틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

이 실험 절차의 전체적인 목적은 Borrelia bergii gertii 세포를 진드기 장 내에 미세 주입하여 국소화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유리 모세관 바늘을 준비하고 Borrelia bergii gertii 세포를 채웁니다. 그다음, 미세 주입을 통해 Borrelia bergii gertii 세포를 진드기 장 내부로 옮깁니다.

그 후 진드기를 해부하여 장 조직을 제거합니다. 마지막으로, 진드기 장 내 beberg defer의 면역형광 표지를 수행합니다. 최종적으로 공초점 현미경을 사용하여 진드기 장 내 beberg to ferry의 국소화를 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 메릴랜드 대학교 수의학과 조교수 Ruth Paul Paul 박사입니다. 오늘은 제 연구실 구성원인 박사후 연구원 Toro Cairo와 대학원생 Adam Coleman이 저희 실험실에서 일상적으로 수행하는 미세주입을 통한 진드기의 인공 감염 절차를 보여드리겠습니다. 미세주입 후에는 진드기를 해부하고 공초점 레이저 주사 현미경(confocal LE microscope)을 사용하여 진드기 장 내의 박테리아를 이미징하겠습니다.

천연 감염된 진드기 세대를 생성하는 대신 진드기에 직접 미세주입을 하는 주요 장점은 시술 소요 시간입니다. 미세주입을 통해 전체 절차를 수주에서 수 시간으로 단축할 수 있으며, 천연 흡혈 과정을 통해 감염된 진드기를 생성하려면 약 5주가 소요됩니다. 이 기술은 RNAi를 위한 이중 가닥 RNA나 특정 항체 간섭을 위한 항혈청과 같은 다른 유용한 시약을 진드기 내부에 주입하는 데에도 적용될 수 있습니다.

먼저 유리 마이크로피펫 풀러(glass micropipet pull device)를 사용하여 1mm 유리 모세관을 가열하고 당겨 여러 개의 미세주입 바늘을 제작합니다. 취약한 모세관들을 조심스럽게 제거하십시오. 제작된 바늘들의 팁이 위를 향하도록 페트리 접시 안의 접착 테이프 위에 모아 보관합니다.

다음으로, BSK 배지에서 b berg de ferry를 배양합니다. 1mL당 약 10⁷ cells 농도가 되도록 배양한 후, 3000 ×g에서 10분간 원심분리하여 b berg de ferry 펠릿을 형성합니다. 상온에서 상층액을 제거하고, 200 µL 멸균 마이크로팁을 통해 부드럽게 분산시켜 펠릿을 BSK 배지에 완전히 재현탁하여 최종 농도를 1mL당 10⁹ cells로 맞춥니다.

세포가 높은 세포 밀도로 재현탁되어 서로 뭉칠 수 있으므로, 세포 현탁액은 미세주입에 즉시 사용해야 합니다. 진드기를 준비하려면 점착 매트 위에서 글라스 슬라이드에 투명 양면테이프를 붙이십시오. 용기에서 진드기를 조심스럽게 꺼내어, 작은 브러시를 사용하여 주입할 필요한 수의 진드기를 복부가 위로 향하게 하여 동일한 방향으로 양면테이프 위에 배치합니다. 풀드 모세관 바늘에 beberg de ferry 배양액 5 µL를 채웁니다. 20 µL 마이크로 로드 피펫 팁을 사용하여 바늘에 갇힌 공기 방울이 있는지 확인하고, 박테리아 배양액을 다시 채웁니다.

필요한 경우, 해부용 실체 현미경으로 진드기를 관찰하며 진드기의 항문 개구부 영역에 초점을 맞춥니다. 모세관 바늘의 끝부분을 가볍게 건드려, 직경이 진드기의 항문 개구부보다 약간 작게 부러뜨려 미세 주입 바늘을 만듭니다. 적절하지 않은 바늘 팁으로 진드기에 주입을 시도하면 부상을 입거나 사망할 수 있으므로 이 단계는 매우 중요합니다.

주사된 진드기를 대상으로 합니다. 고정된 진드기를 해부용 쌍안 현미경 아래에 두고 두 개의 가동성 항문판으로 덮여 있는 항문 개구부에 초점을 맞춥니다. 미세 핀셋을 사용하여 항문 개구부 근처의 임의의 영역을 가볍게 터치하고 매우 약한 압력을 가합니다.

이렇게 하면 항문판을 분리하고 장과 연결되는 항문공을 열 수 있습니다. 항문판의 강제 개구부를 통해 바늘 끝을 항문 구멍 속으로 조심스럽게 살짝 삽입하십시오. 유리 팁이 직장과 연결된 반투명한 후장을 손상시킬 수 있으므로 바늘 삽입은 최소한으로 해야 합니다.

자동 풋 컨트롤이 장착된 마이크로 인젝터를 사용하여 다음 파라미터에 따라 베버그 드 페리(beberg de ferry) 용액을 주입하십시오: 주입 압력 1000 Hector Pascals, 주입 시간 0.2 seconds, 보정 압력 8 Hector Pascals. 마이크로인젝션 후 각 틱(tick)에 한 번씩 주입합니다.

진드기는 주입 전과 마찬가지로 자극에 반응하여 움직이거나 기어가는 모습을 보여야 합니다. 면역형광 현미경 관찰을 위해 진드기를 해부하려면, 먼저 해부용 깨끗한 유리 슬라이드 위에 인산 완충 식염수 한 방울을 떨어뜨리고, 폴리 L-라이신(poly L lysine)이 코팅된 슬라이드 위에 또 한 방울을 떨어뜨립니다. 현미경 관찰을 위해 양면테이프가 부착된 또 다른 유리 슬라이드를 준비하십시오. 그다음, 용기에서 진드기를 꺼내 양면테이프 위에 놓습니다.

해부 현미경 하에서 작은 붓을 사용하여 진드기에 초점을 맞춘 뒤, 첫 번째와 두 번째 다리 쌍 사이의 진드기 몸체 위에 날카로운 면도날을 놓습니다. 면도날을 강하게 눌러 진드기를 두 조각으로 절단하여 복부를 노출시키고, 미세 핀셋을 사용하여 복부를 즉시 PBS 한 방울 속에 담급니다. 절단 부위 주변의 등면 및 배면 외골격을 잡습니다.

등판(dorsal shield)을 조심스럽게 들어 올려 진드기 몸체에서 분리하고, 갈색의 장 게실(gut diverticular)을 노출시킵니다. 해부 중인 진드기가 항상 PBS에 잠겨 있도록 주의하십시오. 반투명한 타액선(sali gland) 다발은 장의 앞쪽 양옆에 위치하며, 필요한 경우 이 시점에서 제거할 수 있습니다.

포셉으로 남은 외골격을 고정한 상태에서 복부로부터 장을 조심스럽게 끌어냅니다. 기관과 같이 끼어 있는 조직들을 제거하여 장을 세심하게 세척합니다. 미세 포셉의 끝을 사용하여 진드기 장을 poly L lysine 글라스 슬라이드 위의 PBS 방울 속으로 빠르게 옮깁니다.

미세 칼날을 사용하거나 미세 핀셋의 끝으로 부드럽게 눌러 장을 더 작은 조각으로 분리하십시오. 장 조직 주변의 과잉 PBS를 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오. 장 조직을 실온에서 공기 건조시키십시오.

진드기 장을 아세톤에 10분 동안 담가 고정합니다. 실온에서 공기 건조시키십시오. 이 단계에서 슬라이드를 밀폐 용기에 넣어 -20 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 장의 면역형광 표지를 위해, 고정된 진드기 장 주변을 PAP 펜이나 다른 소수성 장벽 라이닝 장치로 원형으로 그리십시오.

이렇게 하면 이후의 배양 단계 동안 염색액이 유지되는 데 도움이 됩니다. 진드기 장을 블로킹 버퍼 한두 방울로 덮고 실온에서 30분 동안 둡니다.

블로킹에 사용되는 혈청은 항체 생성에 사용된 숙주 동물의 종에 따라 달라집니다. 이 단계부터 슬라이드가 마르지 않도록 주의하십시오. 블로킹 버퍼를 천천히 흡입하여 제거합니다.

적절한 1차 및/또는 2차 항체 용액으로 장을 배양합니다. 본 실험에서는 fluorescein, isothiocyanate 또는 FXI로 표지된 anti B berg를 사용합니다. 항체를 블로킹 버퍼에 1:100로 희석하여 1시간 동안 처리합니다.

실온에서 빛 노출을 제한하기 위해 알루미늄 호일로 용기를 덮습니다. 항체 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. DPI 또는 propidium iodide와 같은 형광 염료를 사용하여 진드기 조직을 염색하기 위해 장을 배양합니다.

일반적으로 PBS에 용해된 20 µg/mL의 peridium iodide를 사용하여 상온에서 5분 동안 처리한 후, 0.05% tween 20이 포함된 PBS로 5분 동안 3회 세척합니다. 마지막으로, Antifa 시약이 포함된 완충 글리세롤로 슬라이드를 마운팅하고 유리 커버로 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드 글라스는 이 단계에서 밀폐 용기에 담아 4 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있으며, 공초점 현미경으로 b berg de ferry의 이미지 및 국소화를 관찰합니다.

가시성을 위해 kumasi brilliant blue가 충전된 바늘을 사용하여 진드기에 미세주사하는 모습이 여기에 제시되어 있습니다. 미세 핀셋을 사용하여 몸체에 부드럽게 압력을 가함으로써 항문판을 분리하고 항문공을 열어 미세주사가 가능하게 합니다. 여기서는 장 내부에 beberg ferry가 포함된 장게실의 전방 부위가 나타나 있습니다.

장 핵과 스피로헤타는 각각 propidium iodide 또는 fitzy conjugated anti beberg ferry로 염색합니다. 숙달된 후에는 10마리의 진드기에 각각 10만 마리의 생존하는 fer 감염균을 미세 주입할 수 있음을 확인했습니다. 진드기를 다른 실험에 즉시 사용할 수도 있지만, 일반적으로는 다음 단계로 진행하기 전에 진드기가 처치 후 생존했는지 확인하기 위해 1~2일 정도 기다립니다.

이 영상을 시청하신 후에는 공초점 면역형광법을 사용하여 진드기 장 내에 미세 및 국소 장벽 벌레를 통해 인공 감염 진드기를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 진드기를 다루거나 Borrelia burgdorferi와 같은 인체 병원균이 채워진 미세 유리 바늘을 사용하는 작업은 수행 중에 위험할 수 있습니다. 진드기와 바늘의 위치를 항상 유의하시고, 항상 생물안전 2등급(BSL-2) 예방 조치를 준수하십시오.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.