대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에 테스트

안정 immunodeficient 생쥐의 좌골 신경에 루시페라제 - 태그 인간의 악성 말초 신경 칼집 종양 세포를 접목하는 방법이 설명되어 있습니다. 스터디 그룹에 동물 임의의 분리를위한 종양 이식과 기준의 적절한 설립을 증명하기 위해 bioluminescence 이미징의 사용도 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 후보 치료제가 면역 결핍 마우스의 좌골 신경에 이식된 M-P-N-S-T 세포의 성장을 효과적으로 억제하는지 여부를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 조직 플라스크에서 종양 세포를 제거하고 세척한 다음 적절한 농도로 현탁하여 재생함으로써 이루어집니다. 절차의 두번째 단계는 외과적으로 좌골 신경을 드러내고 5, 000의 세포를 가진 그 후에 신경을 주사하기 위한 것이다.

다음 단계는 CIN을 연구 그룹에 무작위 배정하고 후보 치료제로 치료를 시작하는 생체 내 광 기반 이미징을 사용하여 이식의 성공 여부를 결정하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 이식 후 30일 후에 종양을 채취하고 후보 치료제가 종양에 미친 영향을 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 종양 중량 비교, KI 67에 대한 면역 염색을 통한 상대적 증식률 조사, 대조군 및 투여된 마우스의 종양 세포 사멸 수준을 터널 분석으로 평가하는 등의 방법을 통해 치료제가 종양 성장을 감소시켰는지 여부를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

피하 이식과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 정상적인 미세환경을 모델링한다는 것인데, 이 기술은 M-P-N-S-T 성장을 더 잘 모델링하여 이 기술을 제 연구실의 기술자인 Amy Turk가 보여줄 것입니다. 무벌 면역 결핍 마우스는 이식 전날 준비합니다. 가위를 사용하여 마취된 쥐의 털을 면도하고 체온을 유지하기 위해 발열 패드에서 작업합니다.

화학 제모제를 사용하여 남아 있는 머리카락을 제거하십시오. 모든 털이 제거되면 완전히 회복될 때까지 침구가 없는 격리 케이지의 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 이식 당일에는 3000RPM에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

스내트를 조심스럽게 제거하고 pur mycin이 없는 DMEM 10에서 세포 펠릿을 3마이크로리터당 세 번째 세포에 5배 10의 최종 농도로 재현탁합니다. 사용할 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오. 먼저 마취된 동물을 발열 패드에 놓고 각 눈에 안과 연고를 바릅니다.

고유 식별자 번호가 있는 귀 태그를 각 마우스의 오른쪽 귀에 끼웁니다. 연구 내내 쉽게 식별할 수 있도록 동물을 엎드려 놓고 뒷다리를 벌립니다. 멸균 드레이프로 마우스를 덮고 이식이 이루어질 수술 창을 노출시킵니다.

옆구리 중앙에서 시작하여 수술 창 가장자리까지 점차 바깥쪽으로 나선형으로 솜털 어플리케이터를 사용하여 Betadine을 수술 부위에 바릅니다.그런 다음 70% 에탄올을 같은 방식으로 수술 부위에 도포합니다. 베타딘에 이어 에탄올을 연속적으로 적용하면 두 번 더 반복됩니다.

얼음에서 세포를 제거하고 부드럽게 소용돌이치거나 튜브를 튕겨 침전된 세포를 다시 현탁시킵니다. 피펫을 사용하여 3.2마이크로리터의 세포 현탁액을 제거하고 파라폼 조각으로 배출합니다. 3마이크로리터의 셀 현탁액을 10마이크로리터 Hamilton 주사기에 당깁니다.

33 게이지 바늘이 장착되어 있습니다. 사용할 준비가 될 때까지 세포와 주사기가 들어 있는 세포를 얼음 위에 올려 놓습니다. 22번 메스 날이 장착된 4번 메스 손잡이를 사용하여 대퇴골과 평행하게 바로 아래 옆구리의 피부를 절개합니다.

수술용 클램프로 피부 절개 부위를 열어 밑에 있는 근육을 노출시킵니다. 끝이 뾰족한 가위를 사용하여 다리 길이를 따라 흐르는 근막을 무디게 절개하고 현미경으로 작동하는 두꺼운 실 두께의 흰색 선형 구조 아래에 있는 좌골 신경을 노출시킵니다. 끝이 날카롭고 구부러진 집게를 사용하여 신경 아래를 조심스럽게 절개하여 밑에 있는 근육에서 신경을 느슨하게 합니다.

신경을 높이거나 고립된 상태로 유지하기 위해 집게를 제자리에 두십시오.해밀턴 주사기의 바늘을 신경에 삽입하고 주사 각도를 신경과 가능한 한 평행하게 유지하여 아래쪽으로 구멍을 뚫지 않도록 합니다. 바늘이 신경에 적절하게 배치되면 겸자로 인해 발생하는 긴장을 풀고 45-60초에 걸쳐 천천히 세포를 주입합니다. 종양 세포의 역류로 인해 손실되는 것을 방지하기 위해 천천히 주입하는 것이 필수적입니다.

모든 세포가 성공적으로 주입된 후 주입된 물질의 손실을 최소화하기 위해 바늘을 천천히 빼냅니다. 주입이 완료되면 수술용 클램프와 겸자를 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 신경을 원래 위치로 되돌려 놓습니다.

vet bond 수술용 접착제로 절개 부위를 닫고 접착제가 마를 때까지 약 20초 동안 집게로 함께 유지합니다. 동물이 완전히 회복될 때까지 침구가 없는 가열된 케이지에 동물을 넣습니다. 마우스의 건강을 모니터링합니다.

매일 생쥐는 연구에서 제외됩니다. 종양 부담이 동물의 정상 체중의 10%를 초과하거나 체중 감소가 20%를 초과하는 경우절차의 성공 여부를 확인하려면 이식 후 1일 및 3일 후에 생물 발광 이미징을 수행합니다. 마우스에게 2.5mg의 루시퍼를 주입하고 마취된 동물을 가열된 이미징 플랫폼에 놓습니다.

종양에서 발현된 반딧불이 루시퍼라아제로부터의 광 방출은 기질 주입 후 10분 후에 검출됩니다. Xeno Gen의 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득 시간을 1초에서 10분 범위로 설정합니다. 다음으로, 생쥐 Pseudocolor의 흑백 사진을 찍습니다.

생물 발광의 스케일링은 광 방출 강도를 측정하기 위해 이러한 이미지와 중첩됩니다. 전임상 시험 코호트에 포함되려면 마우스는 이식 후 1일에서 3일 사이에 검출 가능한 생물 발광 신호가 있어야 하며, 신호의 강도는 1일에서 3일 사이에 증가해야 합니다. 여기에 표시된 것은 누드 마우스에서 적절하게 확립된 정소성 이종이식편에서 이식 후 1일에서 18일 후에 관찰된 생물 발광의 전형적인 점진적 증가입니다.

서로 다른 마우스의 관심 영역 내에서 감지된 신호의 유사성에 주목하십시오. 이식 후 10일과 18일 후에 재이미징한 결과, 개별 마우스의 이식 부위에서 생물 발광 신호가 점진적으로 증가하는 것을 볼 수 있습니다. 이식 후 1일에서 24일 후에 관찰된 생물 발광 신호의 정량화는 이러한 신호가 점진적으로 증가하지만 종양 성장이 연구 기간의 후반 단계에서 현저하게 가속화된다는 것을 보여줍니다.

M pns ts의 공격적인 성장을 감안할 때, 이식된 종양 세포는 종종 신경의 정상 장벽을 뚫고 인접 조직을 침범합니다. 이식 부위의 이 사진 현미경 사진은 종양의 성장과 인접한 골격근으로의 국소 침입을 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 10분 안에 한 마리의 마우스로 수행할 수 있습니다.