확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

이 절차의 전반적인 목적은 다량의 인간 NK 세포를 빠르게 증식시키는 것입니다. 우선 buffy coat 또는 전혈 샘플에서 p BMCs 또는 NK 세포를 분리하는 ex vivo 과정을 시작합니다. 그 다음, NK 세포 증식을 위해 pbmc를 인공 항원 제시 세포와 함께 공배양합니다.

IL-2가 보충된 배지를 사용하여 NK 세포를 3주 동안 배양하며, 매주 aPCs로 자극을 주되 NK 세포 수가 배양액 mL당 1×10⁶개 미만으로 유지되도록 주의합니다. 마지막으로 비방사성 세포독성 분석법을 사용하여 확장된 NK 세포의 기능적 효능을 검증합니다. 이 확장 방식으로 얻은 전형적인 NK 세포 수득량은 21일 종료 시점에 NK 세포가 중앙값 기준 21,000배 확장되었음을 보여주며, 칼슘 방출 분석법으로 확인한 결과 다양한 종양에 대해 높은 세포독성을 나타냅니다.

NK 세포는 역사적으로 대량 확보가 매우 어려웠기 때문에, 이 의료 기술은 NK 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 치료에 필요한 충분한 양의 NK 세포를 생성하는 것이 역사적으로 매우 어려웠으므로, 이 기술은 인간 암의 면역 요법에 영향을 미칩니다. 건강한 기증자의 혈액에서 PBMC를 얻는 이 기술은 제 실험실의 선임 연구원인 Cecily가 시연할 것입니다.

일반적으로 혈액 은행의 버피코트(Buffy coat)가 공급원으로 사용됩니다. 먼저, PBS를 추가하여 버피코트의 부피를 140 milliliters로 조정합니다. 그다지 35 milliliters의 샘플을 15 milliliters의 fial PA 위에 층을 이루게 얹은 후, 밀도 구배 원심분리를 위해 400 G에서 20분 동안 원심분리합니다.

파괴되지 않도록 주의하십시오. Fial PA 혈장 인터페이스에서 P BMC를 조심스럽게 회수하고, 나중에 사용할 RBC 튜브는 따로 보관하십시오. P BMC를 PBS로 3회 세척하며, 매회 400 G에서 10분 동안 원심분리하십시오.

이 P BMC 분획을 NK 세포 확장에 사용하십시오. 이제 다시 밀도 구배 튜브로 돌아가십시오. 상층액을 흡입하여 제거하십시오.

적혈구(RBC)를 두 개의 50 milliliter 원심분리관에 나누어 담고, 50 milliliter 표시선까지 PBS를 추가하여 세척합니다. 원심분리 후, 적혈구 층의 상단을 걷어내어 상층액을 흡입 제거합니다. 이는 과립구(granulocytes)를 제거하기 위함입니다.

세 번 세척한 후, RBC를 동일한 부피의 else 용액에 재현탁하여 4°C에서 최대 한 달 동안 보관합니다. 이 RBC 분획은 2주간의 배양 종료 후 NK 세포의 roset SEP 정제에 사용할 수 있습니다. 기능성 NK cells를 ex vivo에서 효율적으로 증식시키기 위해, 막 결합형 IL 21을 발현하는 K 5 62 clone nine 세포(이하 K 5 62로 지칭)를 사용합니다.

인공 항원 제시 세포로 Clone nine IL 21을 사용합니다. 우선 PBMC를 계수하고, NK 세포 증식을 위해 각 웰에 분주할 5 × 10⁶ cells에 해당하는 부피를 계산합니다. PBMC 5 × 10⁶ cells당 K 5 62 clone nine IL 21 세포 10 × 10⁶ cells를 준비하여 감마선 조사기로 100 Gy 조사합니다. 조사된 세포는 추후 사용을 위해 냉동 보관할 수 있습니다. 이제 조사된 세포를 PBS로 세척한 후 NK 세포 증식 배지에 재현탁합니다.

이제 NK 세포 확장 배지 40 mL에 pbmc와 함께 조사된 세포를 2:1 비율로 혼합하고, 3일 차에 T 75 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에 똑바로 세워 넣습니다. 400 ×g에서 5분간 원심분리하여 자극된 세포를 회수하고, 배지의 절반을 신선한 NKEM으로 교체하여 배양을 계속합니다. 5일 차에 배지 교체를 반복합니다. 1주일 후에 세포 수를 측정하고, 유세포 분석을 통한 표현형 분석을 위해 5 × 10⁵개의 세포를 따로 분리해 둡니다. 두 번째 자극을 위해 K 562 세포를 1:1 비율로 측정하여 조사합니다.

IL 21 세포 9개를 클로닝하여 세포를 증식시킨 후, 총 세포 수가 mL당 2.5 × 10⁵개가 되도록 NK 세포 증식 배지에 혼합합니다. 이제 세포를 T 75 플라스크에 넣고 배양을 지속하며, 10일 차와 12일 차에 NK 세포 증식 배지를 사용하여 mL당 2.5 × 10⁵개의 세포 농도로 계대 배양합니다. 증식 14일 차에 다시 세포 수를 측정하고 유세포 분석법으로 샘플의 표현형을 분석합니다.

rosette SEP 정제 프로토콜을 사용하여 이렇게 유도된 PBMC 유래 세포 확장물을 정제하고, 유세포 분석 표현형 분석을 통해 NK 세포의 순도를 확인하십시오. 정제된 NK 세포에 대해 방사선 조사된 K 5 62 clone nine IL 21 세포를 1:1 비율로 사용하여 3차 자극을 수행하십시오. 마지막으로 21일째에, 전체 표현형 분석 항체 패널을 이용한 유세포 분석으로 증폭된 NK 세포를 분석하십시오.

10% DMSO가 포함된 FBS에서 세포 스톡을 최대 5 × 10⁷ cells/vial의 밀도로 동결 보관하십시오. 세포독성 분석에는 신선한 NK 세포 또는 동결된 NK 세포를 모두 사용할 수 있습니다. 동결된 NK 세포를 사용하는 경우, 먼저 NK 세포 바이알을 해동하고 분석 당일에 세포 회복을 위해 NKEM에서 24시간 동안 배양하십시오. 10⁶개의 표적 세포를 Calcium AM이 포함된 NKEM 1mL에 재현탁하고, U-bottom 96-well 플레이트에서 37°C로 가끔 흔들어주며 1시간 동안 배양하십시오. 1 × 10⁶ cells/mL로 현탁된 NK 세포 200µL를 3회 반복하여 가한 후, 지시된 대로 세포를 연속 희석하십시오.

1시간의 칼슘 로딩 후, NK 세포 증식 배지를 사용하여 표적 세포를 400 G에서 5분 동안 두 번 원심분리하여 세척합니다. 이제 표적 세포의 수를 다시 세고 1×10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 96-well 플레이트의 각 웰에 표적 세포 100 µL를 첨가하고 100 G에서 1분 동안 원심분리하여 세포 접촉을 유도한 후, 37 °C, 5% CO₂ 환경에서 4시간 동안 배양합니다.

방출된 칼슘을 균일하게 부유시키기 위해, 100 G에서 5분 동안 펠렛 세포를 피펫팅하여 배양액을 부드럽게 섞은 후, 상층액 100 microliters를 새로운 flat-bottom 96 well plate로 옮깁니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하며, 필요한 경우 미세 바늘을 사용하여 생성된 기포를 제거합니다. 들뜸 필터 485 nanometers 및 방출 필터 530 nanometers로 설정된 형광 플레이트 리더기를 사용하여 플레이트를 읽습니다.

백분율 특이 용해도를 계산합니다. 일반적으로 버피코트(buffy coat)에서 분리한 5 × 10⁶개의 PBMC를 증식시키면 1 × 10⁹에서 10¹⁰ 사이의 NK 세포를 얻을 수 있습니다. 증식된 NK 세포는 버피코트 내의 증식되지 않은 일차 NK 세포와 유사한 다양한 NK 세포 수용체를 발현합니다.

14일째에 NK 세포는 pbmc의 2%에서 18%를 차지할 수 있습니다. 확장된 세포를 Rosette SEP 방식으로 정제하면, CD3 음성 CD56 양성 세포로 표시되는 99%의 NK 세포 순도로 배양액 내 NK 세포의 40%에서 70%를 회수할 수 있습니다. 확장된 NK 세포는 신경모세포종, AML, 골육종 및 흑색종을 포함한 다양한 종양 세포주에 대해 세포독성을 나타냈습니다.

여기 대표적인 ML 사멸 결과가 퍼센트 특이적 용해(percent specific lysis)로 나타나 있습니다. 실시간 BIOT 비디오는 calcium am이 로딩된 신경모세포종 세포주 CHP 1 34에 대한 NK 세포의 살해 능력을 보여줍니다. 이 과정 이후에, NK 세포의 기능에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 NK 세포의 사이토카인 생성 분석이나 동물 종양 모델에서의 적응 전이와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 대량의 NK 세포를 확장 및 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 말초혈액 단핵구(PBMC)로부터 직접 수행한 후 NK 세포를 정제하거나, 로제트법(rosette method)으로 정제된 NK 세포를 사용하여 확장을 시작함으로써 달성할 수 있습니다. 시작 단계에서 일반적인 버피코트(buffy coat)로부터 15~40 million개의 NK 세포를 얻을 수 있으며, 이 세포들을 모두 사용하여 본 방법에서 설명한 체계에 따라 매우 많은 수의 NK 세포를 확장할 수 있습니다.