Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

이 절차의 전반적인 목표는 공여체 배아의 외배엽을 병아리 배아의 발달 중인 상악으로 이식하여 키메라 배아를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 이식할 공여체 진피를 제거한 후, 숙주 부위를 이식 가능하도록 준비함으로써 수행됩니다.

절차의 마지막 단계는 공여 조직을 호스트 부위에 배치하고 이식편을 위치에 맞게 고정하는 것입니다. 최종적으로 공여 외배엽만이 선택적으로 생착된 결과를 얻을 수 있으며, 분자 및 형태학적 분석을 통해 재코드화된 공여 진피의 기능을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 형태 형성 과정 중 다양한 조직의 역할을 규명하는 것과 같이 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

본 절차의 시연은 저희 연구실의 선임 연구원인 Dr.Diane이 진행하겠습니다. 절차를 시작하기 전에 배지를 준비하고, 필요한 모든 용액이 준비되어 있으며 적절한 온도인지 확인하십시오. 그런 다음 적절한 보호 안경을 착용한 상태에서, 알코올 램프 불꽃 위에서 마이크로 모세관을 가늘게 늘려 미세한 끝점을 만듭니다.

프로판 토치의 불꽃에 텅스텐 바늘을 대어 날카롭게 만들기 위해 유리 핀을 사용합니다. 달걀 끝부분에 테이프 조각을 붙여 껍질로부터 공여 배아를 추출하는 과정을 시작합니다. 그런 다음 해부용 바늘의 끝을 사용하여 테이프 중앙에 작은 구멍을 냅니다.

10 mL 시린지와 18게이지 하이포더믹 바늘을 구멍에 삽입하여 알에서 알부민 1 mL를 제거합니다. 그다음 해부용 바늘을 사용하여 껍질 윗부분에 작은 구멍을 냅니다. 이 구멍을 덮도록 두 번째 테이프 조각을 붙입니다.

두 쌍의 핀셋을 사용하여 난자에 원형 개구부를 만듭니다. 배아를 잡고 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 디시에 넣어 세척합니다. 배아의 머리 부분을 제거한 후, 상온의 무혈청 DMEM이 담긴 조직 배양 디시에 넣습니다.

포셉으로 머리 부분을 잡은 상태에서 디쉬를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 스프링 가위를 사용하여 상악과 턱뼈를 머리의 나머지 부분에서 조대하게 절제합니다. 그런 다음 날카로운 면도날을 장착한 블레이드 홀더를 사용하여 상악에서 전비돌기를 다듬어 제거합니다.

피펫을 사용하여 전두비돌기(fronton nasal process)를 PBS에 용해된 diss가 충분한 부피로 들어 있는 30 millimeter 페트리 접시에 옮기고 20분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 배양 시간이 지나면 조직에 영향을 주지 않도록 주의하며 dispa 용액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 1%BSA가 포함된 DMEM으로 조직을 완전히 덮어줍니다.

소화를 중단시키기 위해 조직을 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 그 다음 해부 현미경 하에서 작업합니다. 무딘 텅스텐 바늘로 조직을 고정한 뒤, 날카로운 텅스텐 바늘을 사용합니다.

외배엽을 다른 조직에서 벗겨내어 분리합니다. 준비가 완료되면, 숙주가 이식 준비가 될 때까지 BSA가 포함된 DMEM 내에서 이식 조직을 얼음 위에 보관하십시오. 이전에 입증된 방법을 사용하여 달걀에 윈도우를 만듭니다.

두 쌍의 핀셋을 사용하여 배아가 포함된 알을 해부 현미경 아래에 놓습니다. IGN 막과 양막을 잡고 조심스럽게 찢어 구멍을 내어 호스트 배아를 노출시킵니다. 머리를 고정한 상태에서 한 쌍의 핀셋을 오른쪽 눈에 대고 압력을 가하여 머리를 회전시킵니다.

포셉과 바늘을 사용하여 이식편이 들어갈 공간을 만들기 위해 숙주의 진피를 제거합니다. 준비된 이식편이 들어 있는 페트리 접시에 neutral red 2 µL를 추가합니다. 유리 피펫을 사용하여 이식편을 숙주로 옮깁니다.

제거된 외배엽을 대체할 위치에 이식편을 배치합니다. 이식 후 이식편을 고정하기 위해 이식된 조직의 각 모서리에 유리 핀을 꽂습니다. 테이프로 창을 단단히 닫습니다.

분석에 필요한 발달 단계에 도달할 때까지 배아를 인큐베이터에 넣습니다. 이 이미지는 anti Q-C-P-N-A 메추라기 특이적 항체로 염색한 메추라기 병아리 URA 조직을 보여줍니다. 이식된 조직은 두 화살표 사이에 위치합니다. 마우스 병아리 키메라의 평균 종류 조직에서는 QCPN 염색의 증거가 보이지 않습니다. 여기서 다시 이식된 조직은 두 화살표 사이에 위치하며, C2는 B2 반복 서열에 특이적인 프로브를 이용한 하이브리드화를 보여줍니다.

mirroring class one genes 연구 결과, sign B two의 발현이 여기에 이미지로 표시된 이식편으로 구성된 부위에 국한됨이 밝혀졌으며, 이는 trichrome 염색을 거친 메추라기-닭 키메라 거울(quail chick chime mirror)의 모습입니다. trichrome 염색은 콜라겐과 뼈를 파란색으로 나타냅니다. 화살표로 표시된 바와 같이 상악 골격의 중복이 관찰됩니다. 이 이미지는 다시 trichrome 염색을 거친 마우스-닭 키메라 거울(mouse chick chime mirror)을 보여줍니다.

상악골의 중복이 관찰됩니다. 이 이미지는 마우스-닭 키메라의 조직에서 유래한 닭 배아의 중배엽 내 정상적인 BMP 7 발현을 보여주는 C2 방사성 동위원소 인시투 하이브리다이제이션 결과입니다. 화살표로 표시된 바와 같이, 이식물에 인접한 중배엽에서 BMP 7 발현이 유도되었음을 확인할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 전두 돌기 및 비 돌기의 발달을 조절하는 메커니즘을 평가하기 위해 닭 배아를 조작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.