Name: 마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 마우스에서 루시페라제를 활용한 생체 세균 감염 이미징 방법을. IVIS 시스템으로 실시간 감염 경로를 추적하고 폐 조직 내 병원체 위치를 정량 분석하는 기술입니다.

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저자는 본 연구를 통해 가치있는 토론 및 지원에 대한 시릴 실험실 구성원을 감사드립니다. 우리는이 프로토콜을 찍는 동안 박사와 여호수아 힐과 도움 박사 제임스 사무엘의 실험실 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원에서 빌 &amp; 멜린다 게이츠 재단과 부여 AI47866로부터 부여하여 48,523 후원했다.

1. Intratracheal 삽관법 의한 폐 감염 <ol><li> 마우스의 무게를하며, 선택, 마르크는 쉽게 식별이 귀에 만들 수 있습니다. </li><li> intraperitoneal 접종하여 마취제 (마우스 중량 g 당 100 μg)과 xylazine (마우스 중량 g 당 10 μg)와 생쥐를 마취. </li><li> 완전히 anesthetized까지 새장에 넣어 마우스. 페달 반응을 확인하기 위해 피트의 패드를 당겨요. 생쥐는 감소하거나 전혀 반사 반응이 표시되어야합니다. </li><li> 그 누워 삽관법 스탠드에 마우스를 놓습니다. </li><li> 삽관법 스탠드에 고무 밴드를 수정 후 마우스의 상단 incisors 아래로 놓으십시오. 다리와 삽관법 스탠드에 무기를 해결하기 위해 테이프를 사용하십시오. </li><li> 부드럽게 집게를 사용하여 입 밖으로 tougue 이동합니다. </li><li> 입 octoscope 내부와 검경를 삽입하고 후두의 오프닝을 볼 때까지 oropharynx 조사. </li><li> catether 허브까지 기관에 cathether으로 덮여 사전 가이드 와이어 incisors에 있습니다. 가이드 와이어를 제거합니다. 가슴 확장을 관찰하고 올바른 삽관법을 확인 cathether에 공기를 넣어. </li><li> 세균의 50 μL를 1 ML의 주사기를 사용하여 cathether을 통해 솔루션 (우리 연구실에 지어진를 클릭 비틀 레드 루시페라제 (CBRLuc)를 표현 바실 Calmette 게린 (BCG)를 사용하지만, 어떤 발광 세균의 변형을 사용할 수 있습니다 표시된 이미지) 주사. </li><li> 새장에 마우스를 대고 마취에서 회복하는 동안 그것을 관찰합니다. </li></ol> 2. 동물 Anesthetization 및 Bioluminescence 이미징을위한 준비 생쥐는 XGI - 8 가스 Aneshesia 시스템을 사용하여 isoflurane과 anesthetized 있습니다. <ol><li> XGI - 8 마취 시스템을 운영하기 전에, 각 숯 필터 용기를 무게와에있는 무게와 날짜를 써주세요. 무게 초기 무게 이상의 50g있다면, 새로운 용기로 교체하십시오. </li><li> 기화기의 isoflurane 수준을 확인하고 필요한 경우 정보를 입력합니다. </li><li> XGI - 8 마취 시스템의 전면에있는 피난 펌프를 켜고, 8 lpm (minuite 당 리터)로 설정합니다. </li><li> 고압 실린더의 산소 공급 켜고 55 psig로 설정합니다. </li><li> XGI - 8 마취 시스템의 전면에 토글 산소 (녹색)를 켭니다. </li><li> 가스 흐름의 수준을 설정 이미징 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 0.25 lpm로 설정하고 가스 흐름을 해제하십시오. </li><li> 가스 흐름의 수준을 설정하기 위해 마취 유도 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 1.5 lpm로 설정하고 가스 흐름을 해제하십시오. </li><li> 기화기 및 2-2.5 %로 설정된 isoflurane를 켭니다. isoflurane 수준은 사용중인 동물과 체중의 숫자에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> 장소는 유도 챔버에 마우스 및 뚜껑을 닫습니다. 유도 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 5 챔버에 넣어 마우스 - 10 minuites 그들은 완전히 마취까지. </li><li> 이미징 동안 마우스 눈을 보호하고 마취 매니폴드에 코 콘 중 하나에서 이미징 챔버에 쥐를 곳으로 눈 광학 연고를 적용하십시오. 인접 동물 과목에 빛의 반사를 방지하기 위해 마우스 사이의 가벼운 배플을 사용합니다. </li><li> intraperitoneal 접종에 의해 luciferin을 (150 μg / 체중 g) 주입. </li></ol> 3. Bioluminescence 이미징 <ol><li> 생활 이미징 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 시스템이 초기화되지 않은 경우 IVIS 이미징 시스템을 초기화합니다. </li><li> IVIS 수집 제어판의 순서 설정을 클릭하여 영상에 대한 매개 변수를 설정합니다. 이미징 모드에서 발광하고 사진을 선택합니다. DLIT 3D 재구성을 수행하는 옵션을 원하는 경우, 이미지 시퀀스의 일부로, 사진 발광 및 구조 밝은 이미지를 선택합니다. 0.5 초에서 10 분 거리에 노출 시간을 설정합니다. 비닝 및 F / 설정 샘플의 예상 밝기에 따라 중지합니다. 빛의 특정 파장를 얻기위한 계획하지 않는 한, 블록 및 오픈 필터 배기 필터 여기를 설정합니다. DLIT 3D 헌법의 경우, 소스의 정확한 현지화 수 있도록 서로 다른 파장의 여러 방출 필터를 설정합니다. 마우스 또는 동물의 지역 몇 군데로의 숫자에 따라 D로의 FOV를 설정합니다. 4-5 생쥐 1 마우스, 2-3 마우스에 대한 C 및 D에 대한 A와 B를 선택합니다. </li><li> 순서 설정을 추가 취득 제어판의 이미지 마법사에서 추가를 클릭합니다. </li><li> 취득을 클릭하여 이미지 시퀀스를 시작합니다. DLIT 3D 구조의 경우, 발광 이미지는 서로 다른 파장에서 여러 방출 필터 취득한 것입니다. 사진 및 구조 밝은 이미지도 인수한다. </li><li> 수집하는 동안 이미지 및 이미지 레벨 패널을 편집 표시됩니다. 편집에서 각 실험 나중에 시간에 이미지를 쉽게 추적을 보장하고 이미지를 저장하는 이미지에 대해 가능한 한 자세한 정보로 채웁니다. </li><li> IVIS 이미징 챔버에서 쥐를 ReRemove 그들의 연습장을 반환합니다. 회복을 준수마우스를 보장하기 위해 esthesia이 크게 절차에 의해 영향을받지 않았습니다. 그들은 완전히 마취 (대개 1-2 분)에서 복구까지 동물을 지속적으로 모니터링해야합니다. </li></ol> 4. 예 생체내 이미징 및 폐의 박테리아의 부량에 대한 CFU 분석 <ol><li> 안락사에 직전, 화상에 대해 같은 방식으로 luciferin intraperitoneally와 쥐를 주사. </li><li> luciferin 주입 후 100 MG / kg pentobarbitol 5 분의 intraperitoneal 주사하여 쥐를 안락사. </li><li> 무균 집게와 가위를 사용하여 무균 배양 - 요리에 마우스 및 장소에서 폐가 Explant. </li><li> 플레이스 배양 - 요리 영상 약실에 explanted 기관을 포함하여 전체 마우스 같은 방식으로 bioluminescence 이미지를 획득. </li><li> 이미징 후, 멸균 집게를 사용하여 배양 접시에서 explanted 기관을 제거하고 1 ML PBS에서 균질. </li><li> 적절한 선택 미디어에 dilutions 및 플레이트 조직을 만듭니다. 균질 조직은 그것이 필요해야 다시 도금을위한 -80 ° C를 저장할 수 있습니다. 또는 균질 조직은 RNA 또는 qPCR에 의해 박테리아 숫자를 정할 DNA 추출에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 발광 이미징 분석 <ol><li> "생활 이미징 소프트웨어"를 시작하고 이미지 파일을 찾습니다. </li><li> 이미지 조정 "도구 팔레트 '를 사용합니다. 이미지를 클릭 보정 / 설정 및 분 / 개인 색상 비늘을위한 최대 필터링을 수정할 수 조정합니다. </li><li> 빛의 강도의 부량 위해 풀다운 목록에서 투자 수익 (ROI) 도구를 사용하십시오. 선택 투자 수익 (ROI) 모양, 번호와 크기입니다. 이미지의 관심 영역에 드래그 투자 수익 (ROI) 프레임. 모든 투자 수익 (ROI)가 동일한 크기와 모양 있도록. 클릭하여 투자 수익 (ROI) 측정 및 저장, 복사 및 / 또는 양적 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li><li> DLIT 3D reconstructions의 경우, 구조 밝은 이미지를 포함한 이미지 시퀀스를로드합니다. 플래트 도구의 표면 지형을 클릭합니다. 풀다운 목록에서 표면 지형을 생성 탭을 재구성을 클릭합니다. 표면 엉망 그러면 창에 나타납니다. </li><li> 도구 플래트에 DLIT 3D 재구성을 선택합니다. 풀다운 목록에서 조직 속성과 소스 스펙트럼을 설정하는 속성 탭을 클릭합니다. 근육은 대부분의 상황에서 권장합니다. 풀다운 목록에서 분석 파장을 선택하기 위해 분석 탭을 클릭하십시오. 매개 변수 탭을 클릭하고 기본값을 확인하거나 필요한 경우 DLIT 매개 변수를 조정합니다. 3D 분석을 시작 탭을 재구성 클릭하십시오. </li><li> 3D 재건이 완료되면, 3D보기 3D 재건의 결과를 표시합니다. 광자 밀도, voxels 및 DLIT 알고리즘 매개 변수에 대한 분석 데이터를 볼 결과 탭을 클릭합니다. </li><li> 저장 및 / 또는 숫자 및 데이터 파일에 3D 재건 분석의 결과를 내보냅니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 감염되지 않은 마우스 컨트롤과 함께 발광 생물 박테리아에 감염된 생쥐의 bioluminescence 이미지는 그림 1에 표시됩니다. 발광 생물 박테리아에 감염된 쥐 폐는 폐 (그림 1)에서 중요한 신호를 생산하고 있습니다. 발광 강도는 투자 수익 (ROI) 내에 총 유량 (관심 영역의) (그림 2)로 계량입니다. 빛의 강도에 대한 정량적 데이터는 신호가 발광 생물 박테리아에서 생산하고 대조군에 비해 수 있는지 확인하기 위해 폐에서 얻은 박테리아의 콜로니 형성 단위 (CFU)에 대한 표준입니다. 신호의 위치와 강도는 더욱 마우스 표면에 11 tomography에 따라 발광 소스의 DLIT 3 차원 재구성하여 분석하실 수 있습니다. 이러한 분석은 부량 및 생산 발광 생물 신호의 지방화를 허용합니다. 감염된 생쥐에서 발광 소스 3D 재건의 결과는 표시등이 마우스의 폐 (그림 3)에서 생산 보여줍니다. 그 발광 확인 결과 마우스 폐의 전직 생체내 이미지는 오히려 다른 밀접하게 juxtaposed 조직 또는 기관 (그림 2C)보다, 폐에서 배출됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. CBRluc 태그 발광 생물 박테리아와 폐 감염 마우스의 발광 이미징. 감염되지 않은 컨트롤 마우스 왼쪽에 두 감염된 생쥐는 오른쪽에 있습니다. 생쥐는 intratracheal 경로를 통해 CBRluc (N에게 = 2)을 표현하는 박테리아에 감염되었습니다. 지느러미, 복부, 왼쪽 및 오른쪽 : luciferin 주입 후 10 분, 발광 이미지는 4 순위 10 분 취득했다. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. CBRluc을 표현하는 박테리아에 감염된 생쥐에서 양적 빛의 강도. (A, B) 투자 수익 (ROI) 분석 및 지느러미 및 복부 위치에서 투자 수익 (ROI)에서 빛의 계량 총 자속의 발광 이미지, 각각. 감염되지 않은 마우스는 왼쪽에있는 두 감염된 생쥐는 오른쪽에 있습니다. 발광 이미지는 폐 O로부터 얻은되었습니다F 쥐를 감염되지 않은 그리고 CBRlux 감염 (N = 2). 폐 주변의 빛의 강도는 투자 수익 (ROI) 분석에 의해 계량했다. C) 감염되지 않은 (위) 및 감염 (아래 폐 두 세트)를 생쥐의 폐의 전직의 생체내 이미지. 다음 인수했다 안락사와 이미지의 전 Luciferin 5 miniuts을 주입했다. 계량 값은 CFU으로 표준 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 폐 감염 마우스 bioluminescence 소스 (S)의 3D 재구성은. 마우스 intratracheal 주사로 CBRluc을 표현하는 박테리아에 감염되었습니다. 이미지 시퀀스는 540 nm의 700 nm의 파장에 일련의 다른 방출 필터를 사용하여 인수되었다. 이미지 시퀀스 구조 imag가 포함된 동물 과목에서 발광 소스 3D reconstitution 사용되었다. A) 마우스에 대한 tomography은 다른 위치에 표시됩니다 : 앞, 뒤로, 왼쪽 및 오른쪽. 광원은 재건축에 의해 결정으로 폐 내에 위치하고 있습니다 voxels (3D 마우스 이내에 빨간색 상자)로 표시됩니다. 측정 및 시뮬레이션 데이터의 B) 광자 densiy지도. 측정 및 시뮬레이션 광자 밀도 곡선은 재건의 품질 정보를 제공하는 비교. 유사한 측정 및 시뮬레이션 광자 밀도의 양질의 reconstructions 결과.

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</ol>

동물 연구는 텍사스 A &amp; M 대학의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

이러한 프로토콜을 다음과 같은 일반적으로 고품질 이미지를 얻을 수 있지만, 그것은 영상 연구에서 정확하고 일관된 데이터를 얻기 위해 몇 가지 주요 문제를 고려하는 것이 중요합니다. 발광 이미지는 신호가 배경 위에되고 카메라가 포화되지 않도록하기 위해 600 60000로 카운트를 갖고 취득해야합니다. 얻은 신호 미만 600 경우 노출 조건은 카운트를 증가 조정해야합니다. 얻은 신호가 60,000 이상의 경우 카메라는 일부 지역에서 포화 수 있습니다. 카메라가 포화되면, 부량은 아직 가능하지만, 포화 지역의 시도와 비 포화 지역에 따라 때로는 필요 없을 것입니다. 지역이 재건을위한 마스크에 사용되고있는 지역 내에 포함되어있는 포화 때 또한, 3 차원 재구성 정확하게 진행하실 수 없습니다. 노출 시간의 조정, 비닝 및 F / 정지 영상 취득뿐만 아니라 이미징 지역이나 동물 위치 수정 얻은 신호를 제어 및 데이터의 정량 분석​​을 허용할 수 있습니다. 따라서, 많은 실험에 이미지 하나 이상의 집합이 정량 분석​​을 허용하는 데 필요한...

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>GMT</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal plus solution</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카테터 (22G x 1&amp;#8221;)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>가이드 와이어</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3491</td><td></td></tr><tr><td>스펙큘럼 포함 옥토코프</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3748</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 시스템</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas 마취 시스템</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging 소프트웨어</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투명 노즈콘</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광차단 배플 디바이더</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

이미징은 생물 학적 과정을 모니터링하는 데 사용할 수있는 가치있는 기술입니다. 특히, 암 세포, 줄기 세포, 특정 면역 세포 유형, 바이러스 병원균, 기생충 및 박테리아의 존재는 동물 1-2 생활 내에서 실시간으로 따라 수 있습니다. 병원균의 연구에 bioluminescence 이미징의 응용 3-4 동물 모델에서 감염의 분석을 위해 기존의 전략에 비해 장점이 있습니다. 감염은 병원균의 위치와 수량을 결정하기 위해 안락사를하지 않고, 시간이 지남에 따라 각각의 동물 이내 시각하실 수 있습니다. 광학 이미징 오히려 이전에 감염된 것으로 알려져 사이트의 샘플링보다, 모든 조직과 기관의 종합적인 시험을 수 있습니다. 또한, 특정 조직에 접종의 정확성 직접 사전에 실패는 전체 실험에​​ 걸쳐 주사했다 앞으로 동물을 운반하는 결정하실 수 있습니다. 이미지는 각 동물이 개별적으로 따라야하는 수 있기 때문에 동물 사이의 변화가에 대해 제어할 수 있습니다. 이미징 크게 때문에 3-4 병원체 부하를 확인하기 위해 샘플 조직하지 않고 많은 시간이 지점에서 데이터를 얻을 수있는 능력을 필요로 동물의 숫자를 줄일 수있는 잠재력이있다. 이 프로토콜은 루시페라제을 표현하는 박테리아의 재조합 변종에 대한 bioluminescence 이미징을 사용하여 살아있는 동물에 감염을 시각화하는 방법을 설명합니다. 클릭 벌레 (CBRLuc)와 반딧불 luciferases (FFluc)는 기판 5-6로 luciferin을 활용한다. CBRluc와 FFluc 모두에 의해 만들어진 빛이 살아있는 동물 모델 7-9에서 광학 이미징 이러한 luciferases 훌륭한 기자 만들기, 500 nm의 700 nm의 파장에 대한 광범있다. 600 NM보다 빛의 파장은 헤모글로빈에 의해 흡수를 방지하고, 따라서, 효율적으로 포유 동물 조직을 통과하는 데 필요한 때문에 주로이다. 루시페라제는 유전자 빛의 신호 10 생산하는 세균에 소개됩니다. 마우스 실시간으로 감염 모니터링을 허용하는 intratracheally 발광 생물 박테리아와 주사 폐 있습니다. luciferin 주입 후, 이미지가 IVIS 이미징 시스템을 사용하는 인수입니다. 이미징 동안 마우스 XGI - 8 가스 Anethesia 시스템을 사용하여 isoflurane과 anesthetized 있습니다. 이미지가 집중하고 각각의 세균 감염 사이트 (S)과 전화 번호를 나타내는 신호 소스를 수치 분석하실 수 있습니다. 이미징 후, CFU 결정은 박테리아의 존재를 확인하는 균질 조직에서 수행됩니다. 박테리아의 여러 복용은 발광과 세균 숫자를 상관 관계를 규정하는 데 사용됩니다. 이미징은 항균 화합물과 백신의 효능의 pathogenesis 및 평가 연구에 적용할 수 있습니다.

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

이미징은 생물학적 과정을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 가치 있는 기술입니다. 특히 암세포, 줄기세포, 특정...

다음 실험의 전반적인 목적은 살아있는 동물 내 감염의 정량적 이미지를 얻어 숙주 조직 및 장기 내 감염 생물체의 위치를 파악하는 것입니다. 먼저 마취된 마우스의 기관 내에 생물 발광 박테리아를 감염시킵니다. 그 후 감염된 마우스에 Luciferian을 주입하여 IVIS 시스템을 통한 생체 내 이미징을 수행합니다.전신 영상을 획득한 후, 감염된 폐를 적출합니다. 분리된 장기의 영상을 촬영하여 병원균의 실제 국소화 위치를 확인할 수 있습니다. 영상 촬영 후, 폐를 균질화하고 세균 배양 배지에 희석 도말하여 미생물 부하량을 정량화합니다.최종적으로, 호스트 내에 존재하는 병원체의 위치와 수를 실시간으로 보여주는 결과를 얻게 됩니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 실시간 이미징을 통해 살아있는 동물 내에서 병원체를 시각화하고 모니터링함으로써 미생물 감염의 공간적 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있다는 점입니다. 이 실험 절차는 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr. Mihi Chang과 연구원인 SWAT Cillo가 시연하겠습니다.6~12주령의 BALB/c 마우스의 체중 1g당 ketamine 100 µg과 xylazine 10 µg이 포함된 혼합 마취제를 복강 내 주사하는 것으로 시작합니다. 마취제가 효과를 나타낼 때까지 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 마취가 완료되었는지 확인하기 위해 각 마우스의 발바닥 패드를 눌러 발 반사 반응이 일어나지 않는지 확인합니다.동물이 완전히 마취되면, 마우스 한 마리를 집어 기관 삽관대에 놓습니다. 마우스가 등을 대고 누운 자세가 되게 합니다. 테이프를 사용하여 마우스의 다리와 팔을 고정대에 고정합니다.기관 삽관 스탠드에 고무줄을 고정합니다. 그다음 고무줄을 생쥐의 상악 절치 아래에 배치합니다. 생쥐가 고정되면, 포셉을 사용하여 혀를 입 밖으로 조심스럽게 끌어냅니다.다음으로, 검이경이 장착된 질경을 마우스의 입안으로 조심스럽게 삽입하여 구인두의 복측, 식도 앞에 위치한 후두 개구부를 찾습니다. 후두 개구부를 확인하면, 가이드 와이어가 들어 있는 22 gauge 1인치 카테터를 카테터 허브가 절치에 닿을 때까지 기관 내로 삽입합니다. 가이드 와이어를 제거하고 카테터를 플라스틱 펌프에 연결합니다.그런 다음 카테터로 공기를 주입합니다. 삽관이 정확하게 되었다면 마우스의 흉부가 팽창합니다. 카테터가 올바르게 배치되었음을 확인하면, 원하는 농도의 생물 발광 박테리아 용액 50 µL를 카테터에 피펫으로 넣고, 50 µL의 공기가 들어 있는 1 mL 주사기를 연결하여 용액을 마우스의 폐로 밀어 넣습니다.두세 번 반복하여 카테터를 제거하고 마우스가 마취에서 회복될 수 있도록 케이지에 다시 넣습니다. 생물발광 이미징을 수행하기 전에 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 마우스가 완전히 마취되면 유도 챔버에서 꺼내고 동물의 눈을 보호하기 위해 안연고를 조심스럽게 도포합니다.영상 촬영 중에 마우스를 각각 영상 챔버에 넣고 코 콘을 마취 매니폴드에 연결하십시오. 인접한 실험 동물 간의 빛 반사를 방지하기 위해 마우스 사이에 라이트 배플을 설치하십시오. 마지막으로, 각 마우스의 복강 내에 체중 1g당 150 micrograms의 Lucifer를 주입하십시오.루시페레이즈(Luciferase)가 동물의 체내에 고루 퍼질 때까지 10분 동안 기다립니다. 그 후 이미징을 시작합니다. 생체 내 이미징 소프트웨어를 실행하고 IVIS 이미징 시스템을 초기화합니다.먼저 파라미터를 설정하려면 시퀀스 설정(sequence setup)을 클릭하십시오. 그런 다음 발광 및 사진 촬영 이미지 모드를 선택하십시오. DLIT 3D 재구성을 활성화하려면 이미지 시퀀스의 일부로 사진 발광 및 구조광 이미지를 선택하십시오.다음으로, 노출 시간을 1분으로 설정하십시오. 그런 다음 비닝(binning)을 중간으로, F-스톱을 1로 조정하십시오. 들뜸 필터는 차단(block)으로, 방출 필터는 개방(open)으로 설정하여 3D 재구성을 위해 서로 다른 파장의 여러 필터를 사용할 수 있도록 하십시오.신호원의 정확한 위치 파악을 위해, 시각화하려는 마우스 수에 해당하는 FOV를 선택하십시오. 모든 설정이 완료되면, 획득 제어 패널의 이미지 마법사에서 add를 클릭하여 시퀀스 설정을 추가하고, acquire를 클릭하여 획득 과정 중 영상 시퀀스를 시작하십시오. 실험 세부 사항과 조건을 이미지 편집 창에 기록하고 이미지를 저장하십시오.마지막으로, 마우스를 이미징 챔버에서 꺼내 케이지로 돌려보냅니다. 동물들이 마취에서 회복될 때까지 지속적으로 관찰하십시오. 조직 이미징을 위해서는 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.이 단계에서 각 마우스의 폐를 무균적으로 적출하여 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 감염된 폐가 담긴 페트리 접시를 이미징 챔버 안에 넣고, 이 영상의 앞부분에서 설명한 것과 동일한 방식으로 생체 발광 이미지를 획득합니다. 이미지 획득이 완료되면 페트리 접시를 이미징 챔버에서 꺼내고, 멸균 집게를 사용하여 폐를 1 mL의 멸균 PBS가 담긴 튜브로 옮긴 후 균질기를 사용하여 2~5분 동안 폐를 균질화합니다.멸균된 PBS를 사용하여 폐 균질액을 단계별로 희석하여 준비합니다. 그런 다음 각 희석액 100 µL를 선택 배지가 담긴 페트리 접시에 도말합니다. 세균 콜로니가 명확하게 보일 때까지 37 °C에서 배양합니다.그 다음 CFU를 측정하여 감염 수준을 평가합니다. Living Image 소프트웨어를 실행하고 파일 브라우저에서 원하는 이미지 파일을 엽니다. 도구 팔레트에서.이미지 조정(image adjust)을 클릭하여 보정 및 필터링 설정과 색상 척도 임계값을 수정하십시오. 발광 강도를 정량화하려면 드롭다운 목록에서 관심 영역 또는 ROI 도구를 사용하여 ROI 모양, 개수 및 크기를 선택하십시오. 그런 다음 ROI 측정(ROI measurement)을 클릭하고 정량적 데이터 출력을 저장하여 3D 이미지를 재구성하십시오.먼저 구조광 이미지를 포함한 이미지 시퀀스를 불러옵니다. 도구 팔레트에서 surface topography를 클릭하십시오. 그런 다음 드롭다운 리스트에서 reconstruct 탭을 선택하여 표면 지형도를 생성합니다.다음으로, 도구 팔레트에서 DILT 3D reconstruction을 선택합니다. 드롭다운 목록의 properties 탭을 클릭하고 조직 특성(tissue properties)과 소스 스펙트럼(source spectrum)을 muscle로 설정합니다. analyze 탭을 클릭하고 분석할 파장을 선택합니다.그런 다음 start를 클릭하십시오. 모든 설정이 조정되면 reconstruct를 클릭하여 3D 분석을 시작합니다. 3D 재구성이 완료되면 3D view를 선택하여 결과를 표시하십시오. results 탭을 클릭하면 광자 밀도, 데이터 복셀 및 알고리즘 파라미터를 확인할 수 있으며, 결과를 저장하고 추가 분석을 위해 데이터와 이미지를 내보낼 수 있습니다.이 그림에서 보듯이, 10⁶ CFU의 생물 발광 박테리아를 기관 내로 감염시킨 오른쪽의 두 마리 쥐는 폐 영역에서 강한 신호를 생성하는 반면, 왼쪽의 감염되지 않은 쥐는 그렇지 않습니다. 감염된 쥐의 적출된 폐만을 사용하여 유사한 분석을 수행하면, 발광이 다른 인접 조직이 아닌 폐에서 방출됨을 확인할 수 있습니다. 샘플에서 방출되는 신호는 관심 영역 내의 총 광속(total flux)으로 쉽게 정량화할 수 있습니다.토모그래피 분석을 통해, 이미지에 빨간색 상자로 표시된 발광 위치가 3D 재구성으로 결정된 마우스의 폐 영역 내에 있음을 확인합니다. 마지막으로, 왼쪽의 측정된 광자 밀도 곡선과 오른쪽의 시뮬레이션된 광자 밀도 곡선 사이의 유사성은 재구성의 품질이 우수함을 입증합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 전이된 동물 모델을 이미지화하고 발광의 국소화 및 정량화를 위해 이미지를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

출처: Valentine, ME, et al. 녹농균 에서 프레임 내 유전자 결실 돌연변이체의 생성 및 간단한 감염 마우스 모델에서 독성 감쇠 테스트. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 생쥐에서 독성 및 약독화된 박테리아 균주의 생체 내 거동을 시각화하고 비교하기 위해 생물 발광을 사용하는 방법을 보여줍니다. 생물발광 박테리아 현탁액의 제조와 마우스에 대한 복강내 주사에 대해 설명합니다. 독성 균주는 전신 확산을 나타내는 반면, 약독화된 균주는 국소적으로 유지되며 희미해지는 신호로 표시된 대로 점차적으로 제거됩니다.

생물발광을 사용한 마우스의 박테리아 감염 역학 추적

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

출처: Valentine, M. E. 외, Pseudomonas aeruginosa 에서 인프레임 유전자 결실 돌연변이 생성과 감염 단순 마우스 모델에서의 병원성 감감 검사. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 생체 쥐 모델에서 박테리아 감염을 모니터링하기 위해 생물발광 기반 영상 기법을 시연합니다. 순차적 생물발광 및 X선 영상은 숙주 전역에 퍼진 감염을 실시간으로 시각화하고 해부학적 위치를 파악할 수 있게 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 박테리아 감염의 실시간 영상

출처: Luyts, N. 외. 생체발광 영상을 이용한 요로 감염 및 그 치료에 대한 종단 추적 관찰. J. Vis. 경험 (2021).이 영상은 방광에 주입된 생물발광성 대장균 을 이용해 쥐 모델에서 요로 감염을 유도하고 추적하는 과정을 시연하며, 박테리아의 부착, 침입, 세포 내 복제가 이루어집니다. 생물발광 오페론에서 방출되는 빛은 감염 진행 중 박테리아 부하를 실시간으로 측정하는 지표 역할을 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 요로 감염의 시각화

이 비디오는 재조합 루시페라아제와 형광 단백질 발현 바이리포터 인플루엔자 A 바이러스를 사용하여 마우스 모델에서 바이러스 감염을 추적하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 생체 내 및 생체 외 연구를 모두 가능하게 하여 연구자가 바이러스 역학 및 중재의 효과에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.

바이러스 감염을 추적하기 위한 Luciferase-Fluorescent Reporter 인플루엔자 바이러스

멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을...

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 연간 전염병과 간헐적 인 전염병을 일으키는 전염성 호흡기 병원체입니다. 여기서, 우리는 새로운 재조합 루시퍼라제 및 형광 발현 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 사용하여 생체 내에서 바이러스 감염을 추적하는 프로토콜을 기술한다. 이 접근법은 연구원에게 생체 내에서 IAV를 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 제공합니다.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.

요로 감염의 세로 후속 및 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스에서의 치료

배우세요 마우스에서 루시페라제를 활용한 생체 세균 감염 이미징 방법을. IVIS 시스템으로 실시간 감염 경로를 추적하고 폐 조직 내 병원체 위치를 정량 분석하는 기술입니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

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