Name: 대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 배우세요 면역결핍 마우스 좌골신경에 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포를 이식하고 생체 발광 영상으로 종양 성장을 모니터링하는 방법을. 이 기법은 후보 치료제의 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

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이 작품은과과 (케빈 A. 로스와 SLC와 KRZ에 CA13148 - 35 SLC에 R01 CA122804, R01 CA134773) 신경계 질환과 뇌졸중의 국립 연구소 (SLC에 R01 NS048353), 국립 암 연구소에 의해 지원되었다 국방 (SLC에 X81XWH - 09 - 1-0086). UAB 종합 암 센터 스몰 애니멀 영상 공유 시설의 운영을 지원하는 자금은 NCI 코어 지원 교부금 (; E. 파트, PI P30 CA13148 - 35)에 의해 제공되었다. 우리는 알라바마 신경 과학 청사진 코어 센터 (P30 NS57098)과 도움을 UAB 신경 과학 코어 센터 (P30 NS47466)를 주셔서 감사합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 건강이나 국방부의 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 자세한 orthotopic xenografting 방법은 우리가 널리 이러한 NF1 - 관련 주변 신경 칼집의 종양 연구에 사용되는 라인을 ST88 - 14 MPNST 전지를 사용하여 개발된 것이 하나이다. 그러나,이 방법은 다른 MPNST 셀 라인 잠복기 연구 쉽게 적응할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 우리가 ST88과 관찰과 비슷한 성공, STS - 26T 10 세포, NF1 - 관련 MPNST에서 파생됩니다 산발적으로 발생 MPNST 및 T265 - 2C 11 세포에서 파생된 라인 xenografting orthotopic 수행한 -14 세포. , 우리가 ST88 - 14 세포 xenografting orthotopic 여기 설명하는 정확한 조건이 직접 다른 MPNST 라인의 접목을 위해 채택 수 없습니다 갖는 것이라고 말했다. 대신, 방법론의 핵심 매개 변수는 경험적으로 각 세포주에 대한 결정되어야합니다. 이러한 매개 변수가 처음 이식할 MPNST 세포의 수, 낮은 정도 이식 개발과, 허용 시간을 포함, 볼륨이있는 종양 세포가 주입됩니다. 새로운 라인에 대한 이러한 매개 변수를 설정하기 위해, 우리 10월 3일부터 5일까지 X 10 6 종양 세포와 생쥐 (그룹 당 5 생쥐)의 그라 프트 그룹, 진도의 각 순서 (즉, 10 3 셀, 5 x는 세포의 두 농도를 확인 10 3 셀, 10 4 셀, 5 X 10 4 세포 등). 종양 세포 (&gt; 10 6)의 큰 숫자는 더 큰 볼륨에서 주입되어야하며 우리는 최대 5 ML에이 이식할 신경 세포의 손실없이 주입 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 고밀도 suspensions이 종양 세포를 죽이는 전단하는 경향이 점점 증가함에 따라 5 ML 볼륨 당 더 이상 5 개의 X 10 6 종양 세포 주입 수있는 것으로 나타났습니다. 각 그룹 내에서 적어도 세 동물은 우리가 그 그룹을 종료하고 그래프트 성장을 확인하는 histologically 신경을 검토하는 시점에서 만져서 알 수있는 종양을 때까지 우리는이 생쥐를 따르십시오. 일반적으로, 우리는 30~60일 이내에 최대한 허용 종양의 성장에 도달할 것입니다 세포의 농도를 찾고 있습니다, 물론, 시간이이 시점은 주입된 세포의 수에 따라 달라집니다 도달할 필요합니다. 더 빠른 성장은 어려운 실험 및 / 종료하기 전에 효과적인 치료 농도를 달성하거나 실험 과정을 통해 충분한 bioluminescence 이미징 datapoints의 수집을 방지하기 위해 만들 수 있습니다. 시간 코스 이상 육십일보다 실험적인 매개 변수는 다루기 힘든 조정하게 그리고 불필요하게 계획된 실험 기간을 연장. 마지막으로, 우리는 우리가 tamoxifen 6 치료 효과를 입증하기 위해 NIH III 마우스로 이식할 ST88 - 14 세포이 orthotopic xenografting 방법론을 사용한 점에 유의합니다. 우리가 일상적으로 orthotopic xenografts에 후보 치료 대리인의 효과를 평가하는 데 사용하는 방법에 대한 자세한 설명은 그 논문에서 찾을 수 있습니다. 또한 neurofibroma 세포가 성공적으로 수정,이 프로토콜에 제시된 절차 neurofibromas에 대한 감독 후보 치료 요원들과 잠복기 실험을 수행하는 데 사용할 수있는, 그 제안, 말초 신경 12에 이식할 수있다는 증명되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Foxchase 근친교배 외 SCID 마우스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>#236</td><td></td></tr><tr><td>NIH III 마우스</td><td>Taconic</td><td>#NIHBNX</td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID&amp;#947; 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>세포 박리제</td><td>Fisher Scientific</td><td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 수술용 접착제</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 시린지</td><td>Hamilton Co</td><td>#80030</td><td>10 &amp;#x03BC;L 부피</td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 바늘</td><td>Hamilton Co</td><td>#7803-05</td><td>33 Ga., 0.5인치, PT4 (주문제작)</td></tr><tr><td>이표</td><td>National Band and Ear Tag Co.</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>안연고</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 orthotopic xenografting 생체내에</em후보 치료 대리점> 테스트

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

체외 화면에서 후보 치료 요원의 초기 식별, 종양 성장이 적합한 동물 모델에서 수행되어야합니다 억제하는 약물의 능력의 엄격한 심사를위한 필수 있지만. 이러한 목적에 가장 적합합니다 동물 모델의 유형은 강렬한 토론의 주제입니다. 어떤 증거는 유전자 변형 생쥐에서 발생하는 종양에 대한 약물 효과를 검토 잠복기 재판은 임상 결과 1 개 중 더 예측하고 있으므로 치료 후보 대리인이 자주 이러한 모델 테스트는 것을 나타냅니다. 불행히도, 유전자 변형 모델은 다양한 종양 유형에 사용할 수 없습니다. 또한, 유전자 변형 모델은 종종 등은 인간의 대응, 종양 표현형 및 무능력의 불완전 penetrance은 종양이 개발 시기를 예측하는 방법을 잘 마우스 종양 모델에 같은 문제와 같은 다른 제한이 있습니다. 적절한 형질 종양 모델을 사용할 수없는 경우에는 그 결과, 많은 조사는 잠복기 실험에 대한 이종 이식 모델을 (인간의 종양 세포가 immunodeficient 생쥐에 이식할)을 사용합니다. 유전자 변형 모델을 사용할 경우에도 후자는 치료 범위의 빠른 결정을 촉진로서, 그들은 종종 이종 이식 모델와 제휴하고 있습니다. 또한,이 제휴는 유전자 변형 종양과 진정한 인간의 종양 세포에있는 에이전트의 효율성을 비교하실 수 있습니다. 역사적으로, 자주 (이소성 xenografts) subcutaneously 종양 세포를 주사에 의해 수행되었습니다 xenografting. 이 기술은 신속하고 상대적으로 저렴한, 재현할 수 있으며, 치료 기간이 중 종양 성장을 지속 quantitation 수 있습니다. 그러나, 피하 공간 이소성 xenografting로 얻은 가장 neoplasms 그리고 결과에 대한 일반 microenvironment하지 않습니다 인해 같은 호스트 조직 및 종양 유전자의 기관이 특정 표현의 부재로 요인에 오해하실 수 있습니다. 그것은 따라서 강력하게 이소성 이식 연구가 인간의 종양 세포가 원래 조직 (orthotopic xenografting) 2 융합하는 연구로 대체하거나 보완하는 것이 좋습니다되었습니다. 불행히도,이 권고의 구현은 종종 orthotopic xenografting 방법론이 아직 많은 종양 유형에 대한 개발되지 않은 사실에 의해 저지됩니다. 악성 말초 신경 쉬스 종양 (MPNSTs)는 neurofibromatosis 타입 1 3과 가장 일반적으로 좌골 신경 4 발생과 산발적으로 또는 조합에서 발생하는 매우 공격적인 sarcomas 있습니다. 여기 반딧불 루시페라제 - 태그 MPNST 인간 세포가 orthopically immunodeficient 생쥐의 좌골 신경에 xenografted되는 기술 직접적인 방법을 설명합니다. 개별 동물과 스터디 그룹에 후속이 아닌 편견 임의화에 접목 절차의 성공을 평가하는 우리의 방식도 설명되어 있습니다.

안정 immunodeficient 생쥐의 좌골 신경에 루시페라제 - 태그 인간의 악성 말초 신경 칼집 종양 세포를 접목하는 방법이 설명되어 있습니다. 스터디 그룹에 동물 임의의 분리를위한 종양 이식과 기준의 적절한 설립을 증명하기 위해 bioluminescence 이미징의 사용도 설명합니다.

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에</em후보 치료 대리점> 테스트

in vitro 스크리닝은 후보 치료제의 초기 식별에 필수적이지만, 약물의 ... 능력을 엄격하게 평가하는 것이 중요합니다.

본 절차의 전체적인 목표는 후보 치료제가 면역결핍 마우스의 좌골 신경에 이식된 M-P-N-S-T 세포의 성장을 효과적으로 억제하는지 확인하는 것입니다. 이를 위해 먼저 조직 배양 플라스크에서 종양 세포를 제거하고, 세척한 후 적절한 농도로 재현탁합니다. 절차의 두 번째 단계는 수술적으로 좌골 신경을 노출시킨 다음, 해당 신경에 5,000 cells를 주입하는 것입니다.다음 단계는 in vivo 광학 이미징을 사용하여 이식 성공 여부를 결정하고, CIN을 연구 그룹으로 무작위 배정하여 후보 치료제 투여를 시작하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 이식 30일 후에 종양을 수집하여 후보 치료제가 종양에 미친 영향을 분석하는 것입니다. 최종적으로 종양 무게 비교, KI 67 면역 염색을 통한 상대적 증식률 확인, TUNEL 분석을 이용한 대조군 및 치료군 마우스의 종양 세포 사멸 수준 평가 등의 방법을 통해 치료제가 종양 성장을 감소시켰는지 여부에 대한 결과를 얻을 수 있습니다.피하 이식과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 정상적인 미세환경을 모델링한다는 것이며, 이는 M-P-N-S-T 성장을 더 잘 모델링한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 제 실험실의 기술자인 Amy Turk가 시연하겠습니다. 비누드 면역결핍 마우스는 이식 전날 준비합니다. 체온 유지를 위해 가열 패드 위에서 마취된 마우스의 털을 클리퍼로 제모하십시오.화학 제모제를 사용하여 남아 있는 털을 제거합니다. 모든 털이 제거되면, 쥐를 베딩이 없는 격리 케이지 내의 가열 패드 위에 올려두고 완전히 회복될 때까지 유지합니다. 이식 당일에 세포를 3000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.스냅을 조심스럽게 제거하고, 세포 펠릿을 퓨어마이신이 포함되지 않은 DMEM 10에 3 µL당 5 × 10³ cells의 최종 농도로 재현탁합니다. 세포는 사용 직전까지 얼음 위에 보관하십시오. 먼저, 마취된 동물을 가열 패드 위에 올리고 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다.각 마우스의 오른쪽 귀에 고유 식별 번호가 적힌 이어 태그를 부착합니다. 연구 전반에 걸쳐 식별을 용이하게 하기 위해, 동물을 복와위로 눕히고 뒷다리를 벌립니다. 멸균 드레이프로 마우스를 덮고 이식이 이루어질 부위에 수술 창을 확보합니다.면봉을 사용하여 수술 부위의 측면 중앙에서 시작해 수술 창의 가장자리까지 점차 나선형으로 넓혀가며 Betadine을 도포합니다. 그 다음 동일한 방식으로 수술 부위에 70% ethanol을 도포합니다. Betadine 도포 후 ethanol을 도포하는 이 과정을 두 번 더 반복합니다.세포를 얼음에서 꺼낸 후, 부드럽게 볼텍싱하거나 튜브를 톡톡 쳐서 가라앉은 세포를 재현탁합니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액 3.2 µL를 취해 파라폼 위에 분주합니다. 10 µL 해밀턴 시린지에 세포 현탁액 3 µL를 흡입합니다.33 gauge 바늘을 장착합니다. 세포와 세포가 들어 있는 주사기를 사용 직전까지 얼음 위에 보관하십시오. 22번 메스 날이 장착된 4번 메스 핸들을 사용하여 대퇴골 바로 아래에서 대퇴골과 평행하게 측면 피부를 절개합니다.수술용 클램프로 피부 절개 부위를 벌려 하부의 근육을 노출시킵니다. 현미경 하에서 다리 길이를 따라 뻗어 있는 근막을 끝이 뾰족한 가위로 둔성 박리하여, 굵은 실 정도 두께의 흰색 선형 구조 아래에 위치한 좌골신경을 노출시킵니다. 끝이 뾰족한 곡선 핀셋을 사용하여 신경 아래쪽을 조심스럽게 박리함으로써 하부 근육으로부터 신경을 분리합니다.신경을 들어 올린 상태로 주의 깊게 격리하기 위해 포셉을 그대로 둡니다. 주사 바늘이 신경의 하단부를 관통하지 않도록, 가급적 신경과 평행한 각도를 유지하며 Hamilton 시린지의 바늘을 신경 내로 삽입합니다. 바늘이 신경 내에 적절히 위치하면 포셉으로 가했던 장력을 풀고, 45~60초에 걸쳐 천천히 세포를 주입합니다. 종양 세포가 역류하여 손실되는 것을 방지하기 위해서는 천천히 주입하는 것이 필수적입니다.모든 세포의 주입이 성공적으로 완료되면, 주입된 물질의 손실을 최소화하기 위해 바늘을 천천히 뽑습니다. 주입이 끝나면 수술용 클램프와 포셉을 제거합니다. 그런 다음 신경을 원래 위치에 조심스럽게 되돌려 놓습니다.Vet bond 외과용 접착제로 절개 부위를 폐쇄하며, 접착제가 마를 수 있도록 포셉으로 약 20초 동안 고정합니다. 동물이 완전히 회복될 때까지 베딩이 없는 가열된 케이지에 넣습니다. 마우스의 건강 상태를 모니터링합니다.종양 부담이 동물의 정상 체중의 10%를 초과하거나 체중 감소가 20%를 초과하는 경우, 해당 마우스를 매일 연구에서 제외합니다. 시술의 성공 여부를 결정하기 위해 이식 후 1일 및 3일에 생물 발광 이미징을 수행합니다. 마우스에 2.5 milligrams의 Lucifer를 주입하고 마취된 동물을 가열 이미징 플랫폼 위에 놓습니다.기질 주입 10분 후에 종양에서 발현된 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase)로부터 방출되는 빛을 검출합니다. Xeno Gen 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득 시간을 1초에서 10분 범위로 설정하십시오. 그런 다음, 마우스의 흑백 사진과 의사색(Pseudocolor) 사진을 촬영하십시오.빛 방출 강도를 측정하기 위해 생체 발광 스케일을 이 이미지들에 겹쳐 표시하였습니다. 전임상 시험 코호트에 포함되려면, 마우스는 이식 후 1일과 3일 모두에서 감지 가능한 생체 발광 신호를 보여야 하며, 신호 강도가 1일에서 3일 사이에 증가해야 합니다. 여기에는 누드 마우스에 적절히 형성된 정위 제노그라프트(orthotopic xenograft)에서 이식 후 1일부터 18일까지 관찰된 전형적인 생체 발광의 점진적 증가 양상이 나타나 있습니다.서로 다른 마우스의 관심 영역 내에서 검출된 신호들이 유사함에 주목하십시오. 이식 후 10일과 18일에 다시 영상을 촬영한 결과, 개별 마우스의 이식 부위에서 생체 발광 신호가 점진적으로 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이식 후 1일부터 24일까지 관찰된 생체 발광 신호를 정량화하면, 이러한 신호들이 점진적으로 증가하지만 연구 기간 후반부에 종양 성장이 현저히 가속화됨을 보여줍니다.M pns ts의 공격적인 성장 특성으로 인해, 이식된 종양 세포는 종종 신경의 정상적인 장벽을 뚫고 인접 조직으로 침습합니다. 이 이식 부위의 광학 현미경 사진은 종양 성장과 인접 골격근으로의 국소적 침습을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 마우스 한 마리당 10분 내에 완료할 수 있습니다.

orthotopic-xenografting-human-luciferase-tagged-malignant-peripheral

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

루시페라제 - 수정된 인간의 뇌 종양의 xenografts은 종양 성장과 bioluminescence 이미징을 사용하여 치료에 대한 응답의 후속 모니터링과 athymic 생쥐에 intracranially 설정할 수 있습니다. 생존 분석과 함께, bioluminescence 모니터링 뇌 종양 치료를위한 고려되는 요법의 사전 임상 시험을위한 필수적인 연구 도구입니다.

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췌장암 생물학의 개선 이해는 매우 췌장암을 치료하는 더 나은 치료 옵션의 개발을 가능하게하기 위해 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 사용하여 암 진행의 비 침습 모니터링을 허용 췌장암의 동소 모델을...

췌장암의 진행 발광 동소 모델

GL261 신경교종 세포는 교모세포종의 유용한 면역 역량 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜의 목표는 생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 두개내 종양 성장을 모니터링하기 위한 적절한 기술을 시연하고, 종양 면역학 연구를 위한 루시페라제 변형 GL261 세포의 유용성 및 교모세포종 치료를 위한 면역 요법 접근법을 검증하는 것입니다.

교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

생물 발광 영상은 종양과 전이를 지역화 잘 알려진 도구이지만, 이러한 이미지의 정량화는 종종 복잡한 계산 및 특정 장비를 필요로한다. 우리는 더 계산을 요구하지 않으며, 종양 부담과 치료 반응이 마우스 모델에서 관찰 할 수 있도록 정확한 획득 상태에 기초하여, 사용하기 쉬운 luminoscore 방법을 설명한다.

마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

여기 우리가 사용 발광, x 선, 그리고 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 이미징 공부 어떻게 억제 mTOR 활동 영향이 종이 식 모델에서 골 engrafted 발성 종양. 이로써 순수 관련, 비-침략 적, 및 복합 요법 골 engrafted 발성 종양에서 vivo에서대상의 안티 발성 효과의 분석.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

여기에서 우리는 T 세포 참여 이중특이적 항체의 항종양 효능 및 메커니즘을 평가하기 위한 연구에서 종양에 대한 이중특이적 항체 유도 T 세포 이동의 생체 내 추적을 용이하게 하기 위해 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하는 방법을 설명합니다.

루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

폐암에 대한 새로운 치료법 개발의 주요 과제에는 국소 질환이 전이성 질환으로 진행됨에 따라 종양 미세 환경을 모델링하는 것이 포함됩니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 질병의 생체 내 추적을 가능하게 하는 폐암의 동소 동계 모델을 확립하는 간단한 방법을 설명합니다.

폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

신경섬유종증 1형(NF1)은 성장을 위해 특정 신경 미세 환경이 필요한 양성 말초 신경초 종양(신경섬유종)을 유발합니다. NSG 마우스에 인간 슈완 세포의 신경내 주사를 사용하여 최적화된 동소 이종이식 모델이 개발되었습니다. 이 모델은 인간 신경섬유종을 요약하고 치료 전략을 평가할 수 있는 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

신경섬유종증 1형 신경섬유종에 대한 동소 좌골 신경 이종이식편

배우세요 면역결핍 마우스 좌골신경에 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포를 이식하고 생체 발광 영상으로 종양 성장을 모니터링하는 방법을. 이 기법은 후보 치료제의 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에 테스트

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