Name: 틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 학습하세요 진드기 장내에서 Borrelia burgdorferi를 빠르게 감염시키고 면역형광법으로 병원균을 정밀하게 위치시키는 방법을. 이 기술은 라임병 전파 메커니즘 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

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우리는 진심으로이 예제의 준비와 지원을 팔 실험실의 구성원 감사합니다. 이 연구는 NIH / NIAID에서 PHS 부여 AI076684 및 AI080615 지원했다.

1. Nymphal Ixodes scapularis 진드기의 Microinjection 1. 준비 바늘 <ol><li> 난방 및 유리 micropipette 끌어당기는 장치 (Narishige)에 1mm의 유리 모세관 튜브 (세계 정밀 계측기)를 당기는하여 여러 microinjection의 바늘을 조작. 조심스럽게 연약한 모세관 튜브를 제거합니다. </li><li> 저장소는 배양 접시에 접착 테이프에 바늘 (끝 위를 향하게)를 뽑아. </li></ol> 2. B. 준비 burgdorferi <ol><li> B. 그로 ML 당 7 10 세포의 농도에까지 BSK 문화 미디어 7 burgdorferi. Spirochetes은 Petroff - Hausser 계산 실 (Hausser 과학)를 사용하여 어두운 현장 현미경으로 계산됩니다. </li><li> 펠렛 B. 실온에서 10 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 burgdorferi. </li><li> 뜨는 제거하고 완전히 부드럽게 ML 당 10 9 세포의 최종 농도 200 μL 살균 microtip 통과하여 BSK 미디어 펠렛을 resuspend. 전지은 높은 세포 밀도에서 resuspended 있으며, 세포 현탁액은 즉시 microinjection 함께 클럼프 사용해야합니다 수 있기 때문에. </li></ol> 3. 준비 거려 <ol><li> 유리 슬라이드에 대한 명확하고 양면 접착 테이프를 넣으십시오. </li><li> 끈적끈적한 매트 작업을 신중하게 작은 브러시를 사용하여 컨테이너에서 nymphal 진드기를 제거합니다. </li><li> 같은 방향, 최대 접착 테이프, 복부 측면에 주입하는 진드기의 필요한 숫자를 놓습니다. </li></ol> 4. 주입 거려 <ol><li> B. 5 μL를 로드할 20 μL microloader 피펫 팁 (Eppendorf)를 사용하여 가져온 모세관 바늘로 burgdorferi 문화. 갇혀있는 공기 방울을 위해 바늘을 검사하고 필요한 경우, 세균성 문화와 바늘을 다시로드합니다. </li><li> 해부 쌍안 현미경 진드기를 확인하고 체크의 항문 조리개 영역에 중점을두고 있습니다. 부드럽게 직경이 microinjection 바늘을 형성 틱의 항문 구멍보다 약간 작은 튜브를 휴식하기 위하여 모세관 바늘의 팁을 터치. 아닌 적절한 바늘 팁과 진드기를 삽입하는 모든 시도가 주입 틱의 부상 가능한 사망 원인으로이 단계는 중요합니다. </li><li> 해부 쌍안 현미경 고정 진드기를 놓고 두 이동식 항문 플레이트에 의해 덮여있다 항문 구멍에 중점을두고 있습니다. 고급 집게를 사용하여 부드럽게 터치와 항문 구멍 근처에있는 지역으로 매우 가벼운 압력을 적용합니다. 이것은 항문 접시와 용기를 연결 항문 구멍의 오프닝의 분리를 허용합니다. 항문 접시의 강제 개방을 통해 항문 조리개에 약간 바늘의 팁을 조심스럽게를 삽입합니다. 유리 끝에서 항문에 연결 반투명 hindgut가 손상될 수로 바늘을 삽입은 최소로 보관해야합니다. 자동 발 제어 (Eppendorf)이 장착된 microinjector 사용하여 B를 주입 1000 hectopascals (고전력 증폭기) 사출 압력, 0.2 초 분사 시간과 8 고전력 증폭기 보상 압력 : 다음 매개 변수를 사용하여 burgdorferi 솔루션입니다. 각 틱은 단일 주사를 받게됩니다. </li><li> microinjection에 따라, 진드기는 미리 분사 상태로 유사한 행동해야합니다. 예를 들어, 틱은 자극에 대한 응답으로 크롤 링해야합니다. </li><li> 우리는 일반적으로 진드기가 24으로 설정 환경 챔버에서 48 시간 동안 복구할 수 있도록 ° 16시간 / 8시간 진한 / 라이트 photoperiod 처방과 95 %의 습도와 C. 챔버 사용할 수없는 경우, 주입 진드기는 이러한 일반 건조기 챔버로 공기 꽉 컨테이너 내의 습한 조건에서 상온에서 보관 수 있습니다. 필요한 경우 생쥐 먹이로 사용하기 전에, 진드기의 복구 시간도 몇 시간이 단축 될 수 있습니다. </li></ol> 2. B. 공촛점 Immunofluorescence 현미경으로 burgdorferi 현지화 1. 해부 거려 <ol><li> 인산염의 비말을 장소 현미경을위한 폴리 - L - 라이신 코팅 슬라이드 (시그마)에 절개하여 다른을위한 깨끗한 유리 슬라이드에 호수 (PBS)를 버퍼. 양면 접착 테이프와 다른 유리 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 작은 브러시를 사용하여 양면 접착 테이프에 컨테이너와 장소에서 체크를 제거합니다. </li><li> 해부 현미경으로 체크보기 및 중점을두고 있습니다. 다리의 첫 번째와 두 번째 쌍 사이의 체크에 날카로운 면도날을 넣으십시오. 단단히 복부에 액세스할 수 있도록 두 가지의 체크를 절단 아래 버튼을 누르십시오. 즉시 잠수함 PBS의 비말에서 복부합니다. </li><li> 아주 좋은 집게를 사용하여, 상처의 위치 주변의 지느러미와 복부 외골격를 잡아. 조심스럽게 갈색 색깔 굿 diverticula를 노출 체크에서 지느러미 방패를 당겨 멀리. 항상 PBS에서 해부 진드기를 유지하기 위해주의하십시오. </li><li> 세미 반투명 침샘 롤빵dles은 창자의 앞쪽에 지역의 양쪽에 위치하고 있으며, 원하는 경우이 시점에서 제거할 수 있습니다. 포셉과 장소에 남아있는 외골격을 잡고 조심스럽게 복부의 창자를 끄집어. </li><li> (예를 들어, 기관)에 갇혀있는 조직을 제거하여 직감을 부드럽게 닦아주십시오. </li><li> 좋은 포셉의 팁을 사용하면 신속하게 폴리 - L - 라이신 유리 슬라이드에 PBS의 비말에 체크 굿를 전송할 수 있습니다. 좋은 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 창자를 분리하거나 부드럽게 잘 포셉의 끝과 함께 눌러. 조심스럽게 굿 조직 주위에 여분의 PBS를 대기음. </li><li> 굿 조직은 상온에서 건조 공기 수 있습니다. </li><li> 10 분 아세톤에 잠수함이 잠수하여 체크 굿을 수정. 상온에서 건조 공기 수 있습니다. 슬라이드는 공기 꽉 컨테이너에서 -20 ° C에서 몇 달 동안이 단계에서 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 더럽히는 것 <ol><li> 티슈를 사용하여 조직 주위에 여분의 수분을 제거하고 자궁 - 펜 또는 소수성 장벽 라이닝 장치에 의해 건조 틱 굿 주위에 원을 그립니다. 이것은 이후 부화 단계 동안 얼룩 솔루션을 유지하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 실온에서 30 분 하나 또는 차단 버퍼의 몇 방울 (0.05 % PBS에서 트윈 - 20, 5 % 염소 혈청)와 체크 굿 표지. 차단에 사용되는 혈청은 항체에 대한 호스트 동물의 소스에 따라 다릅니다. 슬라이드가이 시점에서 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 천천히 차단 버퍼를 대기음. 적절한 기본 및 / 또는 보조 항체 솔루션의 용기를 품어. 안티 B. 라벨 - 우리는 플루오레신 isothiocyanate (FITC)를 사용 실온에서 1 시간 버퍼를 차단에서 1:100 희석에 burgdorferi 항체 (Kirkegaard &amp; 페리 연구소). 조명에 노출을 제한하기 위해 알루미늄 호일로 용기를 커버. </li><li> 부드러운 흡인하여 항체 솔루션을 제거합니다. 예 : 4로 레이블 틱 조직에 형광 염료 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 또는 propidium 요오드화물의와 창자를 품어. 우리는 일반적으로 5 분 PBS에 20 μg / ML의 propidium 요오드화물의 (시그마)를 사용합니다. 상온에서. </li><li> 0.05 % PBS에서 트윈 - 20 3 번 씻으십시오. </li><li> 이러한 Slowfade (Invitrogen)로 antifade 시약을 포함하는 버퍼 글리세롤에 슬라이드를 장착하고 신중하게 유리 coverslip로 커버. 슬라이드는 공기 꽉 컨테이너 내에 네에서 몇 달 동안이 단계 ° C에 저장할 수 있습니다. 이미지와 B를 집중 공촛점 현미경 burgdorferi. </li></ol> 3. 대표 결과 microinjection에 nymphal 진드기의 위치와 B를 대표 이미지 틱 용기 burgdorferi 로컬 라이제이션은 그림 1에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2544/2544fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Microinjection와 B의 현지화 틱 굿에 burgdorferi. nymphal I.의 (A) 복부보기 scapularis 진드기는 microinjection을 위해 위치. 삽입 microinjection 니들 (화살표)로 아날 조리개 (화살촉)이 삽입된 페이지의 배율에 따라 표시됩니다. 좋은 forcep은 항문 접시와 microinjection을 위해 항문 구멍의 오프닝의 분리를 허용 신체에 부드러운 압력을 적용하는 데 사용됩니다. 바늘은 가시성을 향상시키기 위해 쿠매시 빛나는 파란색의 솔루션으로 가득 차 있습니다. (B) B.의 공촛점 immunofluorescence 이미징 대표 결과 틱 굿 이내 burgdorferi. 굿 diverticulum의 앞쪽에 지역은 표시됩니다. 굿 핵 및 spirochetes는 (화살표) propidium 요오드화물의 (붉은 색) 또는 FITC - 복합 방지 B.으로 표시 아르 각각 burgdorferi (녹색 색깔). 바 = 20 μm의.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 우리는 세균성 병원체 B.와 nymphal Ixodes의 진드기의 신속하고 효율적인 감염 microinjection 기반의 절차를 입증 burgdorferi. 우리는 또한 B.의 검색을위한 공촛점 immunofluorescence 절차를 설명 현장에서 틱 용기 burgdorferi. 우리의 시위는 nymphal 직감을 포함하지만, 이와 유사한 절차 또한 유충이나 성인 8,9 등 진드기의 다른 발달 단계에 대해 적용됩니다. 그러나, 그들의 작은 크기로 인해, 기술은 애벌레에 사용하기 위해 상대적으로 도전 수도 있지만 성인 진드기에 사용하기 위해 잘 적용해야합니다. B.와 진드기의 인공 감염의 다른 방법 burgdorferi는 유리 모세관 튜브 10까지 먹이 또는 문화 매체 11 침수에 의해 개발되었습니다. 이러한 방법은 효율적인 간단하고 상대적으로 저렴...

<table><tbody><tr><td>유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>수직 유리 풀러</td><td>Narishige International</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser 계수기</td><td>Hausser Scientific</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>Microloader 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td></td></tr><tr><td>FemtJet 풋 컨트롤러</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td></td></tr><tr><td>인산완충식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>필터 멸균</td></tr></tbody></table>

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

라임 병은 진드기 - 설치류 감염 사이클 1 자연 유지 spirochete 병원체 Borrelia burgdorferi와 감염에 의해 발생합니다. 틱 - 부담 murine 모델 2 실험실에서 라임 병을 연구하기 위해 개발되었습니다. 나이브 진드기는 B.에 감염 될 수 있지만 burgdorferi 감염 생쥐에서 그들을 먹이로, 털갈이 과정을 완료하는 데 개월 몇 주간 소요됩니다. 따라서, 이러한 microinjection 기반의 프로 시저로보다 신속하고 효율적인 틱 감염 기법의 개발 라임 질병 3,4의 연구를위한 중요한 도구입니다. 절차는 시간이 감염된 진드기를 생성하기 위해 필요하며 진드기의 코호트에서 spirochetes의 동일한 수량의 배달 제어할 수 있습니다. 이것은 B.의 세대로서 특히 중요합니다 마우스를 사용하여 자연적인 먹이 프로세스 burgdorferi 감염 진드기는 먹이 거려 사이에 병원균 부담의 변화 100 %의 감염 속도와 잠재적 결과를 보장하기 위해 실패합니다. 또한, microinjection은 B.와 진드기를 감염하는 데 사용할 수 있습니다 burgdorferi는 감쇠 변형 생쥐에 감염을 설정할 수 없습니다이며, 따라서 자연 진드기 5 인수 수없는 경우에는 분리합니다. 이 방법은 또한 진드기에 다른 생물 학적 재료의 다양한 제공하는 데 사용할 수있는 예를 들어, 특정 항체 또는 두 RNA 6 좌초. 이 문서에서는, 우리는 B를 체외에서 재배한에서 함께 nymphal 진드기의 microinjection을 설명합니다 burgdorferi. 우리는 또한 공촛점 immunofluorescence 현미경을 사용하여 체크 굿에서 라임 병의 병원균의 국산화에 대한 방법을 설명합니다.

라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

라임병은 진드기-설치류 감염 주기를 통해 자연계에서 유지되는 스피로헤타 병원체인 Borrelia burgdorferi의 감염으로 인해 발생합니다 1. ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 Borrelia bergii gertii 세포를 진드기 장 내에 미세 주입하여 국소화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유리 모세관 바늘을 준비하고 Borrelia bergii gertii 세포를 채웁니다. 그다음, 미세 주입을 통해 Borrelia bergii gertii 세포를 진드기 장 내부로 옮깁니다.그 후 진드기를 해부하여 장 조직을 제거합니다. 마지막으로, 진드기 장 내 beberg defer의 면역형광 표지를 수행합니다. 최종적으로 공초점 현미경을 사용하여 진드기 장 내 beberg to ferry의 국소화를 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 메릴랜드 대학교 수의학과 조교수 Ruth Paul Paul 박사입니다. 오늘은 제 연구실 구성원인 박사후 연구원 Toro Cairo와 대학원생 Adam Coleman이 저희 실험실에서 일상적으로 수행하는 미세주입을 통한 진드기의 인공 감염 절차를 보여드리겠습니다. 미세주입 후에는 진드기를 해부하고 공초점 레이저 주사 현미경(confocal LE microscope)을 사용하여 진드기 장 내의 박테리아를 이미징하겠습니다.천연 감염된 진드기 세대를 생성하는 대신 진드기에 직접 미세주입을 하는 주요 장점은 시술 소요 시간입니다. 미세주입을 통해 전체 절차를 수주에서 수 시간으로 단축할 수 있으며, 천연 흡혈 과정을 통해 감염된 진드기를 생성하려면 약 5주가 소요됩니다. 이 기술은 RNAi를 위한 이중 가닥 RNA나 특정 항체 간섭을 위한 항혈청과 같은 다른 유용한 시약을 진드기 내부에 주입하는 데에도 적용될 수 있습니다.먼저 유리 마이크로피펫 풀러(glass micropipet pull device)를 사용하여 1mm 유리 모세관을 가열하고 당겨 여러 개의 미세주입 바늘을 제작합니다. 취약한 모세관들을 조심스럽게 제거하십시오. 제작된 바늘들의 팁이 위를 향하도록 페트리 접시 안의 접착 테이프 위에 모아 보관합니다.다음으로, BSK 배지에서 b berg de ferry를 배양합니다. 1mL당 약 10⁷ cells 농도가 되도록 배양한 후, 3000 ×g에서 10분간 원심분리하여 b berg de ferry 펠릿을 형성합니다. 상온에서 상층액을 제거하고, 200 µL 멸균 마이크로팁을 통해 부드럽게 분산시켜 펠릿을 BSK 배지에 완전히 재현탁하여 최종 농도를 1mL당 10⁹ cells로 맞춥니다.세포가 높은 세포 밀도로 재현탁되어 서로 뭉칠 수 있으므로, 세포 현탁액은 미세주입에 즉시 사용해야 합니다. 진드기를 준비하려면 점착 매트 위에서 글라스 슬라이드에 투명 양면테이프를 붙이십시오. 용기에서 진드기를 조심스럽게 꺼내어, 작은 브러시를 사용하여 주입할 필요한 수의 진드기를 복부가 위로 향하게 하여 동일한 방향으로 양면테이프 위에 배치합니다. 풀드 모세관 바늘에 beberg de ferry 배양액 5 µL를 채웁니다. 20 µL 마이크로 로드 피펫 팁을 사용하여 바늘에 갇힌 공기 방울이 있는지 확인하고, 박테리아 배양액을 다시 채웁니다.필요한 경우, 해부용 실체 현미경으로 진드기를 관찰하며 진드기의 항문 개구부 영역에 초점을 맞춥니다. 모세관 바늘의 끝부분을 가볍게 건드려, 직경이 진드기의 항문 개구부보다 약간 작게 부러뜨려 미세 주입 바늘을 만듭니다. 적절하지 않은 바늘 팁으로 진드기에 주입을 시도하면 부상을 입거나 사망할 수 있으므로 이 단계는 매우 중요합니다.주사된 진드기를 대상으로 합니다. 고정된 진드기를 해부용 쌍안 현미경 아래에 두고 두 개의 가동성 항문판으로 덮여 있는 항문 개구부에 초점을 맞춥니다. 미세 핀셋을 사용하여 항문 개구부 근처의 임의의 영역을 가볍게 터치하고 매우 약한 압력을 가합니다.이렇게 하면 항문판을 분리하고 장과 연결되는 항문공을 열 수 있습니다. 항문판의 강제 개구부를 통해 바늘 끝을 항문 구멍 속으로 조심스럽게 살짝 삽입하십시오. 유리 팁이 직장과 연결된 반투명한 후장을 손상시킬 수 있으므로 바늘 삽입은 최소한으로 해야 합니다.자동 풋 컨트롤이 장착된 마이크로 인젝터를 사용하여 다음 파라미터에 따라 베버그 드 페리(beberg de ferry) 용액을 주입하십시오: 주입 압력 1000 Hector Pascals, 주입 시간 0.2 seconds, 보정 압력 8 Hector Pascals. 마이크로인젝션 후 각 틱(tick)에 한 번씩 주입합니다.진드기는 주입 전과 마찬가지로 자극에 반응하여 움직이거나 기어가는 모습을 보여야 합니다. 면역형광 현미경 관찰을 위해 진드기를 해부하려면, 먼저 해부용 깨끗한 유리 슬라이드 위에 인산 완충 식염수 한 방울을 떨어뜨리고, 폴리 L-라이신(poly L lysine)이 코팅된 슬라이드 위에 또 한 방울을 떨어뜨립니다. 현미경 관찰을 위해 양면테이프가 부착된 또 다른 유리 슬라이드를 준비하십시오. 그다음, 용기에서 진드기를 꺼내 양면테이프 위에 놓습니다.해부 현미경 하에서 작은 붓을 사용하여 진드기에 초점을 맞춘 뒤, 첫 번째와 두 번째 다리 쌍 사이의 진드기 몸체 위에 날카로운 면도날을 놓습니다. 면도날을 강하게 눌러 진드기를 두 조각으로 절단하여 복부를 노출시키고, 미세 핀셋을 사용하여 복부를 즉시 PBS 한 방울 속에 담급니다. 절단 부위 주변의 등면 및 배면 외골격을 잡습니다.등판(dorsal shield)을 조심스럽게 들어 올려 진드기 몸체에서 분리하고, 갈색의 장 게실(gut diverticular)을 노출시킵니다. 해부 중인 진드기가 항상 PBS에 잠겨 있도록 주의하십시오. 반투명한 타액선(sali gland) 다발은 장의 앞쪽 양옆에 위치하며, 필요한 경우 이 시점에서 제거할 수 있습니다.포셉으로 남은 외골격을 고정한 상태에서 복부로부터 장을 조심스럽게 끌어냅니다. 기관과 같이 끼어 있는 조직들을 제거하여 장을 세심하게 세척합니다. 미세 포셉의 끝을 사용하여 진드기 장을 poly L lysine 글라스 슬라이드 위의 PBS 방울 속으로 빠르게 옮깁니다.미세 칼날을 사용하거나 미세 핀셋의 끝으로 부드럽게 눌러 장을 더 작은 조각으로 분리하십시오. 장 조직 주변의 과잉 PBS를 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오. 장 조직을 실온에서 공기 건조시키십시오.진드기 장을 아세톤에 10분 동안 담가 고정합니다. 실온에서 공기 건조시키십시오. 이 단계에서 슬라이드를 밀폐 용기에 넣어 -20 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 장의 면역형광 표지를 위해, 고정된 진드기 장 주변을 PAP 펜이나 다른 소수성 장벽 라이닝 장치로 원형으로 그리십시오.이렇게 하면 이후의 배양 단계 동안 염색액이 유지되는 데 도움이 됩니다. 진드기 장을 블로킹 버퍼 한두 방울로 덮고 실온에서 30분 동안 둡니다.블로킹에 사용되는 혈청은 항체 생성에 사용된 숙주 동물의 종에 따라 달라집니다. 이 단계부터 슬라이드가 마르지 않도록 주의하십시오. 블로킹 버퍼를 천천히 흡입하여 제거합니다.적절한 1차 및/또는 2차 항체 용액으로 장을 배양합니다. 본 실험에서는 fluorescein, isothiocyanate 또는 FXI로 표지된 anti B berg를 사용합니다. 항체를 블로킹 버퍼에 1:100로 희석하여 1시간 동안 처리합니다.실온에서 빛 노출을 제한하기 위해 알루미늄 호일로 용기를 덮습니다. 항체 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. DPI 또는 propidium iodide와 같은 형광 염료를 사용하여 진드기 조직을 염색하기 위해 장을 배양합니다.일반적으로 PBS에 용해된 20 µg/mL의 peridium iodide를 사용하여 상온에서 5분 동안 처리한 후, 0.05% tween 20이 포함된 PBS로 5분 동안 3회 세척합니다. 마지막으로, Antifa 시약이 포함된 완충 글리세롤로 슬라이드를 마운팅하고 유리 커버로 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드 글라스는 이 단계에서 밀폐 용기에 담아 4 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있으며, 공초점 현미경으로 b berg de ferry의 이미지 및 국소화를 관찰합니다.가시성을 위해 kumasi brilliant blue가 충전된 바늘을 사용하여 진드기에 미세주사하는 모습이 여기에 제시되어 있습니다. 미세 핀셋을 사용하여 몸체에 부드럽게 압력을 가함으로써 항문판을 분리하고 항문공을 열어 미세주사가 가능하게 합니다. 여기서는 장 내부에 beberg ferry가 포함된 장게실의 전방 부위가 나타나 있습니다.장 핵과 스피로헤타는 각각 propidium iodide 또는 fitzy conjugated anti beberg ferry로 염색합니다. 숙달된 후에는 10마리의 진드기에 각각 10만 마리의 생존하는 fer 감염균을 미세 주입할 수 있음을 확인했습니다. 진드기를 다른 실험에 즉시 사용할 수도 있지만, 일반적으로는 다음 단계로 진행하기 전에 진드기가 처치 후 생존했는지 확인하기 위해 1~2일 정도 기다립니다.이 영상을 시청하신 후에는 공초점 면역형광법을 사용하여 진드기 장 내에 미세 및 국소 장벽 벌레를 통해 인공 감염 진드기를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 진드기를 다루거나 Borrelia burgdorferi와 같은 인체 병원균이 채워진 미세 유리 바늘을 사용하는 작업은 수행 중에 위험할 수 있습니다. 진드기와 바늘의 위치를 항상 유의하시고, 항상 생물안전 2등급(BSL-2) 예방 조치를 준수하십시오.시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

감염된 진드기의 hemolymph, 침샘, 그리고 타액의 컬렉션 병원균이 질병을 일으킬 방법 진드기 매개로 공부하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는 먹이로부터 hemolymph과 침샘을 수집하는 방법을...

Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

중첩 된 PCR 틱 보렐 리아 burgdorferi, Lyme 질병의 원인이 되는 에이전트에 대 한 조사를 DNA 추출에 적용 될 수 있는 민감한, 특정, 그리고 간단한 기술입니다. 초기 PCR 실험 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 내부 뇌관을 사용 하 여 후속 반응에 대 한 템플릿 되 긴 amplicons 생성.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

진드기 혈 림프의 분석은 몇몇 병원 체가 질병을 일으키는 원인이 되는 방법에 대 한 정보의 중요 한 근원 및 어떻게 진드기 면역 학적으로이 감염에 반응 하는지 나타냅니다. 본 연구는 곰 팡이 propagules 접종 하 고 rhipicephalus 마이크로 플러스 튀 여성에서 혈 림프를 수집 하는 방법을 보여줍니다.

무척 추 병리학 연구를 향한 Rhipicephalus 마이크로 플러스 진드기에 Metarhizium 발 파 포자의 혈 림프 수집 및 접종을 공개

박테리아 세포 사이에서 DNA를 이동하는 박테리오파지의 능력은 박테리아 숙주의 유전자 조작에 효과적인 도구입니다. 여기에 제시된 것은 보렐리아 부르그도르페리의 박테리오파지인 φBB-1을 유도, 회수 및 사용하여 라임병 스피로체의 다른 균주 사이에서 이종 DNA를 형질도입하는 방법론입니다.

라임병 스피로체테 보렐리아 부르그도르페리의 파지 매개 유전자 조작

여기에 제시된 것은 다양한 진드기 수명 단계의 부분적 또는 전체 충혈을 허용하기 위해 인공 막 시스템을 통해 시험관 내에서 진드기를 혈액으로 공급하는 방법입니다.

Ixodes 견갑골에 대한 진드기 인공 막 공급

전기 천공은 Rickettsia 속에 외인성 DNA를 도입하기 위해 빠르고 광범위하게 채택 된 방법입니다. 이 프로토콜은 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아의 형질 전환에 유용한 전기 천공 방법을 제공합니다.

Rickettsia spp.를 Tick 세포주에서 형광 단백질 발현 셔틀 벡터로 형질전환하기 위한 전기천공 방법

여기에서는 먹이를 먹인 개별 진드기를 해부한 후 타액, 혈림프, 침샘 및 중장을 수집하여 진드기 매개 병원체의 조직 특이적 국소화를 연구하여 벡터 능력 및 병원체-미생물군집 상호 작용에 대한 이해를 높이는 프로토콜을 제시합니다.

개별 진드기(Acari: Ixodidae)에서 타액, 혈림프, 침샘 및 중장 추출

이 방법은 3D 프린팅 챔버와 실험실에서 제작한 실리콘 막을 통합한 시험관 내 진드기 혈액 공급 시스템 개발을 개략적으로 설명합니다. 이 시스템은 진드기 인공 먹이를 가능하게 하여 다양한 먹이 단계에서 쉽게 샘플링할 수 있고, 혈액량도 적어 이조디드 진드기 연구에 매우 유용한 도구가 됩니다.

Ixodid 진드기 연구에서 3D 프린팅된 챔버의 인공 막을 통해 진드기 혈액을 공급하는 모습

학습하세요 진드기 장내에서 Borrelia burgdorferi를 빠르게 감염시키고 면역형광법으로 병원균을 정밀하게 위치시키는 방법을. 이 기술은 라임병 전파 메커니즘 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

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