li></ol> 자극 3 <ol><li> 휴대폰 번호에 따라 NKEM에서 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율) (참고 3 참조) Resuspend NK 세포. </li></ol> 17 19 일 <ol start="2"><li> 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM와 미디어를 변경합니다. </li></ol> 일 21 <ol start="4"><li> 확장 세 주 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> 전체 NK 세포 phenotyping 항체 패널 유동세포계측법 분석을위한 1x10 6 세포를 (표 1 참조) 복구. </li><li> 나중에 사용하기 위해 유리병 당 5x10 7 세포의 최대 농도에서 10 % DMSO를 포함 FBS에서 세포를 고정. </li></ol> 3. NK 세포 세포 독성 분석 <ol><li> NKEM의 NK 세포와 씨앗의 유리병, PE하기 전에 하루 해동복구를 허용 세포 독성 분석을 rforming. </li><li> 하나의 타겟 세포 라인, 6x10 5 NK 세포 3x10 오 대상 세포를 사용하여 각 NK 세포 세포 독성 분석을 위해 (주 5 참조)가 필요합니다. </li><li> NKEM에 Calcein - AM (재고 1 DMSO에 MG / ML)을 (참고 6 참조) diluting하여 CAM - 미디어를 준비합니다. </li><li> (주 7 참조) CAM - 미디어 1 ML 10 6 타겟 세포를 Resuspend. </li><li> 가끔 잡고, 37 ° C에서 1 H에 대한 부화. </li><li> Resuspend NK의 1x10 6 셀 / ML에서 세포 및 U - 하단의 3 우물 각 NK 세포 현탁액의 200uL을 추가 96 - 웰 플레이트에 해당 to10 : 1 E : 그림 1에 표시된 T 비율. (주 8 참조) </li><li> "최대"를 제외한 모든 나머지 우물에 완전한 미디어 100uL을 추가합니다. </li><li> "최대"로 2% 트리톤의 100uL X - 100을 추가합니다. </li><li> 5 후속 E에 대한 NK 세포의 시리얼 dilutions를 수행합니다 : 세포의 100uL 때마다 전송하여 T 비율은 잘 섞는다. 마지막 우물 (0.3125:1의 T 비율 E)에서 100uL 폐기하십시오. </li><li> calcein 로딩 1 시간 후, 1200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 NKEM의 목표 세포를 씻으십시오. (참고 9 참조) </li><li> 1x10 5 셀 / ML에서 대상 세포와 resuspend를 다시 계산합니다. </li><li> (1x10 4 / 잘) 각 잘하는 대상 세포 100 μL를 추가합니다. 세포 접촉을 시작 100g 1 분 원심 분리기. </li><li> 37 품어 ° C, 5 % 4 시간 CO 2. </li><li> 균일 출시 calcein을 중지하기 위해서는 100 μL pipetter로 pipetting하여 부드럽게 문화를 혼합, 펠릿 세포 5 분 100g에 접시를 스핀 다운하여 거품을 피하기 위해 관리하는 새 접시에 뜨는 100 μL를 전송합니다. 미세 바늘을 사용하여 양식을 수있는 거품 팝. </li><li> 형광 플레이트 리더 (여기 필터 485 NM, 방사 필터 530 NM)를 사용하여 번호판을 읽어보십시오. 히프 읽기를 권장합니다. </li><li> X 100. - [/ (시험 자료 - 자연 릴리스) (자발적인 자료 최대 릴리스)] 공식에 따라 특정 용해 비율을 계산 </li></ol> 4. RosetteSep하여 NK 세포 정제 <ol><li> 50 ML 튜브 (PBMC 100:1 RBC)로, PBMCs 또는 확장 세포의에 RBCs의 100 배 초과를 가져가라. </li><li> 사용 신선한 RBCs 다음 단계로 바로 진행하거나 RBCs가 알서버의 솔루션에 저장된이라면 1,200 rpm으로 centrifuging, RBCs의 수를 계산하고 (100 배 초과) 2퍼센트 FBS와 세 번 보충 PBS로 RBCs의 양을 적절한 세척하는 경우 십분 때마다. </li><li> 단계 1.7 또는 PBS 단계에서 2.10에서 확장된 세포에서 PBMCs와 RBCs를 결합 + 2% FBS PBMCs 또는 확장 셀 5x10 7 당 1 ML의 마지막 볼륨. </li><li> RosetteSep의 1μL PBMCs 또는 확장 셀 1x10 6 회  인간 NK 세포 농축 칵테일을 추가합니다. </li><li> 잘 믹스하고 5 분마다 혼합 부드러운 20 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> 같은 부드럽게 PBS + 2% FBS 믹스의 볼륨과 Ficoll - Paque 상단에 레이어를 추가합니다. </li><li> PBMC 분리에 대한 설명 Ficoll - Paque 원심 분리의 단계 (제 I)를 반복합니다. </li><li> 정화 후 복구 NK 세포를 카운트하고 북한 세포 순도 (8 단계)에 대한 유동세포계측법에 의해 phenotpying에 대한 5x105 세포를 따로 설정할 수 있습니다. </li></ol> 5. 노트 참고 1. NK 세포가 PBMCs에서 직접 확장 또는 RosetteSep  정화 NK 세포에서하실 수 있습니다. 우리는 유사한 확장 효율성을 지적했지만 어떤 장기 기증자가 확장 이전 RosetteSep로 어려움 정화의 결과로 매우 낮은 NK 세포 번호가있을 수 있습니다. 참고 2. 우리는 일상적 인 경우에는 3 번 CD에 들어 음수 및 CD16 또는 CD56 양성하는 것과 같은 NK 세포를 열거, 확장하는 동안 phenotyping에 대한 CD56 - FITC, CD16 - PE, 그리고 인 경우에는 3 번 CD - PE - Cy5를 사용합니다. 참고 3. 각 매체 변경하거나 자극에서, 2.5 × 10 5 / ML에 resuspend 세포는 확장의 최고 단계에 ML 당 또는 2 백만 이하 NK / PBMC 휴대폰 번호를 유지합니다. 이것은 영양분의 고갈을 방지하고 최대한의 확장과 생존을 달성하는 데 도움이됩니다. 참고 4. NK 확장 속도 stimulations 1 또는 냉동 수있는 세포의 2 부분의 끝에 기증에 의존하고 있으며, 일부는 실험이 필요에 따라 더욱 확대했습니다. 우리는 나중에 확장을위한 냉동 세포를 사용하여 좋은 성공을 있었다. 참고 5. 우리가 NKEM 및 세포 독성 분석을 설정하기위한 NKEM 4 ML에 resuspended 4x10 5 Calcein - AM 스테인드 대상 세포의 700 uls에 resuspended 7x10 5 NK 세포의 최소를 사용하는 것이 좋습니다 오류를위한 공간을 마련하도록하기 위해서. 경우 대상 세포에게 세포의 높은 볼륨에 (최대 6x10 5-6 ML)을 사용중인 미디어 분지의 크기에 따라 필요할 수 있습니다 시딩위한 멀티채널 피펫을 사용합니다. 또한 권장 NK 세포 숫자는 E에 대해 구체적으로 다음과 같습니다 T 비율이 높은 E를 사용, 프로토콜에 게재 : T 비율이 증가이에 따라 ML 당 NK 세포 숫자 (40:1 E 들어 예 : T 비율 사용 4x10 6 셀 / ML) 6 참고. 우리는 1:500, 1:400의 다음 dilutions를 사용하여 원하는 대상 세포 라인에 대한 예비 Calcein - AM 로딩 적정을 수행하는 것이 좋습니다. 1:300, 1:200 1:100과 최대 및 자발적인 릴리스 사이의 최적의 차이를 달성하기 위해. 참고 7. 대상으로 자기편 세포주를 사용하여, 먼저 비 효소 세포 분리 버퍼를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. ADCC을 수행하는 경우, CAM - 미디어 대상 세포의 중복 튜브를 준비합니다. 참고 8 ADCC을 수행하는 경우, 10시 1분 E에 대응하는 세 우물에 동일한 NK 세포를 추가합니다. ADCC를위한 T. 추가 기증자에 대한 반복합니다. 추가 대상 세포에 대해 반복합니다. 참고 9. ADCC 실험을 수행하는 경우, calcein 로딩 45 분 후, 대상 세포에 대한 ADCC를 유도하는 특정 항체의 10ug를 추가합니다. 15 분 후에, 1,200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 완벽한 매체 목표 세포를 씻으십시오. Resuspend 1x10 5 셀 / ML에서 세포 프로토콜의 다음 단계로 진행합니다. 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 확장이 계획하신대로 수행하면 시작 소재, 1x10 9 10 10 전지 (기증자 의존 다양성)에 전형적인 NK 세포 수율 범위로 5x106 PBMCs를 사용하여, 위에서 설명한. 그림은 북한 세포 배 확장을 보여줍니다 (N = 19) 원래 제품에있는 NK 세포에 비해 (평균 + / - quartile). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 확장된 NK 세포는 몇 가지 예외 (CD11b, CD160과 CD244)로 unexpanded 기본 NK 세포에 비해 각종 NK 세포 수용체를 표현한다. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 버피 코트에서 PBMCs 복구 의존 기증하고 300x10 800x10 6 6 범위 수 있습니다. PBMCs의 18 % - NK 세포는 2 %를 구성 수 있습니다. 확대 세포의 RosetteSep 정화 들어, 40~70%에서 하루에 순수 NK 세포 14 범위의 회복. 확장 및 정화의 추천 프로토콜에 따라 99 %의 NK 세포 순도가 기대할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 확장된 NK 세포는 neuroblastoma, AML, osteosarcoma 및 흑색증 (대표 AML 살인은 %가 특정 용해으로 표시)을 포함하여 종양 세포 라인의 범위에 대한 세포 독성을 증명하고있다.

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

NK 세포 확장과 활성화 미디어 (NKEM) <ul><li> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% 태아 소 혈청 (Gibco) </li><li> 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Cellgro) </li><li> 1X L - 글루타민 (Gibco) <ul><li> 사용하기 전에 미디어를 소독 필터. </li></ul></li><li> 50 U / ML IL2 (Proleukin, 노바티스 백신 및 진단, 병원) <ul><li> - 200 μl / IU 주식의 희석. 미디어의 원하는 금액을 IL2 추가는 전에 각 시간을 사용합니다. </li></ul></li></ul> PBMC 및 NK 세포 격리 <ul><li> Ficoll - Paque (GE 헬스케어) </li><li> 알서버의 솔루션 (시그마) </li><li> RosetteSep 인간 NK 세포 농축 칵테일 (Stemcell 기술) </li></ul> NK 세포 세포 독성 분석 <ul><li> Calcein - AM (Invitrogen) <ul><li> 증권 솔루션은 50 μL aliquots에 냉동 1mg / ML, 상점에 있습니다. 세포 얼룩에 대해 원하는 희석을 달성하기 NKEM 미디어에 디졸브. </li></ul></li></ul> 항체 NK 세포 phenotyping에 사용되는 항체의 목록은 아래와 같거나 그 이상; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 항독소 </td><td> 테스트 당 볼륨 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 튜브 1 </td><td valign="top"> Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> 튜브 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD16 알렉사 647 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> 관 세 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 NKG2D APC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D 시스템 Miltenyi Biotec R &amp; D 시스템 BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> 튜브 사 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD27 APC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> 튜브 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM - 1) PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD160 Alexa647 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> 튜브 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD197 (CCR7) APC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 nk 세포 기능 평가

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

자연 킬러 (NK) 세포가 전염성 미생물 및 종양의 다양한 대한 면역 감시에 중요한 역할을한다. NK 세포와 체외에서 확장 기능의 제한 여부는 NK 세포 immunotherapy의 개발을 제한하고 있습니다. 여기 우리는 효율적으로 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로, 멤브레인 - 바운드 IL21을 표현하는 K562 세포를 사용하여 기능성 NK 세포의 생체내 예 방대한 수량을 확장하는 방법을 설명합니다. 최신 NK 세포 입양 요법은 T 세포 혹은 NK 세포의 긍정적인 선택의 고갈 다음 기증자의 정상 상태 leukapheresis 얻은 세포 제품을 활용했습니다. 이 제품은 일반적으로 하룻밤 사이에 IL - 2 활성화하고 다음 1 일 관리합니다. 때문에 주변 혈액 NK 세포의 낮은 주파수의 NK 세포의 상대적으로 작은 숫자는 임상 실험에 전달되었습니다. 체외에서 NK 세포를 증식하는 무능력은 최적의 임상 결과에 대한 충분한 세포 번호를 생성을위한 제한 요인을하고 있습니다. NK 세포의 일부 확장 (1~2주 이상의 50-10 배)이 높은 선량 IL - 2 혼자 2 일까지 달성될 수있다. autologous T 세포의 활성화는 지역 시토킨 3 출시를 통해 또 아마도, NK 세포 확장을 중재 수 있습니다. mesenchymal 기질이나 인공 항원 제시 세포 (aAPCs)로 지원 말초혈 및 코드 혈액 사 모두에서 NK 세포의 확장을 지원할 수 있습니다. 연합 NKp46와 항체 - 코팅 구슬로 CD2 인증은 현재 21일 약 100 배 확장의 결과, NK 세포 확장 (Miltenyi Biotec, 오번 CA)에 판매합니다. NK 세포를 aAPC - 확장 또는 활성화 사용하는 임상 실험이 진행, 상당한 확장을하지 않고 leukemic 세포 라인 최고급 및 활성화 NK 세포 CTV - 15을 사용 하나입니다. 두 번째 재판은 21일 6 건 490 배 확장을 달성, NK 세포 확장을위한 EBV - LCL을 활용합니다. 세 번째는 K562 기반 aAPC 21 일 이내에 277 배 의미 NK 확장을 달성 4 - 1BBL (CD137L) 및 막 - 바운드 IL - 15 (MIL - 15) 7과 transduced 사용합니다. NK 세포 K562 - 41BBL - mIL15를 사용하여 확대 있지만 aAPC가 unexpanded 북한 세포에 비해 체외 및 생체내 높은 세포 독성 있으며, ADCC에 참여, 자신의 증식이 노화 telomere 단축 8 귀속에 의해 제한됩니다. 최근에는 NK 세포의 350 배 확장은 K562 표현 미카, 4 1BBL와 IL15 9를 사용 보도했다. NK 세포 확장의 우리의 방법은 여기 21일에 평균 21,000 배 확대를 달성 노화하지 않고 NK 세포의 급속한 확산을 생산하고 설명했다.

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

자연살해(NK) 세포는 다양한 감염성 미생물 및 종양에 대한 면역 감시에서 중요한 역할을 합니다. ...의 제한적인 가용성은

이 절차의 전반적인 목적은 다량의 인간 NK 세포를 빠르게 증식시키는 것입니다. 우선 buffy coat 또는 전혈 샘플에서 p BMCs 또는 NK 세포를 분리하는 ex vivo 과정을 시작합니다. 그 다음, NK 세포 증식을 위해 pbmc를 인공 항원 제시 세포와 함께 공배양합니다.IL-2가 보충된 배지를 사용하여 NK 세포를 3주 동안 배양하며, 매주 aPCs로 자극을 주되 NK 세포 수가 배양액 mL당 1×10⁶개 미만으로 유지되도록 주의합니다. 마지막으로 비방사성 세포독성 분석법을 사용하여 확장된 NK 세포의 기능적 효능을 검증합니다. 이 확장 방식으로 얻은 전형적인 NK 세포 수득량은 21일 종료 시점에 NK 세포가 중앙값 기준 21,000배 확장되었음을 보여주며, 칼슘 방출 분석법으로 확인한 결과 다양한 종양에 대해 높은 세포독성을 나타냅니다.NK 세포는 역사적으로 대량 확보가 매우 어려웠기 때문에, 이 의료 기술은 NK 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 치료에 필요한 충분한 양의 NK 세포를 생성하는 것이 역사적으로 매우 어려웠으므로, 이 기술은 인간 암의 면역 요법에 영향을 미칩니다. 건강한 기증자의 혈액에서 PBMC를 얻는 이 기술은 제 실험실의 선임 연구원인 Cecily가 시연할 것입니다.일반적으로 혈액 은행의 버피코트(Buffy coat)가 공급원으로 사용됩니다. 먼저, PBS를 추가하여 버피코트의 부피를 140 milliliters로 조정합니다. 그다지 35 milliliters의 샘플을 15 milliliters의 fial PA 위에 층을 이루게 얹은 후, 밀도 구배 원심분리를 위해 400 G에서 20분 동안 원심분리합니다.파괴되지 않도록 주의하십시오. Fial PA 혈장 인터페이스에서 P BMC를 조심스럽게 회수하고, 나중에 사용할 RBC 튜브는 따로 보관하십시오. P BMC를 PBS로 3회 세척하며, 매회 400 G에서 10분 동안 원심분리하십시오.이 P BMC 분획을 NK 세포 확장에 사용하십시오. 이제 다시 밀도 구배 튜브로 돌아가십시오. 상층액을 흡입하여 제거하십시오.적혈구(RBC)를 두 개의 50 milliliter 원심분리관에 나누어 담고, 50 milliliter 표시선까지 PBS를 추가하여 세척합니다. 원심분리 후, 적혈구 층의 상단을 걷어내어 상층액을 흡입 제거합니다. 이는 과립구(granulocytes)를 제거하기 위함입니다.세 번 세척한 후, RBC를 동일한 부피의 else 용액에 재현탁하여 4°C에서 최대 한 달 동안 보관합니다. 이 RBC 분획은 2주간의 배양 종료 후 NK 세포의 roset SEP 정제에 사용할 수 있습니다. 기능성 NK cells를 ex vivo에서 효율적으로 증식시키기 위해, 막 결합형 IL 21을 발현하는 K 5 62 clone nine 세포(이하 K 5 62로 지칭)를 사용합니다.인공 항원 제시 세포로 Clone nine IL 21을 사용합니다. 우선 PBMC를 계수하고, NK 세포 증식을 위해 각 웰에 분주할 5 × 10⁶ cells에 해당하는 부피를 계산합니다. PBMC 5 × 10⁶ cells당 K 5 62 clone nine IL 21 세포 10 × 10⁶ cells를 준비하여 감마선 조사기로 100 Gy 조사합니다. 조사된 세포는 추후 사용을 위해 냉동 보관할 수 있습니다. 이제 조사된 세포를 PBS로 세척한 후 NK 세포 증식 배지에 재현탁합니다.이제 NK 세포 확장 배지 40 mL에 pbmc와 함께 조사된 세포를 2:1 비율로 혼합하고, 3일 차에 T 75 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에 똑바로 세워 넣습니다. 400 ×g에서 5분간 원심분리하여 자극된 세포를 회수하고, 배지의 절반을 신선한 NKEM으로 교체하여 배양을 계속합니다. 5일 차에 배지 교체를 반복합니다. 1주일 후에 세포 수를 측정하고, 유세포 분석을 통한 표현형 분석을 위해 5 × 10⁵개의 세포를 따로 분리해 둡니다. 두 번째 자극을 위해 K 562 세포를 1:1 비율로 측정하여 조사합니다.IL 21 세포 9개를 클로닝하여 세포를 증식시킨 후, 총 세포 수가 mL당 2.5 × 10⁵개가 되도록 NK 세포 증식 배지에 혼합합니다. 이제 세포를 T 75 플라스크에 넣고 배양을 지속하며, 10일 차와 12일 차에 NK 세포 증식 배지를 사용하여 mL당 2.5 × 10⁵개의 세포 농도로 계대 배양합니다. 증식 14일 차에 다시 세포 수를 측정하고 유세포 분석법으로 샘플의 표현형을 분석합니다.rosette SEP 정제 프로토콜을 사용하여 이렇게 유도된 PBMC 유래 세포 확장물을 정제하고, 유세포 분석 표현형 분석을 통해 NK 세포의 순도를 확인하십시오. 정제된 NK 세포에 대해 방사선 조사된 K 5 62 clone nine IL 21 세포를 1:1 비율로 사용하여 3차 자극을 수행하십시오. 마지막으로 21일째에, 전체 표현형 분석 항체 패널을 이용한 유세포 분석으로 증폭된 NK 세포를 분석하십시오.10% DMSO가 포함된 FBS에서 세포 스톡을 최대 5 × 10⁷ cells/vial의 밀도로 동결 보관하십시오. 세포독성 분석에는 신선한 NK 세포 또는 동결된 NK 세포를 모두 사용할 수 있습니다. 동결된 NK 세포를 사용하는 경우, 먼저 NK 세포 바이알을 해동하고 분석 당일에 세포 회복을 위해 NKEM에서 24시간 동안 배양하십시오. 10⁶개의 표적 세포를 Calcium AM이 포함된 NKEM 1mL에 재현탁하고, U-bottom 96-well 플레이트에서 37°C로 가끔 흔들어주며 1시간 동안 배양하십시오. 1 × 10⁶ cells/mL로 현탁된 NK 세포 200µL를 3회 반복하여 가한 후, 지시된 대로 세포를 연속 희석하십시오.1시간의 칼슘 로딩 후, NK 세포 증식 배지를 사용하여 표적 세포를 400 G에서 5분 동안 두 번 원심분리하여 세척합니다. 이제 표적 세포의 수를 다시 세고 1×10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 96-well 플레이트의 각 웰에 표적 세포 100 µL를 첨가하고 100 G에서 1분 동안 원심분리하여 세포 접촉을 유도한 후, 37 °C, 5% CO₂ 환경에서 4시간 동안 배양합니다.방출된 칼슘을 균일하게 부유시키기 위해, 100 G에서 5분 동안 펠렛 세포를 피펫팅하여 배양액을 부드럽게 섞은 후, 상층액 100 microliters를 새로운 flat-bottom 96 well plate로 옮깁니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하며, 필요한 경우 미세 바늘을 사용하여 생성된 기포를 제거합니다. 들뜸 필터 485 nanometers 및 방출 필터 530 nanometers로 설정된 형광 플레이트 리더기를 사용하여 플레이트를 읽습니다.백분율 특이 용해도를 계산합니다. 일반적으로 버피코트(buffy coat)에서 분리한 5 × 10⁶개의 PBMC를 증식시키면 1 × 10⁹에서 10¹⁰ 사이의 NK 세포를 얻을 수 있습니다. 증식된 NK 세포는 버피코트 내의 증식되지 않은 일차 NK 세포와 유사한 다양한 NK 세포 수용체를 발현합니다.14일째에 NK 세포는 pbmc의 2%에서 18%를 차지할 수 있습니다. 확장된 세포를 Rosette SEP 방식으로 정제하면, CD3 음성 CD56 양성 세포로 표시되는 99%의 NK 세포 순도로 배양액 내 NK 세포의 40%에서 70%를 회수할 수 있습니다. 확장된 NK 세포는 신경모세포종, AML, 골육종 및 흑색종을 포함한 다양한 종양 세포주에 대해 세포독성을 나타냈습니다.여기 대표적인 ML 사멸 결과가 퍼센트 특이적 용해(percent specific lysis)로 나타나 있습니다. 실시간 BIOT 비디오는 calcium am이 로딩된 신경모세포종 세포주 CHP 1 34에 대한 NK 세포의 살해 능력을 보여줍니다. 이 과정 이후에, NK 세포의 기능에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 NK 세포의 사이토카인 생성 분석이나 동물 종양 모델에서의 적응 전이와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 대량의 NK 세포를 확장 및 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 말초혈액 단핵구(PBMC)로부터 직접 수행한 후 NK 세포를 정제하거나, 로제트법(rosette method)으로 정제된 NK 세포를 사용하여 확장을 시작함으로써 달성할 수 있습니다. 시작 단계에서 일반적인 버피코트(buffy coat)로부터 15~40 million개의 NK 세포를 얻을 수 있으며, 이 세포들을 모두 사용하여 본 방법에서 설명한 체계에 따라 매우 많은 수의 NK 세포를 확장할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

이 비디오는 피더 세포주를 사용하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 직접 자연살해(NK) 세포를 증식하는 기술을 보여줍니다. PBMC는 막결합 인터루킨-21(mIL-21)을 발현하는 유전자 변형 림프모세포 공급세포와 공동 배양되며, 배양액에는 사이토카인 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-15(IL-15)가 보충됩니다. 이 리간드의 칵테일은 함께 고순도의 NK 세포의 장기간 증식으로 이어집니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 자연 살해 세포의 생체 외 확장

이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

여기에서는 쥐의 비장에서 많은 수의 쥐 불변 자연 살해 T 세포를 생성하는 데 사용할 수 있는 적응된 프로토콜을 제시합니다. 의정서는 비장 iNKT 세포가 한정된 수의 동물 및 시약을 사용하여 시험관 내에서를 위해 풍성하게 하고, 고립되고 확장될 수 있는 접근 방식을 개략적으로 설명합니다.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

인간 자연 킬러 세포에서 치료 항체에 의한 FcγRIIIa 구동 이벤트를 연구하기 위한 프로토콜이 여기에 설명되어 있다. 이 인공 자극 플랫폼은 결합에 관여하는 항체의 FcγRIIa 및 Fc 부분에 의해 매개되는 디그라니션, 케모킨/사이토카인 생성, 시그널링 경로 와 같은 다운스트림 이펙터 기능의 심문을 허용합니다.

치료 항체의 존재에 FcγRIIIa 참여에 의해 구동 인간 자연 킬러 세포 이벤트의 평가

우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.

체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장

여기에서는 말초혈액자연살해(PBNK), 간 조직으로부터 NK세포, 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)에서 유래한 키메라 항원 수용체(CAR)-NK세포를 확장시키는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 확장된 NK 세포의 최적화된 순도 외에도 221-mIL-21 영양세포를 사용하는 NK 및 CAR-NK 세포의 확장을 보여줍니다.

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

본 프로토콜은 3D 및 2D 배양 조건 모두에서 인간 확장 전위 줄기 세포 (hEPSC)로부터 경미한 세포 독성을 갖는 CD3- / CD45 + CD56 + 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 미세 환경을 파괴하지 않고 일상적인 표현형 검증이 가능합니다.

인간 확장 잠재적 줄기 세포로부터 자연 살해 세포 생성

학습하세요 사람 말초혈 NK 세포의 효율적인 확장 및 정화 방법을 통해 기능적 세포독성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 21일간 21,000배의 세포 확장을 달성하여 암 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

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