모스의 효율적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중재 변환 Physcomitrella patens

이 절차의 전반적인 목표는 SCO 미터 프로토플라스트를 변형하는 것입니다. 이것은 먼저 Drizly로 식물을 소화함으로써 달성됩니다. 다음으로, 원형아세포를 만니톨로 세척하여 이슬비를 제거한 다음 DNA와 페그로 배양합니다.

마지막으로, 형질전환된 원형질체를 플레이트에 펴고 배양합니다. 궁극적으로 결과를 얻을 수 있습니다. 그 쇼는 형광 현미경 검사를 통해 형광 표지된 단백질을 발현하는 변형된 원형질체를 보여줍니다.이 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 박사후 연구원인 Y lu가 될 것입니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 효과적이고 지속적으로 관심 단백질을 발현하는 원형질체를 생성한다는 것입니다. 이끼를 분리하기 위해 원형질체는 주걱을 사용하여 페트리 접시에 8% 만니톨 9ml를 첨가하는 것으로 시작합니다. 5-7일 된 이끼를 2-3개의 PP NH 플레이트에 4개의 플레이트를 만니톨에 넣습니다. 이 시약 레시피와 추가 시약 레시피에 대해서는 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로 2%drizly 3ml를 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.

100미크론 메쉬를 통해 혼합물을 여과하여 녹색의 균질한 현탁액을 얻습니다. 그런 다음 여과액을 250G에서 5분 동안 회전시킵니다. 상등액을 아주 부드럽게 버리십시오.

프로토플라스트를 500마이크로리터의 8%만니톨에 재현탁합니다. 그런 다음 9.5ml의 8% 만니톨을 추가로 첨가합니다. 원형질체가 완전히 매달려 있는지 확인하십시오.

용액을 250G에서 5분 동안 다시 회전시켜 세척 단계를 두 번 더 수행합니다. 상층액을 버리고 원형질체를 매달아 소생시킵니다. 500마이크로리터 최초.

그런 다음 혈구 분석기를 사용하여 9.5 밀리리터의 8 % 만니톨을 사용합니다. DNA를 분리된 프로토플라스트로 변환하기 위해 현탁액의 10마이크로리터에 있는 프로토플라스트의 수를 세십시오. 먼저 프로토플라스트 혼합물을 250G에서 5분 동안 회전시킵니다.

상층액을 제거하고 MMG 용액에서 밀리리터당 160만 파운드로 프로톱플라스트를 재현탁합니다. 현탁액을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 600마이크로리터의 Protoplasts 용액을 60마이크로그램의 DNA가 들어 있는 배양 튜브에 추가합니다. 떨다.

700마이크로리터의 PEG 칼슘 용액을 부드럽게 넣고 흔듭니다. 이 대기 시간 동안 샘플을 실온에서 30분 동안 잘 배양합니다. PRMB 플레이트를 셀로판지로 덮습니다.

그런 다음 3 밀리리터의 W 5 용액으로 현탁액을 희석하고 250G에서 5 분 동안 회전시킵니다. PEG 재현탁액을 제거하기 위해 프로토플라스트는 셀로판으로 덮인 PRMB 플레이트당 1밀리리터의 PRMT 플레이트에서 2밀리리터의 프로토플라스트를 사용합니다. 성장 챔버에서 플레이트를 섭씨 25도로 유지하십시오.

마지막으로, 변형 4일 후 셀로판지를 새로운 선택 플레이트로 옮깁니다. 이 그림은 하이그로마이신 저항성 카세트를 운반하는 15마이크로그램의 슈퍼 코일 플라즈마, DNA로 변형된 원형질체에서 재생된 18일 된 식물의 예를 보여줍니다. 여기서, 30 마이크로그램의 동일한 슈퍼 코일 플라스미드, DNA가 프로토플라스트로 변형되었습니다.

이 샘플에서 60마이크로그램의 격자 무늬 DNA가 변형되었습니다. 마지막으로, 이 식물은 하이그로마이신 저항성 카세트를 운반하는 120마이크로그램의 동일한 슈퍼 코일 플라즈마 DNA로 형질전환된 원형질체에서 재생되었습니다. 형질전환 효율은 최대 60마이크로그램의 DNA 농도에 영향을 받지 않습니다.

그러나 더 높은 농도의 DNA는 이 절차에 해롭습니다. 데이터는 이 방법이 한 학기에 한 번의 광범위한 DNA 양에 대해 일관된 결과를 제공한다는 것을 나타냅니다. 이 기술은 제대로 수행되면 3 시간 안에 완료 할 수 있습니다.

이 절차에 따라 유전자 기능에 대한 추가 질문에 답하기 위해 일시적인 RNAi 및 유전자 knockouts와 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다.