사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

본 절차의 전체적인 목표는 서혜부 림프절로 이어지는 공급 동맥을 생체 내(in vivo)에서 시각화하고 평가하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 서혜부 영역에서 서혜부 림프절을 덮고 있는 피부를 조심스럽게 절개하여 피부 플랩을 생성함으로써 수행됩니다. 그 후, 림프절 부위를 덮고 있는 결합 조직을 분리합니다.

다음으로, 림프절로 이어지는 동맥 혈관계를 노출시키기 위해 주변 지방 조직을 제거해야 합니다. 마지막으로, 생체 내 현미경(intravital microscopy)을 통해 림프절 혈관계의 변화를 시각화하고 평가합니다. 오늘 보실 표본은 서혜 림프절의 미세 순환입니다. 이러한 외과적 기법은 골격근이나 뇌와 같은 다른 표본 준비에도 동일하게 사용할 수 있습니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자들이 어려움을 겪는 주요 원인은 두 가지입니다. 첫째는 살아있는 동물을 다루어야 한다는 점이며, 둘째는 매우 좁은 부위에서 수술을 진행하기 때문에 혈관 자체나 주변 부위에 가해지는 작은 자극만으로도 부정적인 영향이 발생하여 수행하고자 하는 실험에 치명적일 수 있다는 점입니다. 따라서 이 기술의 성공을 위해서는 시각적인 시연 과정이 매우 중요합니다.

텍스트만으로는 실제 기술 구현으로 옮기기 어려운 복잡한 단계들이 많이 포함되어 있습니다. 따라서 이를 정확하게 수행하기 위해서는 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다. 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

먼저 마우스에 마취를 시행하고 수술 부위를 제모합니다. 자세한 내용은 텍스트 원고를 참조하십시오. 그 후 마우스를 투명 수술대 위에 앙와위로 배치합니다.

각 발바닥 패드를 테이프로 고정하여 마우스를 보드에 부착하십시오. 실험 전날, 제조업체의 지침에 따라 thes guard 180 4를 혼합하십시오. 그런 다음 표준 일회용 페트리 접시를 몰드로 사용하여 혼합물을 약 1/4인치 깊이로 붓고 하룻밤 동안 경화시키십시오. 페트리 접시에서 thes guard를 제거하여 수술용 보드 위에 배치하십시오.

털을 깎고 마취시킨 마우스를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 5번 스테인리스 핀셋과 직선형 블레이드 스프링 가위를 사용하여 복강의 배면을 따라 정중선 절개를 합니다. 그런 다음 정중선 절개를 사지로 향해 대각선 방향으로 계속 진행하고, 피부를 거대한 척주 방향으로 젖힙니다.

ln이 명확하게 보이면, 스테인리스강 곤충 핀과 이녹스 에폭시 코팅 포셉을 사용하여 젖혀진 피부를 cigar 180 4 페데스탈 위에 고정합니다. 해당 부위에 생리식염수 또는 PSS를 추가합니다.

다음으로, ln 주변 부위를 덮고 있는 얇은 결합 조직 층을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 결합 조직 조각들을 조심스럽게 집어 들어 ln에서 분리합니다. 그 후, 스프링 가위를 사용하여 미세혈관층이 노출될 때까지 LN을 덮고 있거나 둘러싸고 있는 지방 조직을 제거합니다.

이 단계에서는 수술 도구로 관심 혈관에 접촉하지 않도록 주의하고, 주변 조직을 조작할 때 혈관에 과도한 힘을 가해 손상을 주지 않는 것이 중요합니다. 지방은 결합 조직을 느슨하게 한 뒤, 핀셋으로 지방 조직을 잡고 시야가 확보될 때까지 부드럽게 제거하여 림프절(LN) 주변에서 치우는 것이 가장 좋습니다. 결합 조직과 지방 조직이 제거되면, 림프절(LN)에 인접한 주동맥 분절과 그 위에 겹쳐진 동반 정맥(ven)을 시각화할 수 있습니다.

해부 현미경 하에서 관심 혈관 분절이 노출되면, 이를 생체 내 현미경(intra vital microscope) 위에 고정합니다. 관류 및 흡입 라인을 설치합니다. 이 과정 동안 노출된 조직은 항상 평형화된 PSS 용액으로 관류 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.

PSS의 초여과(Superfusion)는 중력에 의해 이루어집니다. 초기 저장조에서 5% Carbon dioxide-balance nitrogen으로 관류되는 가열 워터 재킷 저장조로 공급한 후, 분적 라인을 통해 분당 10 milliliters의 속도로 흘려보냅니다. 흡입 라인을 피부 플랩 바닥에 배치하여 초여과된 PSS가 표본으로부터 계속해서 배출되도록 해야 하며, 이후 순환 수조의 온도와 PSS 초여과 속도를 확인하고 조정하여 약 36 degrees Celsius의 최적 온도를 유지해야 합니다.

전 준비 과정 동안 혈관이 PSS와 최소 60분 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 직장 온도계를 사용하여 동물이 저체온증에 빠지지 않도록 확인하고 외부 가열 램프를 제공하십시오. PSS가 평형을 이루는 동안 혈관 직경을 측정합니다.

비디오 캘리퍼스를 사용하여 여러 시점에서 혈관이 안정화되었는지 확인합니다. 안정화는 20분 동안 직경 크기가 5 µm 이내로 일정하게 유지되는 것으로 정의합니다. 직경 측정값은 ChartLab 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에 기록합니다. 평형 도달 기간이 지난 후, 여기의 phenylephrine 사례와 같이 phenylephrine과 같은 평활근 특이적 작용제를 사용하여 혈관의 상태를 평가합니다.

작용제를 수용액에 첨가합니다. 각 로그 단위의 누적 농도 증가 시마다 8가지의 작용제를 평가해야 하며, 각 작용제 투여 사이에 SUP fate에 작용제를 첨가하여 누적 농도를 높입니다. PSS를 사용하는 세척 단계를 30분 동안 또는 혈관이 휴지기 직경으로 돌아올 때까지 수행해야 합니다.

평형 기간 이후 서혜부 림프절(inguinal ln)의 대표적인 결과입니다. 동맥에 생리식염수를 주입하면, 빨간색 화살표로 표시된 공급 동맥과 초록색 화살표로 표시된 정맥을 모두 식별할 수 있는 선명한 이미지를 얻을 수 있으며, 이들은 서혜부 림프절에 혈액을 공급합니다. 그래프는 생리식염수에 누적 추가된 SUP 융합 페닐에프린(phenylephrine)에 대한 서혜부 L nfe 동맥의 전형적인 혈관 활성 반응을 보여줍니다.

10⁻⁹ M에서 10⁻⁵ M 농도 범위에서 강력한 혈관 수축이 나타나는 것은 동맥 내의 정상적인 평활근 기능이 존재함을 시사합니다. 이 그래프는 생리식염수에 아세틸콜린을 누적하여 첨가했을 때 나타나는 전형적인 혈관 활성 반응을 보여줍니다. 10⁻⁹ M에서 10⁻⁵ M 농도 범위가 표시되어 있습니다.

강력한 혈관 확장의 존재는 동맥에 정상적인 내피 세포 기능이 있음을 시사합니다. 이 전처리를 시도할 때 기억해야 할 핵심 사항 중 하나는 성공률을 극대화하기 위해 혈관과 주변 부위의 교란을 최소화하는 것입니다. 이 절차 이후에는 세포 이동과 같은 다른 세포 기능을 탐구하기 위해 형광 분석과 같은 다른 방법들을 도입할 수 있습니다.

이 기술이 개발된 이후, 이는 면역학과 혈관 생물학 분야를 잇는 새로운 분야인 혈관 면역학의 길을 열어주었습니다.