Name: 사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 학습하세요 생체 내 현미경법을 활용한 사타구니 림프 노드 미세혈관 실시간 관찰 기법을. 피부 절개와 지방 조직 제거 후 혈관 직경 측정 및 혈관 반응성 평가가 가능합니다.

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이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소, 혈액 연구 노던 BC의 대학의 브리티시 컬럼비아 센터의 혁신, 대학에 대한 캐나다 재단에 의해 후원됩니다.

1. 시약 준비 <ol><li> 실험을하는 동안 사용할 시약은 수술 프로토콜을 시작하기 전에 준비를해야합니다. 모든 솔루션 살균 기술을 사용하여 만든다고합니다. </li><li> 생리 생리 식염수 (PSS)는 최고의 두 가지 구성 요소에 준비 : 기본 소금 솔루션과 나트륨 중탄산염 솔루션을. 4 20X 농도 및 저장 ° C.에 두 솔루션을 준비 20X에서 나트륨 중탄산염는 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol)와 20X 농도에서 기본 소금 솔루션 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol) 40.0mM CaCl 2입니다 • 2 시간 2 O (147.02g/mol) 및 23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). 솔루션 이전 다음 화학 물질을 추가해도 좋다 때까지 솔루션은 한 번에 하나씩 추가되어야 DH 2 O와 화학 물질에 준비하고 흔들해야 </li><li> 나트륨 중탄산염 및 기본 소금 솔루션의 같은 볼륨을 diluting 및 1X 농도 (DH 2 O의 각 나트륨 중탄산염 및 기본 소금 솔루션의 두 PSS의 2L 100mL 희석시키기위한 diluting하여 PSS의 2L 준비 </li><li> 37 ° C 물 목욕으로 PSS 및 PSS를 포함한 플레이스 2L 판매량 플라스크. 수술의 시작 이전에 1 시간을위한 5 % CO 2 / 밸런스 질소 가스와 함께 솔루션을 평형. </li><li> Vasoactive 화학 물질은 (예 : 제품 Phenylephrine, 아세틸콜린, 나트륨 nitroprusside) 최고 -20 ° C.에 dH2O에서 1M 농도에서 준비하고 100μl aliquots에 저장됩니다 </li></ol> 2. 동물 준비 <ol><li> 마우스의 무게를 결정하고 intraperitoneal 주사로 90mg/kg에서 pentobarbital 나트륨의 초기 복용량을 관리할 수 있습니다. 절차를 통해 마우스가 지속적으로 발가락 핀치와 호흡 속도에주의 시험을 통해 마취의 비행기 모니터입니다. 마취의 비행기를 유지하기 위해 20mg/kg에서 필요에 따라 pentobarbital 나트륨의 추가 주사가 관리해야합니다. 노던 BC 대학교 동물의 관리 및 사용위원회 (ACUC)에 의해 승인 동물 관리 프로토콜에 명시된 바와 같이 마취의 수술 비행기는 연방 및 기관 규정에 따라 유지됩니다. </li><li> 면도기로 복부와 측면 / 힙합 영역에서 머리를 제거합니다. 알코올 면봉으로 풀어 머리를 나머지와 테이프로 영역을 끝날 제거합니다. 이 실험 절차 터미널이므로이 충분합니다. </li><li> 부정사 위치에 명확 수술 보드에 마우스를 놓고 이사회에 각 노상 강도를 녹화하여 보드에 마우스를 연결합니다. 체온은 외부 가열 램프를 통해 유지하고 저체온증은 마취의 결과로 발생하지 않습니다 보장하기 위해 직장 온도계를 통해 모니터링됩니다. </li></ol> 3. 수술 <ol><li> 전체 수술 도중 노출된 조직은 항상 따뜻하게 equilibrated PSS 솔루션 superfused 유지되도록. 그들 주위 지방 조직과 결합 조직을 조작하여 그들을 더 강제로 삽입하여 수술 악기와 함께 관심의 vasculature 접촉을하거나 혈관을 다치게 안하는 것도 중요하다. </li><li> 해부 현미경으로 마우스를 놓습니다. 복강의 복부 표면을 따라 정중선 절개를하고 마우스의 척수 칼럼으로 피부를 철회. </li><li> 피부가 LN 쉽게 볼 수 있도록 철회되면, 투명 Sylgard 184의 받침대로 피부를 핀. </li><li> LN 주변을 오버레이 결합 조직의 얇은 층을 제거 </li><li> 지방 조직의 오버레이를 해제하고 microvascular 침대 노출 때까지 림프 노드를 서라운드. 주요 간선 구간은 LN에 인접 낳는하고 일반적으로 venule에 의해 overlayed 있습니다. 전체 수술 시간은 약 30 분 소요됩니다. </li></ol> 4. 이미징 및 선박 분석 <ol><li> 관심의 선박 세그먼트는 해부 현미경 노출되면, intravital 현미경에 대한 준비를 확보. 동물 동안 실험 기간 내내 intravital 현미경에 맑은 수술 보드에 남아 있습니다. 외과 섹션 중에 설명한 것처럼 체온이 가열 램프를 통해 유지 관리 및 직장 온도계를 통해 측정됩니다. 섹션 2.1에서 설명한대로 마취 비행기는 또한 실험을 통해 모니터링됩니다. </li><li> superfusion와 흡입 라인을 설정합니다. PSS의 Superfusion는 5 % CO 2 평형 질소에 의해 perfused되고있는 물 재킷 가열 저수지 (물 재킷이 순환 waterbath에 의해 순환하고 가열)로하고 10ml의 속도로 드립 라인 아래로, 저수지에서 중력 공급에 의해 발생 / 분. 흡입 라인은 준비 가까이 superfused PSS 당겨 계속해서 사용해야합니다. 이전 실험에 흡입 라인과 물 재킷이 완전히 청소하고 각 실험 후 저장합니다. 이것은 다음 실험을하기 전에 불임을 보장합니다. </li><li> superfusing PSS의 온도를 확인합니다. 의 온도를 조절° C 준비를 통해 ~ 37 온도를 달성하기 위해 물 목욕 및 / 또는 PSS superfusion의 속도를 순환. </li><li> vasculature 적어도 60 분 PSS와 평형 및 비디오 캘리퍼스를 사용하여 혈관 직경을 정할 수 있습니다. 일반적으로, 선박의 직경은 선박이 안정 보장 (예를 들어, 40, 50, 60 분) 여러 지점에서 결정한다. </li><li> 부드러운 근육 구체적인 작용제 (예 : 제품 Phenylephrine, PE) 및 내피 구체적인 작용제 (예 : 아세 티 콜린, ACH)를 사용하여 선박의 건강을 평가합니다. 작용제의 농도는 작용제에 따라 조정해야하지만, PE와 이크에 대한 배는 superfusate에 누적 이외 (10 - 9M 10 - 5M) 각 농도에 평가해야합니다. 각 작용제의 응용 프로그램은 선박이 휴식 직경으로 돌아갑니다까지 PSS를 사용하여 세척 단계 (일반적으로 30 분)으로 구분해야합니다. </li><li> 실험을 추적 혈관 건강, 후속 vasoactive 마약, 형광 라벨, 그리고 세포의 다음 평가 실시 수 있습니다. </li><li> 실험의 끝에 다음과 같은 동물은 pentobarbital 나트륨의 과다 주어집니다. 동물은 다음 발가락 핀치와 호흡 운동이나 심장 박동의 부족으로 응답이 없다는 것을 보장하기 위해 모니터링됩니다. 같은 시간에 이것은 자궁 경부 전위옵니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 평균 기간에 따라 준비는 사타구니 림프 노드를 공급 arteriole과 venule 모두의 식별을 허용 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. arteriole 명확하게 혈관 직경을 계산 겹쳐하는 비디오 캘리퍼스에 대해 관찰하는 venule의 벽 수 있도록 혈관을 둘러싼 최소한의 지방 세포가 있어야합니다. 성공적인 준비의 핵심 포인트는 arteriole의 루멘을 통하여 혈관 톤 상당 정도 (예 : arteriole가 vasoconstrict 각각 근육과 내피 특정 agonists를 부드럽게 vasodilate 수있는 능력을 가지고)가있다는 것을 이동하는 혈액의 풍부한 공급을 가지고있다 . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. 생리학 생리 식염수 측면을 따라 주요 venule (녹색 화살표)를 실행하는 equilibrated 림프 노드를 먹이 사타구니 림프 노드 피드 arteriole (빨간색 화살표)의 Intravital 현미경 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 농도에서 생리 식염수로 누적 이외의 superfused phenylephrine (PE)에 일반 vasoactive 응답 10 -9 M ~ 10 -5 M. 강력한 vasoconstriction의 존재는 arteriole에있는 정상적인 평활근 기능의 암시이다. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="그림 3"> 그림 3. 농도에서 생리 식염수로 누적 이외의 superfused 아세틸콜린 (ACH)에 일반 vasoactive 응답 10 -9 M ~ 10 -5 M. 강력한 vasodilation의 존재는 arteriole 정상적인 내피 기능 현재의 암시이다.

<ol><li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li>
<li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li>
<li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li>
<li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li>
<li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li>
<li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경은 림프절에 - 생체내의 이미지 microvasculature 수있는 기능을 제공합니다. 그러므로, 그것은 직접 실시간으로 관찰하는 수단을 용이하게합니다. LN microvasculature의 영상이 하나가 면역 반응과 vasculature 사이의 인터페이스를 연구 수있는 독특한 사이트입니다. 이 준비를 사용하여 초점은 면역 반응, vasculature의 변경, 또는 둘 사이에 상호 작용에서 특별히 지시하실 수 있습니다. 모든 실험 방법과 마찬가지로 표준 intravital 현미경은 장점과 한계를 모두하고 있습니다. 준비가 여기에서 설명한 같은 표준 IVM은 쉽게 수정할 수 있으며, 이전에 형광 추적 염료의 도입이나 레이블이 붙은 세포 집단을 통해 epifluorescent 현미경을 허용하는 저자에 의해 증명되었습니다. 표준 IVM은 입체 영상의 가능성을 포기하고 두 광자 현미경이나 혈관 조영술에 의해 제공됩니다과 같은 추적하지 않지만, 세포 추적은 여전히​​ 휴대 전화와 휴대 vasculature 상호 작용 수 있도록 2 차원 이루어집니다 준수하고 계량 및 형광 항체로 - 생체내 관리 및 후속 얼룩과 함께 실시간으로 단백질 / 마커 표현에 대한 데이터를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 대체 영상 기술은 이미지에 대한 정적 환경을 필요로하며 수술 영역이나 평평한 준비에 coverslip의 추가의 클램핑하는 것은 자주 필요합니다. 이 제한이 아니라면, 제거, 적극적으로 혈관 무결성 및 생리학 등 또는 IVM 준비 내에서 실시 vasodilation 실험 같은 다른 기술의 사용을 평가할 수있는 준비를 통해 혈관이나 다른 중재자를 perfuse 수있는 능력. 또한, 표준 IVM은 완전히 평평하게 준비를 필요로하지 않습니다와 같은 동물의 호흡에 의해 생성된 것과 움직임에 의해 영향을받지 않습니다. 이것은 표준 IVM은 더욱 재현성 더 많은 수술 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 여기에서 설명한 사타구니 림프절 준비에 의해 exemplified입니다. 림프절의 크기와 모양을 감안할 때, 준비가 조직을 손상없이 평평 만들 수 없으며, 노드의 위치는 동물의 호흡으로 인한 움직임에 상당한 상승을 제공합니다. 이러한 문제는 다른 방법으로 극복하기 어려울 것이지만, 쉽게 설명된 표준 IVM 준비를 사용하여 처리하고 있습니다. 요약 위의 세부 준비는 어떤 번호로 조합하여 사용할 수 있습니다 다른 생화학, 혈관, 및 / 또는 활성화의 하위 집합을 양도하거나 표시 셀, hypoxia의 유도, 그리고 혈관 중재자의 고갈 이상의 표현으로 면역 기술. 그러나, 추가적인 응용 프로그램은 초기 준비의 건강에 따라 달라집니다. 따라서, 항상 몇 군데와 평가되는 vasculature의 건강을 테스트하기 위해 매우 중요합니다. 건강 준비를 달성하기위한 핵심 포인트는 준비가 지속적으로 체온에서 equilibrated PSS와 perfused 및 수술 중에 수술 영역에 위치 연락처 및 스트레스를 최소화됩니다 확보하고 있습니다.

<a href="https://app.jove.com/t/6652">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/2551">10.3791/2551</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/2551">Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node</a>. The Authors&#160;and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th></tr><tr><td> 중탄산 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 이수화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 나트륨 Nitroprusside </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> Phenylephrine </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 아세틸콜린 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 heptahydrate </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> Pentobarbitol 나트륨 </td><td></td></tr></tbody></table>

사타구니 림프 노드의 intravital 현미경

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

체내에있는 임파선이 (LN의), 면역 체계의 중요한 구성 요소입니다. 그들은 그러므로 적응 면역 반응의 유도를위한 사이트로 봉사하고, 효과기 세포의 개발. 따라서 LNs가 침해 병원체와 싸우고과 건강을 유지하기 위해 열쇠입니다. 공부 LN의 선택은 접근하고 원하는 모델에 의해 결정되며 사타구니 림프 노드가 잘 위치하고 있으며 쉽게 피부와 성기 점막 감염 생물학 관련 모델의 연구를 지원합니다. 사타구니 LN, 모든 LNs 같이, 혈액으로 공급하는 광범위한 microvascular 네트워크 있습니다. 일반적으로,이 microvascular 네트워크는 높은 내피 venules (HEVs)를 피드 이후 지점과 LN의 주요 공급 arteriole를 포함합니다. HEVs는 항상성 및 감염 모두 동안 LN에 면역 세포의 인신 매매를 촉진을위한 전문입니다. HEVs 이러한 상황 모두에서 LN으로 거래를 규제하는 것은 얼마나 강렬한 탐구의 영역입니다. LN 피드 arteriole는 HEVs에 직접적인 영향을 업스트림 있으며 LN에 영양소와 세포 풍부한 혈액의 주요 공급됩니다. 또한 피드 arteriole의 변화는 적응 면역 반응의 유도를 촉진에 연루됩니다. LN microvasculature은 LN에 최적의 혈액 공급을 유지하고 적절한 LN 기능과 이후 면역 반응에 중요한 요소 LN로 면역 세포 유입을 규제의 명백한 중요성을했다. 생체내에서 LN microvasculature을 연구하는 능력은 면역 시스템과 microvasculature 상호 작용 및 LN 이내에 다른 영향을 어떻게 elucidating의 열쇠입니다. 여기, 우리는 사타구니 림프 노드의 생체내 이미징에 대한 방법을 제시한다. 우리는 건강한 혈관 연구, 몇 시간 동안 가능한 선박의 이미지를 유지하는 능력, 그리고 선박 규모의 부량을 보장 방법에 특히주의를 기울이고, LN의 microvasculature의 이미지에 중점을두고 있습니다. vasoactive 마약 microvasculature의 재관류뿐만 아니라 세포의 트래픽을 추적하고 계량 가능성에 대한 방법도 제시하고 있습니다. 사타구니 LN의 Intravital 현미경은 microvascular 기능과 면역 세포, LN, 그리고 엑기스 간의 직접적인 인터페이스의 실시간 인터페이스의 직접 평가를하실 수 있습니다. 많은 면역 기법과뿐만 아니라 다른 LNs의 vasculature 연구를 조작 형광 셀 라벨과 결합 될 가능성이 기술.

사타구니 림프절 (LN)의 intravital 현미경을 수행하기위한 기법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 실시간으로 허용합니다<em&gt; 생체내에</em&gt; 항상성 및 감염 동안 모두 림프절의 microvasculature 및 구조 연구. 이 기술은 세포 인신 매매 연구 및 기타 림프절 사이트에 적용할 수 있습니다.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

신체 전반에 위치한 림프절(LN)은 면역 체계의 필수적인 구성 요소입니다. 림프절은 적응 면역의 유도를 위한 장소로서...

본 절차의 전체적인 목표는 서혜부 림프절로 이어지는 공급 동맥을 생체 내(in vivo)에서 시각화하고 평가하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 서혜부 영역에서 서혜부 림프절을 덮고 있는 피부를 조심스럽게 절개하여 피부 플랩을 생성함으로써 수행됩니다. 그 후, 림프절 부위를 덮고 있는 결합 조직을 분리합니다.다음으로, 림프절로 이어지는 동맥 혈관계를 노출시키기 위해 주변 지방 조직을 제거해야 합니다. 마지막으로, 생체 내 현미경(intravital microscopy)을 통해 림프절 혈관계의 변화를 시각화하고 평가합니다. 오늘 보실 표본은 서혜 림프절의 미세 순환입니다. 이러한 외과적 기법은 골격근이나 뇌와 같은 다른 표본 준비에도 동일하게 사용할 수 있습니다.일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자들이 어려움을 겪는 주요 원인은 두 가지입니다. 첫째는 살아있는 동물을 다루어야 한다는 점이며, 둘째는 매우 좁은 부위에서 수술을 진행하기 때문에 혈관 자체나 주변 부위에 가해지는 작은 자극만으로도 부정적인 영향이 발생하여 수행하고자 하는 실험에 치명적일 수 있다는 점입니다. 따라서 이 기술의 성공을 위해서는 시각적인 시연 과정이 매우 중요합니다.텍스트만으로는 실제 기술 구현으로 옮기기 어려운 복잡한 단계들이 많이 포함되어 있습니다. 따라서 이를 정확하게 수행하기 위해서는 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다. 좋은 결과 있으시길 바랍니다.먼저 마우스에 마취를 시행하고 수술 부위를 제모합니다. 자세한 내용은 텍스트 원고를 참조하십시오. 그 후 마우스를 투명 수술대 위에 앙와위로 배치합니다.각 발바닥 패드를 테이프로 고정하여 마우스를 보드에 부착하십시오. 실험 전날, 제조업체의 지침에 따라 thes guard 180 4를 혼합하십시오. 그런 다음 표준 일회용 페트리 접시를 몰드로 사용하여 혼합물을 약 1/4인치 깊이로 붓고 하룻밤 동안 경화시키십시오. 페트리 접시에서 thes guard를 제거하여 수술용 보드 위에 배치하십시오.털을 깎고 마취시킨 마우스를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 5번 스테인리스 핀셋과 직선형 블레이드 스프링 가위를 사용하여 복강의 배면을 따라 정중선 절개를 합니다. 그런 다음 정중선 절개를 사지로 향해 대각선 방향으로 계속 진행하고, 피부를 거대한 척주 방향으로 젖힙니다.ln이 명확하게 보이면, 스테인리스강 곤충 핀과 이녹스 에폭시 코팅 포셉을 사용하여 젖혀진 피부를 cigar 180 4 페데스탈 위에 고정합니다. 해당 부위에 생리식염수 또는 PSS를 추가합니다.다음으로, ln 주변 부위를 덮고 있는 얇은 결합 조직 층을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 결합 조직 조각들을 조심스럽게 집어 들어 ln에서 분리합니다. 그 후, 스프링 가위를 사용하여 미세혈관층이 노출될 때까지 LN을 덮고 있거나 둘러싸고 있는 지방 조직을 제거합니다.이 단계에서는 수술 도구로 관심 혈관에 접촉하지 않도록 주의하고, 주변 조직을 조작할 때 혈관에 과도한 힘을 가해 손상을 주지 않는 것이 중요합니다. 지방은 결합 조직을 느슨하게 한 뒤, 핀셋으로 지방 조직을 잡고 시야가 확보될 때까지 부드럽게 제거하여 림프절(LN) 주변에서 치우는 것이 가장 좋습니다. 결합 조직과 지방 조직이 제거되면, 림프절(LN)에 인접한 주동맥 분절과 그 위에 겹쳐진 동반 정맥(ven)을 시각화할 수 있습니다.해부 현미경 하에서 관심 혈관 분절이 노출되면, 이를 생체 내 현미경(intra vital microscope) 위에 고정합니다. 관류 및 흡입 라인을 설치합니다. 이 과정 동안 노출된 조직은 항상 평형화된 PSS 용액으로 관류 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.PSS의 초여과(Superfusion)는 중력에 의해 이루어집니다. 초기 저장조에서 5% Carbon dioxide-balance nitrogen으로 관류되는 가열 워터 재킷 저장조로 공급한 후, 분적 라인을 통해 분당 10 milliliters의 속도로 흘려보냅니다. 흡입 라인을 피부 플랩 바닥에 배치하여 초여과된 PSS가 표본으로부터 계속해서 배출되도록 해야 하며, 이후 순환 수조의 온도와 PSS 초여과 속도를 확인하고 조정하여 약 36 degrees Celsius의 최적 온도를 유지해야 합니다.전 준비 과정 동안 혈관이 PSS와 최소 60분 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 직장 온도계를 사용하여 동물이 저체온증에 빠지지 않도록 확인하고 외부 가열 램프를 제공하십시오. PSS가 평형을 이루는 동안 혈관 직경을 측정합니다.비디오 캘리퍼스를 사용하여 여러 시점에서 혈관이 안정화되었는지 확인합니다. 안정화는 20분 동안 직경 크기가 5 µm 이내로 일정하게 유지되는 것으로 정의합니다. 직경 측정값은 ChartLab 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에 기록합니다. 평형 도달 기간이 지난 후, 여기의 phenylephrine 사례와 같이 phenylephrine과 같은 평활근 특이적 작용제를 사용하여 혈관의 상태를 평가합니다.작용제를 수용액에 첨가합니다. 각 로그 단위의 누적 농도 증가 시마다 8가지의 작용제를 평가해야 하며, 각 작용제 투여 사이에 SUP fate에 작용제를 첨가하여 누적 농도를 높입니다. PSS를 사용하는 세척 단계를 30분 동안 또는 혈관이 휴지기 직경으로 돌아올 때까지 수행해야 합니다.평형 기간 이후 서혜부 림프절(inguinal ln)의 대표적인 결과입니다. 동맥에 생리식염수를 주입하면, 빨간색 화살표로 표시된 공급 동맥과 초록색 화살표로 표시된 정맥을 모두 식별할 수 있는 선명한 이미지를 얻을 수 있으며, 이들은 서혜부 림프절에 혈액을 공급합니다. 그래프는 생리식염수에 누적 추가된 SUP 융합 페닐에프린(phenylephrine)에 대한 서혜부 L nfe 동맥의 전형적인 혈관 활성 반응을 보여줍니다.10⁻⁹ M에서 10⁻⁵ M 농도 범위에서 강력한 혈관 수축이 나타나는 것은 동맥 내의 정상적인 평활근 기능이 존재함을 시사합니다. 이 그래프는 생리식염수에 아세틸콜린을 누적하여 첨가했을 때 나타나는 전형적인 혈관 활성 반응을 보여줍니다. 10⁻⁹ M에서 10⁻⁵ M 농도 범위가 표시되어 있습니다.강력한 혈관 확장의 존재는 동맥에 정상적인 내피 세포 기능이 있음을 시사합니다. 이 전처리를 시도할 때 기억해야 할 핵심 사항 중 하나는 성공률을 극대화하기 위해 혈관과 주변 부위의 교란을 최소화하는 것입니다. 이 절차 이후에는 세포 이동과 같은 다른 세포 기능을 탐구하기 위해 형광 분석과 같은 다른 방법들을 도입할 수 있습니다.이 기술이 개발된 이후, 이는 면역학과 혈관 생물학 분야를 잇는 새로운 분야인 혈관 면역학의 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

2 - 광자 현미경의 최근 발전은 실시간으로...

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

이 비디오에서는 초고주파 초음파 이미징을 사용하여 마우스 모델의 서혜부 림프절을 이미지화하는 기술을 보여줍니다. 이 비침습적 이미징 기술을 통해 시간 경과에 따른 동물의 림프절 용적 변화를 모니터링할 수 있습니다.

마우스 서혜부 림프절 부피 분석: 마우스 모델에서 서혜부 림프절의 부피를 결정하기 위한 초고주파 초음파 이미징 기법

이 비디오는 컨포칼 현미경을 사용하여 형질전환 마우스에서 γδ 상피내 림프구(IEL)를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 수술 절차에는 천공 라인을 만들고 장 점막과 융모를 노출시키기 위해 세로로 절개하는 것이 포함됩니다. 형질전환 마우스는 γδ IEL에서만 리포터 단백질을 발현하여 추적을 가능하게 합니다. Intravital 이미징은 장 상피 세포의 기저막을 따라 녹색 형광 표지된 γδ IEL의 동적 움직임을 캡처합니다.

Gamma Delta 상피내 림프구의 생체 내 시각화

이 비디오는 마우스 모델에서 서혜부 배출 림프절의 외과적 분리 절차를 보여줍니다. 복부 부위를 절개하면 서혜부 림프절에 접근할 수 있으며, 이 림프절은 외과적으로 적출됩니다. 채취된 반투명 서혜부 림프절은 면역학 연구에 사용할 수 있습니다.

쥐 모델에서 사타구니 배출 림프절 수확

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

흑색 종은 다른 장기로 빠르게 퍼지는 매우 공격적인 질병입니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 Braf/Pten 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 모니터링하기 위해 3D 렌더링과 결합된 초고주파 초음파 이미징의 적용을 설명합니다.

흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

학습하세요 생체 내 현미경법을 활용한 사타구니 림프 노드 미세혈관 실시간 관찰 기법을. 피부 절개와 지방 조직 제거 후 혈관 직경 측정 및 혈관 반응성 평가가 가능합니다.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

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