2011년 2월 14일
라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.
이 절차의 전반적인 목표는 진드기 장에 보렐리아 베르크 드 페리 세포를 마이크로 주입하고 국소화하는 것입니다. 이것은 먼저 유리 모세관 바늘을 준비하고 beberg de ferry 세포로 채워서 수행됩니다. 다음으로, 베버그 연기 세포는 미세 주입을 통해 진드기 장으로 전달됩니다.
그런 다음 진드기를 해부하고 장 조직을 제거합니다. 마지막으로, 진드기 장에서 beberg defer의 면역형광 표지를 수행합니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경을 사용하여 beberg가 진드기 내장에서 운반하는 것의 국소화를 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.
안녕하세요, 저는 메릴랜드 대학교 수의학과 조교수인 루스 폴 폴 박사입니다. 오늘 제 연구실 멤버이자 박사 후 연구원인 토로 카이로(Toro Cairo)와 대학원생인 아담 콜먼(Adam Coleman) 두 분이 실험실에서 일상적으로 하는 미세 주입을 통한 진드기의 인공 감염 절차를 보여드릴 것입니다. 미세주입 후, 진드기를 해부하고 컨포칼 CE 현미경을 사용하여 진드기 장에 있는 박테리아를 이미지화합니다.
자연적으로 감염된 진드기 세대의 진드기 미세주입의 주요 장점은 절차의 지속 기간입니다. 미세 주입은 자연적인 섭식 과정에서 감염된 진드기를 생성하는 데 약 5주가 필요하므로 전체 절차를 몇 주에서 몇 시간으로 단축합니다. 이 기술은 RNAi를 위한 이중 가닥 RNA 또는 진드기 내부의 특정 항체 간섭을 위한 antisera와 같은 다른 유용한 시약을 주입하도록 조정할 수도 있습니다.
시작하려면 유리 마이크로피펫 당김 장치에서 1mm 유리 모세관 튜브를 가열하고 당겨 여러 개의 마이크로주입 바늘을 제작합니다. 깨지기 쉬운 모세관 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 고인 바늘을 페트리 접시에 접착 테이프에 끝이 위를 향하도록 보관합니다.
다음으로, BSK 문화에서 b berg de ferry를 성장시키십시오. 중간 농도 약 10 내지 밀리리터 펠릿 당 7 세포, b berg de 페리, 10 분 동안 3000 번 G에서 원심 분리. 실온에서 스내트를 제거하고 200마이크로리터 멸균 마이크로팁을 10에서 밀리리터당 9셀의 최종 농도까지 부드럽게 통과시켜 BSK 배지에서 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
세포는 높은 세포 밀도에서 재현탁하고 뭉칠 수 있기 때문에 세포 현탁액을 즉시 사용하여 미세 주입하여 진드기를 준비하고, 끈적한 매트 위에서 작업하는 유리 슬라이드에 투명한 양면 접착 테이프를 놓고 용기에서 진드기를 조심스럽게 제거합니다. 작은 브러시를 사용하여 접착 테이프에 주입할 필요한 수의 진드기를 복부 쪽이 같은 방향을 향하도록 놓습니다. 5마이크로리터의 beberg de ferry 배양을 풀링된 모세관 바늘에 넣습니다. 20마이크로리터 마이크로 부하의 피펫 팁을 사용하여 바늘에 갇힌 기포가 있는지 검사하고 박테리아 배양으로 바늘을 다시 로드합니다.
필요한 경우 해부 쌍안 현미경으로 진드기를 보고 진드기의 항문 구멍 영역에 초점을 맞춥니다. 모세혈관 바늘의 끝을 부드럽게 만져 직경이 진드기의 항문 구멍보다 약간 작은 튜브를 부러뜨려 미세 주사 바늘을 형성합니다. 적절하지 않은 바늘 끝으로 진드기를 주입하려는 시도는 부상과 사망을 초래할 수 있으므로 이 단계는 매우 중요합니다.
주입된 진드기에. 움직이지 않는 진드기를 해부 쌍안 현미경 아래에 놓고 두 개의 움직일 수 있는 항문 플레이트로 덮인 항문 구멍에 초점을 맞춥니다. 가는 집게를 사용하여 항문 구멍 근처의 모든 부위를 부드럽게 만지고 매우 약한 압력을 가합니다.
이렇게 하면 항문 플레이트가 분리되고 장과 연결된 항문 구멍이 열릴 수 있습니다. 항문 플레이트를 강제로 열어 바늘 끝을 항문 구멍에 약간 조심스럽게 삽입합니다. 바늘 끝은 직장에 연결된 반투명한 뒷내장을 손상시킬 수 있으므로 바늘 삽입을 최소화해야 합니다.
자동 풋 컨트롤이 장착된 마이크로 인젝터를 사용하여 다음 매개변수를 사용하여 beberg de ferry 솔루션을 주입합니다. 1000 헥터 파스칼 주입 압력, 주입 시간 0.2초, 8 헥터 파스칼 보상 압력. 각 진드기는 미세주입 후 한 번 주사를 받습니다.
진드기는 주사 전과 유사한 자극에 반응하여 움직임이나 기어 다니는 징후를 보여야 합니다. 면역형광 현미경 검사를 위해 진드기를 해부하려면 먼저 인산염 완충 식염수 한 방울을 깨끗한 유리 슬라이드에 놓고 다른 한 방울을 박리하기 위해 폴리 L 라이신 코팅 슬라이드에 놓습니다. 현미경 검사를 위해 양면 접착 테이프가 있는 다른 유리 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 용기에서 진드기를 제거하고 양면 접착 테이프에 붙입니다.
해부 현미경 보기 아래에 있는 작은 브러시를 사용하여 진드기에 초점을 맞추고 첫 번째 다리와 두 번째 다리 쌍 사이의 진드기에 날카로운 면도날을 놓습니다. 세게 눌러 진드기를 두 조각으로 자르고, 복부를 노출시키면 즉시 복부가 미세한 집게를 사용하여 PBS 방울에 잠깁니다. 절단 부위 주변의 등쪽과 복부 외골격을 잡습니다.
등쪽 보호대를 조심스럽게 위로 당겨 진드기로부터 멀리 떨어뜨려 갈색을 띤 장 게실을 노출시킵니다. 해부 진드기가 항상 PBS 아래에 있도록 주의하십시오. 반투명 살리샘 다발은 장 전방 영역의 양쪽에 위치하며 원하는 경우 이 시점에서 제거할 수 있습니다.
남은 외골격을 집게로 제자리에 잡고 복부에서 장을 조심스럽게 빼냅니다. 기관과 같이 갇힌 조직을 제거하여 장을 조심스럽게 청소하십시오. 가는 집게 끝을 사용하여 진드기 내장을 폴리 L 라이신 유리 슬라이드의 PBS 방울로 빠르게 옮깁니다.
가는 칼날을 사용하거나 가는 집게 끝으로 부드럽게 눌러 장을 더 작은 조각으로 분리하십시오. 장 조직 주위의 과도한 PBS를 조심스럽게 흡인합니다. 장 조직이 실온에서 공기 건조되도록 합니다.
진드기 내장을 아세톤에 10분 동안 담가 고정합니다. 자연 건조시키면 실온 슬라이드는 이 단계에서 섭씨 영하 20도의 밀폐 용기에 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 장의 면역형광 표지를 위해 자궁 펜이나 기타 소수성 장벽 내벽 장치로 고정된 진드기 장 주위에 원을 그립니다.
이는 후속 배양 단계에서 염색 용액을 유지하는 데 도움이 됩니다. 진드기 내장을 블로킹 버퍼(blocking buffer) 한 방울 또는 몇 방울로 30분 동안 덮습니다. 실온에서.
차단에 사용되는 혈청은 항체에 대한 숙주 동물의 출처에 따라 다릅니다. 이 시점부터 슬라이드가 건조되지 않도록 하십시오. 차단 버퍼를 천천히 흡인합니다.
적절한 1차 및/또는 2차 항체 용액으로 장을 배양합니다. 우리는 플루오레세인(fluorescein), 이소티오시아네이트(isothiocyanate) 또는 항 B 버그로 표시된 FXI를 사용합니다. 차단 버퍼에서 1-100 희석으로 항체를 1시간 동안 지연시킵니다.
실온에서는 용기를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 대한 노출을 제한하십시오. 부드러운 흡인으로 항체 용액을 제거합니다. 형광 염료로 장을 배양하여 DPI 또는 프로피듐 요오드화물과 같은 진드기 조직에 라벨을 부착합니다.
우리는 일반적으로 PBS에 20 밀리리터 페리듐 요오드화물을 실온에서 5 분 동안 사용하고 PBS에서 0.05 % 트윈 20으로 5 분 동안 3 번 세척합니다. 마지막으로, Antifa 시약이 함유된 완충 글리세롤에 슬라이드를 장착하고 유리 덮개로 조심스럽게 덮습니다. 이 단계에서 슬립 슬라이드는 밀폐 용기 이미지에 섭씨 4도에서 몇 달 동안 보관하고 컨포칼 현미경으로 국부적으로 b berg de ferry를 저장할 수 있습니다.
진드기 미세주입은 가시성을 위해 쿠마시 브릴리언트 블루로 채워진 바늘과 함께 여기에 나와 있습니다. 미세한 집게를 사용하여 몸에 부드러운 압력을 가하면 항문 플레이트를 분리하고 항문 모공을 열어 미세 주입을 할 수 있습니다. 여기서, 장 게실의 앞쪽 영역은 장 내 베버그 페리와 함께 표시됩니다.
장내 핵과 스피로헤테는 각각 프로피듐 요오드화물 또는 fitzy conjugated anti beberg 페리로 표지됩니다. 일단 숙달되면, 우리는 10 개의 진드기가 자연적으로 수십만 명이 살아남아 fer에 감염되는 마이크로 주입 힘이 될 수 있음을 발견했습니다. 진드기는 다른 실험에 즉시 사용할 수 있지만, 일반적으로 진행하기 전에 진드기가 절차를 견뎌낼 수 있도록 하루나 이틀을 기다립니다.
이 비디오를 시청한 후에는 컨포칼 면역 흐름을 사용하여 진드기 장 내에서 미세하고 국소적인 장벽 벌레에 의해 인공 감염된 진드기를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 마이크로: 브렐리아 브라이오르 프라이와 같은 인간 병원체로 채워진 진드기와 미세한 유리 바늘로 작업하는 것은 작업하는 동안 위험할 수 있습니다. 진드기와 바늘의 위치를 의식하고 항상 생물 안전 레벨 2 예방 조치를 실천하십시오.
지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 연구는 진드기에 Borrelia burgdorferi를 감염시키기 위한 마이크로 주사 기반 방법을 제시하여, 진드기 감염에 필요한 시간을 크게 줄입니다. 또한, 진드기 조직 내에서 병원체를 국소화하기 위한 면역형광 기술을 시연합니다.
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.