마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 숙주 조직 및 기관 내에서 감염 유기체의 국소화를 허용할 수 있는 살아있는 동물의 감염에 대한 정량적 이미지를 얻는 것입니다. 마취된 마우스는 먼저 기관내 발광 박테리아에 감염됩니다. 그런 다음 감염된 마우스에 루시퍼를 주입하여 IVIS 시스템에서 실시간 이미징을 수행할 수 있습니다.

전신 영상이 확보되면 감염된 폐를 적출합니다. 병원체의 실제 국소화를 입증하기 위해 분리된 장기의 이미징을 수행할 수 있습니다. 이미징 후, 폐는 균질화되고 미생물 부하의 정량화를 위해 박테리아 성장 배지에 희석 도금됩니다.

궁극적으로 숙주 내에 존재하는 병원체의 위치와 수를 실시간으로 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 실시간 이미징을 통해 살아있는 동물에서 병원체를 시각화하고 모니터링하여 미생물 감염의 공간적 틱에 대한 통찰력을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Mihi Chang 박사와 제 연구실의 연구원인 SWAT Cillo입니다.

먼저 복강내 투척으로 시작하여 6주에서 12주 된 판막 C 마우스에 100마이크로그램의 케타민과 10마이크로그램의 자일라진이 함유된 미리 혼합된 마취 용액을 주입합니다. 마취제가 효과를 발휘할 때까지 쥐를 우리에 다시 넣습니다. 마취가 완료되었는지 확인하려면 각 마우스의 풋 패드를 꽉 쥐고 페달 반사 반응이 발생하지 않는지 확인합니다.

동물이 완전히 마취되면 마우스 한 마리를 가져다가 삽관기에 놓습니다. 등을 대고 누워서 서십시오. 테이프를 사용하여 마우스의 다리와 팔을 스탠드에 고정합니다.

삽관대에 고무 밴드를 고정합니다. 그런 다음 마우스의 위쪽 앞니 아래에 놓습니다. 마우스가 움직이지 않으면 집게를 사용하여 혀를 입 밖으로 부드럽게 빼냅니다.

다음으로, 검이경으로 검경을 마우스의 입 안에 부드럽게 삽입하고 구인두의 복부 쪽에 있는 식도 앞에 위치한 후두 구멍을 찾습니다. 후두 개구부가 확인되면 카테터 허브가 앞니에 도달할 때까지 가이드 와이어가 포함된 22게이지 1인치 카테터를 기관에 삽입합니다. 가이드 와이어를 제거하고 카테터를 플라스틱 펌프에 연결합니다.

그런 다음 카테터에 공기를 밀어 넣습니다. 삽관이 정확하면 마우스의 가슴이 팽창합니다. 카테터의 올바른 배치가 확인되면 원하는 농도의 생물 발광 박테리아 용액 50마이크로리터를 카테터에 피펫팅하고 50마이크로리터의 공기가 든 1ml 주사기를 부착하여 용액을 마우스의 폐로 밀어 넣습니다.

두세 번 카테터를 제거하고 쥐를 케이지에 다시 넣어 마취에서 회복할 수 있도록 합니다. 생물 발광 이미징을 수행하기 전에 isoflurane을 사용하여 마우스를 마취합니다. 생쥐가 완전히 마취되면 유도실에서 쥐를 제거하고 광학 연고를 부드럽게 발라 동물의 눈을 보호합니다.

이미징하는 동안 마우스를 이미징 챔버에 각각 놓고 마취 매니폴드의 코뿔 중 하나를 놓습니다. 인접한 동물 피험자 사이에 빛이 반사되는 것을 방지하기 위해 마우스 사이에 가벼운 배플을 사용합니다. 마지막으로, 각 마우스에 루시퍼 체중 1g당 150마이크로그램을 복강내에 주입합니다.

루시퍼가 10분 동안 동물의 몸 전체로 흩어지도록 합니다. 그런 다음 이미징을 시작합니다. 리빙 이미징 소프트웨어를 시작하고 IVIS 이미징 시스템을 초기화합니다.

매개변수를 먼저 설정하려면 시퀀스 설정을 클릭합니다. 그런 다음 발광 및 사진 이미징 모드를 선택합니다. 이미지 시퀀스의 일부로 사진 발광 및 구조용 조명 이미지를 선택하여 DLIT 3D 재구성을 가능하게 합니다.

그런 다음 노출 시간을 1분으로 설정합니다. 그런 다음 비닝을 중간으로 조정하고 F-스톱을 1로 조정합니다. excitation filter를 block으로 설정하고 emission filters를 3D reconstruction을 위해 open으로 설정하면 서로 다른 파장의 여러 필터를 사용할 수 있습니다.

신호 소스의 정확한 위치 파악을 허용하려면 시각화되는 마우스의 수에 해당하는 FOV를 선택합니다. 모든 설정이 정의되면 획득 제어 패널의 이미지 마법사에서 추가를 클릭하여 시퀀스 설정을 추가하고 획득을 클릭하여 획득 중에 이미징 시퀀스를 시작합니다. 이미지 편집 창에 실험 세부 사항과 조건을 기록하고 이미지를 저장합니다.

마지막으로, 이미징 챔버에서 마우스를 제거하고 케이지로 되돌립니다. 동물이 마취에서 회복될 때까지 지속적으로 모니터링하십시오. 조직 이미징을 위해 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.

이 시점에서 각 마우스의 폐를 무균 상태로 적출하고 장기를 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 감염된 폐가 들어 있는 페트리 접시를 이미징 챔버 내부에 놓고 이 비디오에서 앞서 설명한 것과 동일한 방식으로 생물 발광 이미지를 획득합니다. 이미지가 확보되면 이미징 챔버에서 페트리 접시를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 균질화기를 사용하여 1ml의 멸균 PBS가 들어 있는 튜브로 폐를 옮기고 2-5분 동안 폐를 균질화합니다.

멸균 PBS에서 폐 균질화의 연속 희석을 준비합니다. 그런 다음 각 희석액 100마이크로리터를 선택적 배지가 포함된 페트리 접시에 플레이트합니다. 박테리아 군집이 명확하게 보일 때까지 섭씨 37도에서 배양물을 배양합니다.

그런 다음 CFU를 세어 감염 수준을 평가합니다. 라이브 이미지 소프트웨어를 시작하고 파일 브라우저에서 원하는 이미지 파일을 엽니다. 도구 팔레트에서.

이미지 조정을 클릭하여 보정 및 필터링 설정과 색상 스케일 임계값을 수정합니다. 발광 강도를 정량화하려면 풀다운 목록에서 관심 영역 또는 ROI 도구를 사용하고 ROI 형상 번호 및 크기를 선택합니다. 그런 다음 ROI 측정을 클릭하고 정량적 데이터 출력을 저장하여 3D 이미지를 재구성합니다.

먼저, 구조광 이미지를 포함한 이미지 시퀀스를 불러옵니다. 도구 팔레트에서 surface topography를 클릭합니다. 그런 다음 풀다운 리스트에서 reconstruct 탭을 선택하여 지표면 지형을 생성합니다.

그런 다음 도구 팔레트에서 DILT 3D 재구성을 선택합니다. 풀다운 목록에서 속성 탭을 클릭하고 조직 속성과 소스 스펙트럼을 muscle으로 설정합니다. 분석 탭을 클릭하고 분석할 파장을 선택합니다.

그런 다음 시작을 클릭합니다. 모든 설정이 조정되면 재생성을 클릭하여 3D 해석을 시작합니다. 3D 재구성이 완료되면 결과 탭을 클릭하여 결과를 표시할 3D 보기를 선택하고 광자 밀도, 데이터 복셀 및 알고리즘 매개변수를 보고 결과를 저장하고 추가 분석을 위해 데이터와 이미지를 내보낼 수 있습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이 10에서 6번째 CFU의 생물발광 박테리아에 기관내로 감염된 오른쪽의 두 쥐는 폐 영역에서 강한 신호를 생성하지만 왼쪽의 감염되지 않은 쥐는 그렇지 않습니다. 유사한 분석: 감염된 쥐에서 절개된 폐를 사용하는 것만으로도 발광이 밀접하게 병치된 다른 조직이 아니라 폐에서 방출된다는 것을 확인할 수 있습니다. 샘플에서 나오는 신호는 관심 영역 내에서 총 플럭스로 쉽게 정량화할 수 있습니다.

단층 촬영 분석을 통해 이러한 이미지에서 빨간색 상자로 표시된 발광의 위치가 3D 재구성에 의해 결정된 쥐의 폐가 포함된 영역 내에 속한다는 것을 확인합니다. 마지막으로, 왼쪽의 측정된 광자 밀도 곡선과 오른쪽의 시뮬레이션된 광자 밀도 곡선 사이의 유사성은 재구성의 우수한 품질을 증명합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 선례에 감염된 동물을 이미지화하고 이미지를 분석하여 회상의 위치 파악 및 정량화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.