핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

NanoDrop 샘플 유지 시스템은 액체 고유의 표면 장력을 이용하여 QTS나 모세관 없이 두 개의 광학 페데스탈 사이에 마이크로 볼륨 샘플을 유지하고 측정하는 혁신적인 기술입니다. 1 µL만큼 적은 양의 샘플을 하단 광학 표면 위에 직접 피펫팅합니다. 분광계 암을 닫으면 상단과 하단 광학 페데스탈 사이에 액체 기둥이 형성됩니다.

표면 장력으로 수직 광학 경로가 형성되어, 측정 중에 수직 경로 길이가 실시간으로 자동 변경될 수 있습니다. 경로 길이를 단축함으로써 더 높은 농도의 측정이 가능해지며, 대부분의 핵산 샘플에 대해 희석 과정을 수행할 필요성을 효과적으로 제거합니다. 또한, 샘플 유지 시스템은 실험실용 와이프로 광학 표면을 단순히 닦아내는 빠른 세척 과정을 통해 실험 프로세스를 가속화합니다.

오늘은 Thermo Scientific 마이크로 볼륨 장비를 사용하여 핵산 농도를 측정하는 두 가지 절차를 시연하겠습니다. 첫 번째 프로토콜은 NanoDrop 2000C 분광광도계를 이용한 직접적인 핵산 측정이며, 두 번째 프로토콜은 NanoDrop 3000 형광 분광광도계를 이용한 간접 형광 핵산 측정입니다.

시작하려면, 깨끗한 탈이온수를 2~3 µL 파이펫팅하여 마이크로 볼륨 분광광도계 시료 유지 시스템의 하단 광학 표면에 떨어뜨려 상단 및 하단 광학 표면을 세척합니다. 레버 암을 닫아 상단 페데스탈이 탈이온수에 닿도록 합니다. 레버 암을 들어 올리고 깨끗하고 건조한 보풀 없는 실험용 와이프로 양쪽 광학 표면을 닦아냅니다.

다음으로, NanoDrop 소프트웨어를 실행하고 핵산 애플리케이션을 선택하십시오. 소량 분주용 교정 피펫을 사용하여 1 µL의 버퍼를 하단 광학 표면에 분주하여 블랭크 측정을 수행합니다. 레버 암을 내리고 핵산 애플리케이션에서 blank를 선택하십시오.

공시료 측정이 완료되면, 실험용 와이프로 양쪽 광학 표면을 닦아냅니다. 이전과 마찬가지로 측정할 시료에 적합한 상수를 선택하십시오. 다음으로, 1 µL의 핵산 시료를 하단 광학 페데스탈에 분주하고 레버 암을 닫습니다.

측정이 부피와 무관하게 이루어지므로, 샘플은 두 광학 표면 사이의 간극을 메울 정도만 있으면 됩니다. 측정을 수행하려면 애플리케이션 소프트웨어에서 measure를 선택하십시오. 그러면 소프트웨어가 핵산 농도와 순도 비율을 자동으로 계산합니다. 샘플 측정 후 스펙트럼 결과물을 검토하십시오. 전형적인 핵산 샘플은 매우 특징적인 프로파일을 나타냅니다.

품질이 낮은 시료의 스펙트럼 지표로는 베이스라인의 파형 및 260 nanometer 피크에서의 굴곡 등이 있습니다. 특정 핵산 분리 기술과 관련된 일반적인 오염원은 페놀, 트라이올 및 컬럼 추출 등이 있습니다. 페놀 트라이올 추출의 경우, 220에서 240 nanometer 사이의 비정상적인 스펙트럼과 260에서 280 nanometer 영역의 이동을 통해 잔류 시약 오염을 확인할 수 있습니다.

반대로, 컬럼 추출 시 잔류한 구아니딘(guanidine)은 230nm 부근의 피크를 형성하거나, 저점(trough)을 230nm에서 약 240nm로 이동시키는 원인이 될 수 있습니다. 시료의 순도를 정확하게 평가하려면 260/280 및 260/230 비율을 전체적인 스펙트럼 품질과 함께 분석해야 합니다. 순수한 핵산의 경우, 260/280 비율은 일반적으로 DNA는 약 1.8, RNA는 약 2.0으로 나타납니다.

이 비율은 블랭크 및 샘플 측정에 사용된 완충액의 pH와 이온 강도에 따라 달라집니다. Banana drop 3, 300 형광 분광계는 NanoDrop 2000 C 분광 광도계와 동일한 특허 받은 미량 샘플 유지 시스템을 채택하고 있습니다. 단 1 µL의 샘플만으로 형광 측정이 수행되며, 사용자는 샘플에 수평으로 조사되는 3가지 LED 중 하나를 여기 광원으로 선택합니다.

그 후 샘플의 형광은 수직 90도 각도로 내부 분광계로 수집됩니다. NanoDrop 3, 300을 이용한 고감도 미량 핵산 정량을 시연하기 위해, PicoGreen 형광 키트를 사용하여 키트 표준물질과 모든 핵산 샘플을 실온으로 평형화하기 시작합니다. 형광 샘플은 빛에 민감하므로 갈색 튜브나 알루미늄 호일로 감싼 튜브에 보관해야 합니다.

측정할 모든 표준물질과 샘플, 그리고 필요한 pico green 작업 용액에 충분한 양의 1X TE 완충액을 준비하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 제공된 20X TE 완충액을 nuclease-free water로 희석하여 1X TE 완충액을 준비하십시오. 반응 부피는 200 µL에서 최소 10 µL까지 조절 가능합니다.

본 예제에서는 10 µL의 반응 부피를 준비하겠습니다. 다음으로, 미지의 DNA 샘플의 예상 농도 범위를 포괄할 수 있도록 연속 희석한 이중 가닥 DNA 표준 물질과 뉴클레아제 프리 바이알 또는 튜브를 준비하십시오.

희석된 이중 가닥 DNA 표준물질 각각 5 µL를 개별적으로 라벨링된 뉴클레아제 프리 앰버 튜브 또는 호일로 감싼 튜브에 옮깁니다. 그런 다음, 분석 대상인 각 이중 가닥 DNA 시료 5 µL를 적절하게 차광 처리된 튜브에 분주합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 Pico Green 작업 용액을 준비한 후, 이중 가닥 DNA 표준물질 또는 이중 가닥 DNA 시료가 들어 있는 각 튜브에 동일한 부피의 용액(이 경우 5 µL)을 옮깁니다.

XTE 완충액과 Pico Green 작업 용액을 동일한 부피로 혼합합니다. 기준 용액으로 사용될 음성 대조군을 준비합니다. 완만한 피펫팅을 통해 각 튜브의 내용물을 충분히 섞은 후, 상온에서 5분 동안 배양합니다.

형광 신호는 온도에 영향을 받으므로, 측정 전 모든 표준물질과 시료를 동일한 온도로 평형화해야 합니다. 기기를 준비하고 먼저 측정을 수행하려면, 시료 유지 시스템의 하단 및 상단 표면을 세척하고, 하단 광학 표면 근처에 탈이온수를 2~3 µL 피펫으로 분주하십시오. 그런 다음 레버 암을 열고 깨끗한 보풀 없는 실험실용 와이프로 상단 및 하단 페데스탈을 닦아내십시오.

진행하기 전에 표면에 보풀이 없는지 확인하십시오. 보풀은 여기 광원이 있을 때 형광을 나타낼 수 있으며 측정을 방해할 수 있기 때문입니다. 기기 소프트웨어를 실행하십시오.

핵산 애플리케이션을 선택하고 pico green 이중 가닥 DNA 옵션을 선택하십시오. 2 µL의 1X TE를 하단 페데스탈에 피펫팅합니다. 레버 암을 닫고 기기 소프트웨어 필드에서 blank를 선택하십시오. 블랭크 측정이 완료되면 샘플 유지 시스템의 양쪽 표면에서 블랭크 용액을 닦아내십시오.

다음으로, low retention 팁을 사용하여 부드럽게 피펫팅하여 표준 용액을 혼합합니다. 표준 용액 2 µL를 하단 페데스탈에 피펫팅하고 레버 암을 닫습니다. standards 탭에서 reference를 선택하고 원하는 단위를 선택합니다.

측정(measure)을 클릭하여 측정 사이클을 시작합니다. 측정 사이클이 완료되면 레버 암을 열고 시료 유지 시스템 표면의 액체를 완전히 닦아냅니다. 매 반복 측정마다 새로운 Eloqua를 사용하여 표준 물질을 최대 5회 반복 측정합니다.

표준 곡선을 작성하기 위해 추가 표준품에 대해 동일한 과정을 반복하십시오. 최대 7개의 표준품을 사용할 수 있습니다. 소프트웨어는 각 표준품당 최대 5개의 반복 측정값을 저장하도록 설계되어 있습니다.

표준물질의 반복 측정값을 평균하여 표준 곡선을 생성하며, 이를 통해 시료 농도가 자동으로 결정됩니다. 표준 곡선 작성이 완료되면 시료 탭을 선택하고, 각각의 시료 ID 정보를 입력한 후 각 미지 시료를 측정하십시오. 유효한 곡선이 생성되었다는 것은 표준물질의 최소 개수 요건이 충족되었음을 의미합니다.

DNA 농도는 표준 곡선을 기반으로 자동 계산됩니다. NanoDrop 미량 분석 기기는 직접적인 A260 측정 또는 간접적인 형광 측정법을 통해 핵산 농도를 결정할 수 있습니다. NanoDrop 분광광도계는 또한 직접적인 A280 흡광도 측정 또는 단백질 비색 분석법을 사용하여 단백질을 정량하는 데 사용할 수 있습니다.