Name: Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 학습하세요 닭 배아에 외배엽 조직을 이식하여 키메라 배아를 만드는 방법을 통해 두개안면 발달 과정에서 외배엽의 신호 및 패턴 형성 특성을 분석하는 기술입니다.

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이 작품은 R01 - R01 - DE018234 및 DE019638에 의해 투자되었다.

1. 기증자 조직을 준비 <ol><li> , 문화, 미디어를 준비 유리 핀을 선명하게, 텅스텐 바늘을 날카롭게. </li><li> 셸에서 배아를 수집, 얼음처럼 차가운 PBS로 세척. <ol class="lalpha"><li> 10 ML의 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하면 알 껍질의 지적 끝에서 알부민 1.0 ML를 제거합니다. </li><li> 가위의 지점을 사용하여 쉘의 상단에 작은 구멍을 확인한 다음 배아를 노출하는 원형 여는 잘라 </li></ol></li><li> DMEM (혈청 무료, 실온)에 머리와 장소를 제거 </li><li> 배아 (또는 상악 또는 mandibular 프로세스로 다른 기증자 사이트)에서 Frontonasal 프로세스를 해부하다 </li><li> 20mins를위한 얼음 PBS에 2.4U / ML dispase에 다이제스트 </li><li> 소화를 중지 1 % BSA와 DMEM과 조직을 커버 </li><li> 별도의 ectoderm, mesenchyme, 그리고 neuroectoderm에 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 </li><li> 호스트가 이식을위한 준비가 될 때까지 얼음 DMEM 1 % BSA의 이식 조직을 저장 </li></ol> 2. 호스트 준비 <ol><li> 배아를 폭로 <ol class="lalpha"><li> 10 ML의 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하면 알 껍질의 지적 끝에서 알부민 1.0 ML를 제거합니다. </li><li> 가위의 지점을 사용하여 쉘의 상단에 작은 구멍을 만듭니다. 구멍을 통해 테이프의 조각을 장소, 그리고 배아를 노출하는 원형 여는 잘라. </li></ol></li><li> 포셉의 이쌍 사용하여 양막을 파악하고 부드럽게 구멍을 만들기 위해 찢어. </li><li> 오른쪽 눈에 포셉 한 켤레를 삽입하고 압력을 적용하여 머리를 회전합니다. 머리가 안정적으로 유지되고 있지만, 이식을 수용하기 위해 호스트 ectoderm를 제거하는 텅스텐 바늘을 사용합니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 호스트에 그래프트를 전송합니다. </li><li> 삭제 ectoderm을 대체할 그래프트를 놓습니다. 장소에 그래프트를 핀에 이식할 조직의 각 모서리에 유리 핀을 넣습니다. 유리 핀을하려면, 알코올 불꽃을 통해 좋은 지점으로 microcapillary 튜브를 당기십시오. </li><li> 구멍을 통해 테이프를 단단히 장소 및 분석 시간의 적절한 기간 동안 인큐베이터에 배아를 반환합니다. </li><li> 참고 : 9 </li></ol> 3. 대표 결과 : chimeras을 평가하기 위해, 배아가 수집 및 호스트와 기증자의 조직의 분배 분석을 위해 처리되어야합니다. QcPN 항체를 사용하여 메추라기 세포, immunohistochemistry의 감지 (에 설명된 : 3)를 고용하고, 파라핀 섹션에 원위치 하이브리드화의 마우스 세포의 검출을위한 6 사용됩니다. 기증자 세포는 상피로 제한되어야하고, 기증자 mesenchymal 조직의 증거 (그림 1)가 없어야합니다. mesenchyme에서 ​​분리된 기증자 세포의 존재는 안면 발달의 여러 측면 (예, 10) 이러한 세포의 영향으로 인한 형태학의 해석을 혼란시킬 것입니다 오염 신경 능선 세포의 존재를 나타냅니다. 일단 이식 기법 mesenchyme 오염은 무료입니다 확신, 더 형태학의 또는 분자 결과 조치는 chimeras을 파악하기 위해 사용될 수 있습니다. 우리 목적을 위해서도, 우리는 (그림 3) 이식할 ectoderm에 대한 응답으로 이식 조직 (그림 2)와 mesenchymal 조직의 분자 변화에 의해 유발되었던 위턱의 duplications에 통신을 이소성 연골과 뼈의 존재를 감지 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. chimerism 평가 (A) 안티 QcPN 얼룩이 퀘일 - 여자는 chimeras에 메추라기 세포를 감지하는 데 사용됩니다. mesenchyme에 얼룩 흔적이 없다. (B) 현장 하이브리드화에서이 마우스 여자는 chimeras에 사인 B2의 성적 표현을 감지하는 데 사용됩니다. 표현은 그래프트로 구성된 ectoderm로 제한됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Trichrome 얼룩은 (A) 퀘일 - 여자는 키메라의 위턱 해골의 복제, 그리고 (B) 마우스 여자의 chimeras를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. ectoderm은 mesenchyme에서 ​​유전자 표현을 regultes. 여자는 배아의 mesenchyme에서 ​​(A) 일반 Bmp7 표현 (어도비 포토샵에 긍정적인 신호 의사 붉은 색과 현장 하이브리드화에 방사능). (B) Bmp7 표현은 키메라 배아의 이식 (화살표)에 인접한 mesenchyme에서​​ 유도됩니다.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
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<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 이식 방법을 사용하면 우리가 ectoderm가 dorsoventral 극성과 위턱의 proximodistal 확장을 조절 신호 정보가 포함되어 확인할 수있었습니다. 메추라기 또는 마우스 ectoderm, 많은 종의 6,11 중에서이 조직의 분자 신호 보존을 사용하여 결과의 유사성이 척추 동물 중에서 고도로 보존되어 신호 중심을 나타냅니다. 또한, 다른 조사는 표면 두부 ectoderm 다양한 영역의 신호 특성을 테스트하기 위해 유사한 기술을 사용하고 얼굴 12 morphogenesis에 기여 ectoderm에있는 여러 개의 신호 센터의 존재를 발견했습니다. 이 방법은 우리가 다른 조직뿐 아니라 조직 내에서 지역 차이, 얼굴 개발하는 동안 재생하는 역할을 우리의 이해를 더 할 수 있습니다. 마지막으로, 조류 - 키메라 시스템의 강도와 마우스 유전자의 강도를 결합하여 우리는 개발하는 동안 상피 - mesenchymal 상호 작용의 분자 중재자를 명료하게하다 수있을 것입니다, 우리는 이러한...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>캘리포니아 대학교 샌프란시스코</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>디스파제</td><td>Life Technologies의 GIBCO</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm 페트리 접시</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5번 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>지침 holders (Needle holder)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>모세관** </td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>블레이드 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

craniofacial 개발 과정 ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

조류 배아의 접근 실험 embryologists 개발 및 patterning과 척추 동물 morphogenesis (예, 1, 2, 3, 4) 규제 조직 상호 작용의 역할 동안 세포의 운명을 알고있었습니다. 여기, 우리는 얼굴 개발 중에 ectodermal 조직의 신호와 patterning 속성을 테스트하기 위해이 접근을 악용하는 방법을 설명합니다. 이 실험에서, 우리는 동일한 지역이나 여자는 태아의 이소성 지역 중 하나에 퀘일 드나 마우스에서 위턱을 커버 표면 두부 ectoderm를 이식하여 퀘일 - 여자 5 마우스 여자 6 chimeras를 만듭니다. 새끼로 이식을위한 기증자의 조직으로 메추라기의 사용은 그러므로 수사관은 호스트와 기증자의 조직 7 구별할 수 있도록, 메추라기에 존재하지만 여자는 세포 nucleolar 마커를 활용하기 위해 개발되었습니다. 우리는 마우스 여자 chimeras 8 호스트와 기증자의 조직을 구분 수있는, 마찬가지로 반복적인 요소는 마우스 게놈에 존재하고 ubiquitously 표시됩니다. 이 회사는 다양한 돌연변이 배아에서 파생 ectoderm의 신호 특성을 테스트할 수 있도록하기 때문에 기증자의 조직으로 마우스 ectoderm의 사용은 크게 다음과 조직 상호 작용에 대한 우리의 이해를 확장합니다.

이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

조류 배아의 접근 용이성은 실험 발생학자들이 발달 과정 중 세포의 운명과 조직의 역할을 이해하는 데 도움을 주었습니다...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 공여체 배아의 외배엽을 닭 배아의 발달 중인 상악으로 이식하여 키메라 배아를 만드는 것입니다. 이는 먼저 이식용 공여체 외배엽을 제거한 후, 호스트 부위를 이식 가능하도록 준비함으로써 수행됩니다.절차의 마지막 단계는 공여자 조직을 수용부 부위에 놓고 이식편을 위치에 고정하는 것입니다. 궁극적으로 공여자 외배엽만이 독점적으로 생착된 결과를 얻을 수 있으며, 분자 및 형태학적 분석을 통해 재코딩된 공여자 진피의 기능을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 형태 형성 과정 중 다양한 조직의 역할을 규명하는 것과 같이 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.본 실험 절차는 저희 연구실의 선임 연구원인 Dr. Diane이 시연하겠습니다. 절차를 시작하기 전, 배지를 준비하고 필요한 모든 용액이 준비되어 있으며 적절한 온도인지 확인하십시오. 그런 다음, 적절한 보안경을 착용한 상태에서 알코올 램프 불꽃 위로 마이크로 모세관을 가열하여 끝을 가늘게 뽑아내십시오.프로판 토치 불꽃에 텅스텐 바늘을 고정하여 끝을 날카롭게 만들기 위해 유리 핀을 제작합니다. 달걀 끝에 테이프 조각을 붙여 껍질에서 공여 배아를 추출하기 시작합니다. 그 다음 해부용 바늘 끝을 사용하여 테이프 중앙에 작은 구멍을 냅니다.10 mL 주사기와 18 gauge 피하 주사 바늘을 구멍에 삽입하여 달걀에서 알부민 1 mL를 제거합니다. 그다음 해부용 바늘을 사용하여 껍질 상단에 작은 구멍을 냅니다. 이 구멍을 덮도록 두 번째 테이프를 붙입니다.두 쌍의 핀셋을 사용하여 알에 원형 구멍을 냅니다. 배아를 잡아 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 접시에 넣어 세척합니다. 배아의 머리를 제거한 후, 상온의 무혈청 DMEM이 들어 있는 조직 배양 접시에 넣습니다.포셉으로 머리를 잡은 상태에서 배양 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 스프링 가위를 사용하여 상악과 하악을 머리의 나머지 부분으로부터 거시적으로 해부합니다. 그런 다음 날카로운 면도날이 장착된 블레이드 홀더를 사용하여 상악에서 전비돌기를 잘라냅니다.피펫을 사용하여 전두 비돌기를 PBS에 녹인 충분한 양의 disp가 담긴 30 millimeter 페트리 접시에 옮기고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 배양 시간이 경과하면 조직이 손상되지 않도록 주의하며 dispa 용액을 흡입하여 제거합니다. 그 다음 1% BSA가 포함된 DMEM으로 조직을 완전히 덮습니다.소화를

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Craniofacial 연골은 다른 조직들과 긴밀한 접촉을 개발하고 살아있는 동물의 조작 어렵습니다. 우리는 초기 배아 효과를 우회하면서 craniofacial 골격의 성장하는 동안 분자 도구를 제공하는 electroporation을 사용하고 있습니다. 이러한 접근 방식은 우리가 효율적으로 후보 분자를 테스트하실 수...

Craniofacial Mesenchyme의 Electroporation

두개골 mesenchyme 가능성이 신경 주름 상승을위한 원동력을 제공 극적인 morphogenic의 움직임을...

두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

태아 얼굴 외배엽과 mesenchyme의 분리를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 먼저 전체 배아를 취급하는 전체 얼굴 프로미넌스 prominences을 해부하기 위해 Dispase II를 사용하고 얼굴 외배엽과 mesenchyme 구분합니다.

마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리

Xenopus의 사이에 얼굴 조직을 "극단적 인 전방 도메인"이식에 대한 기술은 배아가 개발 한 laevis의. 조직은 두개 안면 개발 및 얼굴 영역 사이의 상호 작용을 신호에 대한 지역의 요구 사항의 연구를 허용, 또 다른 한개로 1 유전자 발현 배경에서 이동할 수 있습니다.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

이 프로토콜은는 Xenopus laevis의의 neurulas에서 premigratory 두개골 신경 능선 (NC)를 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 외식은 피브로넥틴 및 체외 배양에 도금, 또는 다시 호스트 배아에 이식 할 수 있습니다. 이 기술은 NC 상피 - 투 - 중간 엽 이행, 이주 및 분화의 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

의 해부<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 신경 크레스트<em&gt; 시험관</em&gt; 이식편 문화 또는<em&gt; 생체</em&gt; 이식

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

이 문서에서는 두개 안면 개발에 신경 능선 및 / 또는 기타 조직의 종 특정 기여를 테스트하기 위해 설계 키메라 배아를 생성하는 방법을 설명합니다.

메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

사지 형성에 필요한 병아리 배아에서 본체 축과 측면 조직 사이의 유도 이벤트를 차단하기 위해 불침투성 장벽을 사용하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 후보 유도 신호에 적신 구슬은 장벽 배치의 영향을 극복하는 데 사용되며 유전자 발현 분석을 통해 이를 확인할 수 있습니다.

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

여기에서, 우리는 마우스 두개안면 조직을 사용하여 면역 염색에 의해 두개안면 형태 형성/병인 동안 단백질 수준을 검출하고 정량화하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 면역 염색을 위한 젊은 마우스에게서 decalcified 되지 않은 단단한 조직의 준비 그리고 저온 절제를 위한 방법을 기술합니다.

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

이 기사에서는 두개안면 발달 중 기저 전뇌의 신호 전달 및 패턴 특성을 테스트하도록 설계된 조직 이식 기술에 대해 설명합니다.

얼굴 발달을 평가하기 위해 조류 전뇌 키메라 만들기

상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

학습하세요 닭 배아에 외배엽 조직을 이식하여 키메라 배아를 만드는 방법을 통해 두개안면 발달 과정에서 외배엽의 신호 및 패턴 형성 특성을 분석하는 기술입니다.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

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