파리에서 에탄올 민감도를 측정하는 간단한 방법

안녕하세요, 저는 달라스 UT Southwestern Medical Center 정신과 Adrian Rothen 박사님 연구실의 Thomas Maples입니다. 오늘은 에탄올 유도 진정에 대한 초파리의 민감도를 측정하는 간단한 절차를 시연하겠습니다. 이 분석법은 에탄올 노출 후 초파리의 직립 반사 및 보행 능력 상실을 기반으로 합니다.

이 측정법은 서로 다른 초파리 계통 및 돌연변이체 간의 알코올 민감도 차이를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 분석법을 사용하여 초파리의 내성을 유도할 수 있으며, 여기서 내성이란 반복적인 노출 후 알코올에 대한 반응이 감소하는 것을 의미합니다. 이제 시작하겠습니다.

이 실험을 위해서는 다음과 같은 바이알이 필요합니다. 수집한 지 1~2일 된 초파리 8마리를 준비하십시오. 노출 실험은 수컷 또는 암컷 중 어느 쪽으로도 진행할 수 있습니다.

하지만, 각 바이알에는 한 가지 성별만 포함되어야 합니다. 파리가 들어 있지 않은 빈 먹이 바이알, 면 소재의 바이알 플러그 2개. 이러한 유형의 버즈 플러그가 없는 경우 솜 뭉치를 사용할 수 있으며, 팁이 포함된 1000 microliter 마이크로 피펫, 식료품점에서 구입 가능한 식용 색소가 포함된 200 proof 에탄올, 그리고 타이머가 필요합니다.

가장 먼저 해야 할 일은 초파리를 에탄올에 노출시키고 그들의 운동성을 관찰할 노출 챔버를 만드는 것입니다. 이 챔버를 제작하려면, 먼저 면도날을 사용하여 바이알 플러그를 반으로 자릅니다. 그런 다음 자른 반쪽 중 하나를 바이알 바닥으로 밀어 넣어 먹이를 덮습니다.

이렇게 하면 파리가 걸어 다닐 수 있는 평평하고 끈적이지 않는 표면이 만들어집니다. 솜 뭉치를 사용하는 경우, 부드럽게 눌러서 솜털이 최대한 없게 만들어 파리가 솜실에 끼지 않도록 하십시오. 여러 개의 챔버를 만드는 경우, 각 챔버의 먹이와 바이알 플러그가 차지하는 공간이 동일한지 확인하십시오.

이렇게 하면 각 챔버 내의 초파리들이 동일한 부피의 에탄올에 노출되도록 보장할 수 있습니다. 숙련되면 세 개의 초파리 바이알을 동시에 노출시키는 것이 쉽습니다. 노출 챔버가 준비되면, 이제 초파리를 에탄올에 노출시킬 수 있습니다.

먼저 파리 8마리가 들어 있는 바이알을 노출 챔버로 옮기고, 파리가 원래 들어 있던 바이알의 마개로 챔버를 밀봉합니다. 다음으로 선택한 농도의 염색된 에탄올 500 µL를 솜 형태의 바이알 마개 한쪽 끝에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 노출 챔버의 마개를 에탄올이 도포된 마개로 교체하며, 에탄올이 묻은 부분이 챔버 안쪽으로 향하게 삽입합니다.

에탄올이 코팅된 플러그를 노출 챔버에 넣은 직후 타이머를 시작하십시오. 에탄올에 포함된 염료는 에탄올 면이 바이알 벽면이 아닌 노출 챔버 쪽을 향하도록 하는 데 도움을 줍니다. 이는 버즈 플러그(buzz plugs) 대신 솜 뭉치를 사용할 때 특히 중요한데, 솜 뭉치는 어느 쪽이든 바이알 내부를 향할 수 있기 때문입니다.

본 실험에서는 100% 알코올을 사용하며, 이는 초파리가 공기 중에서 흡입할 수 있도록 노출 챔버 내로 확산됩니다. 에탄올이 코팅된 플러그를 노출 챔버에 추가한 후, 매분마다 정지 상태가 된 초파리의 수를 측정합니다. 여기서 정지 상태란 초파리가 스스로 몸을 뒤집거나 걷지 못하는 상태를 의미합니다. 초파리가 활동성을 유지하는 시간이 길수록, 매 1분 간격으로 측정 시 저항성이 더 높음을 나타냅니다.

챔버를 벤치 위에 톡톡 두드려 파리들을 놀라게 함으로써 이동 가능한 모든 파리가 움직이고 있는지 확인하십시오. 매 1분 간격으로 두드린 후 10초 동안 파리들을 관찰하여 파리들이 움직이기 시작하거나 스스로 몸을 뒤집을 시간을 줍니다. 실험 시작 시 8마리의 파리 중 몇 마리가 정지 상태인지 기록하십시오.

대부분의 초파리는 놀랐을 때 바이알의 벽면을 따라 빠르게 기어 올라갑니다. 100% 에탄올에 약 6분 동안 노출되면, 초파리들은 움직임이 둔해지기 시작하며 12분 정도가 되면 때로는 불규칙하게 움직입니다. 대부분의 초파리는 정지 상태가 되며, 걷지 못하거나 등으로 누운 상태에서 몸을 돌려 세우지 못하게 됩니다.

스스로 몸을 일으키고 걸을 수 있는 파리만 이동성 파리로 계산해야 합니다. 단순히 제자리에서 다리나 날개만 움직이는 파리는 정지성 파리로 계산해야 하며, 전체 관찰 기간 동안 계속 등으로 누워 있는 파리 또한 스스로 몸을 일으키지 못하는 것은 취기의 징후이므로 정지성 파리로 계산해야 합니다. 10초의 전체 관찰 시간 동안 날개를 격렬하게 진동시키는 파리는 위치를 변경하더라도 마찬가지로 정지성 파리로 계산해야 합니다. 이러한 파리들의 대다수는 빠른 날개 움직임 사이의 기간 동안 정지 상태를 유지합니다.

요약하자면, 스스로 몸을 뒤집어 걸을 수 있는 파리는 이동성 파리로 간주하며, 몸을 뒤집지 못하고 다리와 날개만 제자리에서 움직이거나 날개를 빠르게 진동시키는 파리는 정지성 파리로 간주합니다. 이 규칙을 적용하면, 에탄올 증기에 노출되는 시간이 길어질수록 정지성 상태가 되는 야생형 파리가 증가함을 알 수 있습니다. 이 분석법에서 에탄올 민감도를 정량화하는 데 사용하는 값은 중앙 진정 시간(MST)입니다.

우리는 MST를 노출 챔버 내의 파리 8마리 중 4마리가 정지 상태가 되는 데 필요한 에탄올 노출 시간(분)으로 정의합니다. 특정 관찰 시점에 정확히 4마리의 파리가 정지 상태라면 이 값을 쉽게 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 11분간 노출 후 정확히 4마리의 파리가 정지 상태라면, MST는 11이 됩니다.

노출 11분 후에 정확히 4마리의 초파리가 정지 상태이고 12분 후에도 동일한 상태라면, 초파리들이 처음으로 ST에 도달한 시간인 첫 번째 값을 취합니다. 특정 관찰 기간에 4마리의 초파리가 정지 상태가 아닌 경우에는 4마리의 초파리가 정지 상태가 된 시간을 선형 보간해야 합니다. 예를 들어, 노출 9분에서 10분 사이에 정지 상태인 초파리의 수가 3마리에서 5마리로 급증한 경우, 그래프를 통해 MST가 9.5분임을 결정할 수 있습니다. 이 분석법을 사용하여 수집한 다음 데이터는 이 실험 설계가 에탄올 민감도를 측정하는 정확한 방법임을 보여줍니다.

다음 실험에서는 6~8개의 바이알(vial)을 N수로 사용하였으며, 이는 막대 그래프 내에 표시되어 있습니다. 100% Ethanol에 노출된 야생형 수컷 초파리의 MST는 표준 오차가 낮으며 대략 11분입니다. 일별 변동성은 낮고 대부분 통계적으로 유의미하지 않으나, 실험군과 대조군을 같은 날에 병렬로 측정하는 것을 권장합니다.

또한 A일과 B일에 노출된 파리들이 동일한 개체가 아니라는 점에 유의하십시오. 이들은 동일한 유전적 계통을 대표하는 형제자매 개체들입니다. 100% Ethanol에 노출된 수컷 및 암컷 파리는 MST에서 차이를 보이지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 한 가지 성별만 사용하는 것을 권장합니다.

수컷과 암컷 초파리를 점증하는 농도의 에탄올에 노출시키면, 에탄올 농도 증가에 따라 MST가 통계적으로 유의미하게 감소하는 뚜렷한 용량 반응 곡선을 얻을 수 있습니다. 이 분석법은 더 정교한 에탄올 증발 장치로 측정하여 이전에 발표된 표현형 또한 재현하며, right rabbit one 돌연변이가 있는 초파리에서는 MST가 유의미하게 증가하는 것으로 나타났습니다. 이러한 증가는 100% 및 90% 에탄올 농도 모두에서 관찰되었습니다.

이 분석법을 사용하여 초파리의 에탄올 내성을 유도하고 측정할 수 있습니다. 내성은 내성을 유도하기 위해 알코올에 미리 노출시킨 후, 알코올에 대한 반응이 감소하는 것으로 정의됩니다. 초파리가 담긴 바이알을 MST의 약 2배 시간 동안 에탄올에 노출시키십시오.

예를 들어, 수컷 베를린 야생형(Berlin wild type) 계통을 100% ethanol에 24분 동안 노출시킵니다. 노출 후, 8마리의 초파리를 먹이가 든 바이알(vial)에 조심스럽게 털어 넣어 4시간 동안 회복시킵니다. 4시간의 회복 시간이 지난 후, 해당 바이알에 초파리의 최초 MST를 기록하고, 동일한 초파리를 동일한 용량의 ethanol에 다시 노출시켜 두 번째 MST를 기록합니다.

이 그래프에서 볼 수 있듯이, 두 번째 에탄올 노출 시의 MST는 첫 번째 노출 시의 MST보다 유의미하게 높으며, 이는 파리가 에탄올의 진정 효과에 대해 내성을 획득했음을 나타냅니다. 내성 측정값은 특정 파리 바이알의 두 번째 MST를 동일한 파리의 첫 번째 MST로 나눈 뒤 1을 빼서 계산합니다. 이 값은 퍼센트 내성으로 표현되며, 본 실험의 경우 약 50%입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.