Name: 전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 배우세요 전압에 민감한 염료를 이용한 광학 기록법으로 게의 위장신경절에서 뉴런 활동과 시냅스 상호작용을 실시간으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 중추 패턴 생성기의 신경망 역학 연구에 활용됩니다.

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우리는 울름 대학에 의해, 그리고 SciMedia 회사 (도쿄, 일본)에 의해, 뉴캐슬 대학의 과학, 농업 공학 컴퓨팅 과학 학부의 학교에서 지원을 인정합니다.

1. 크랩 Stomatogastric 신경계의 준비 성인 암 pagurus L.는 (- 12 ° C 10) 로컬 소스 (뉴캐슬 대학 해양 연구소를 도브)에서 얻은 및 필터링, aerated 바닷물에 보관했다. 절개 전에 40 분 - 동물 20 얼음에서 그들을 포장하여 anesthetized되었습니다. 우리는 고립 stomatogastric 신경 시스템 (STNS 1)를 사용합니다. 냉장 호수 (10-13 ° C)와 함께 - STNS은 (12 ML / 분 7) 실리콘 엘라스토머 늘어선 (ELASTOSIL RT - 601 바커, 뮌헨, 독일) 페트리 접시에 넘어뜨린 지속 superfused되었습니다. , MgCl 2, 26, CaCl 2, 13, KCl, 11, trisma 기지, 10, maleic 산성, 5 NaCl, 440 : 생리 식염수는 (mMol * L - 1)로 구성되어. 13 ° C와 산도 7.4에서 - - 7.6 살린은 11 일정한 온도에서 보관되었다. stomatoastric 신경절 (STG)의 desheathing 포함한 STNS의 해부와 준비의 세부 단계는, Guttierez 및 Grashow 1 조브 문서에 제공됩니다. 모든 실험은 24 일 1986년 11월 (86/609/EEC)의 유럽 사회 이사회에 따라 진행되었다. 그림 1A는 STNS 및 그림 1B의 구조 다이어그램의 뉴런은 신경의 후부 부분에서 평면 반원으로 배열하는 데 일반적인 desheathed STG를 보여줍니다 보여줍니다. 모델링 점토로, STNS있는 페트리 접시는 이미징 현미경의 운영 플랫폼 (올림푸스, 일본 도쿄 BW51 WI)에 고정됩니다. 모두가 현미경 단계와 현미경은 광학 녹음하는 동안 운동 유물을 방지하기 위해 (Scientifica, 어크필드, 영국)의 진동 절연 테이블에 장착됩니다. stomatogastric 신경절 (STG)에서 생성된 모터 패턴은 세포 음반 2-4을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 이것은 다음 단계로 이루어집니다 : <ol><li> 석유 젤리 기반 원통형 구획은 전기 욕조 (페트리 접시는 이미징 현미경의 운영 플랫폼에 배치되기 전에 이것은 해부 무대에서 수행에서 신경을 분리하는 기본 모터 신경 (lvn)의 섹션 주위에 내장되어 있습니다 ). </li><li> 이 스테인레스 스틸 와이어 전극 중 하나가 다른 하나는 기준 전극으로 목욕에,이 구획에 있습니다. </li><li> 차동 신호는 기록 여과 및 교류 차동 증폭기 (Univ. 카이저슬라우테른, 독일)와 증폭됩니다. </li><li> 신경절의 모터 활동은 오실로 스코프를 (DL708E, 요코, 도쿄, 일본)를 사용하여 모니터링하고 추가로 데이터 수집 보드 (CED 전원, 1401, 캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국)와 스파이크 2 v6.10를 사용하여 기록됩니다 소프트웨어 (캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국). 파일 스파이크 2 v6.10 (캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국)을 사용하여 분석하고 있습니다. </li></ol> 2. 다이 솔루션의 준비 우리는 긍정적인 전류 펄스를 사용하여 microelectrodes을 통해 염료의 로딩을 용이 이중 긍정적인 요금을 가지고있는 형광 전압에 민감한 염료 디 - 8 - ANEPPQ (Bioscience 캠브리지) 5를 사용. 염료 솔루션은 가능한 한 많은 빛으로부터 보호되어야합니다. 염료 솔루션은 다음과 같은 준비가되어 있습니다 : <ol><li> 염료 5 MG는 DMSO (Invitrogen) 용액에 F - 127 Pluronic의 산 1 ML과 혼합됩니다. </li><li> 녹아 염료를 포함하는 플라스틱 약병은 회전 / 시그마 Microcentrifuge 1-14의 분 (시그마, Osterode, 독일) microelectrode을 방해할 수 있습니다 큰 염료 입자를 분리하기 위해 12,000에서 20 분 centrifuged입니다. </li><li> 염색 용액의 표면에 뜨는 (톱 200 μL)이 pipettor를 사용하여 구분하고 별도의 플라스틱 약병에 저장됩니다. 두 튜브는 빛에 노출을 방지하기 위해 알루미늄 호일에 싸여있다. </li><li> 염료 솔루션은 -20 ° C.에 멈춰버립니다 </li><li> 전에 염료 솔루션을 사용 10-15분에 대한 따뜻한 (25 ° C) 물 속에 폐쇄 및 포장 병을 배치하여 녹아있다. </li></ol> 3. 샤프 Microelectrodes를 사용하여 세포 주입에 의한 염료 중 우리는 염색과 뉴런을 로드할 수 날카로운 microelectrodes를 사용합니다. 우리가 MiCAM02 이미징 시스템 (SciMedia, 도쿄, 일본) 6을 사용하는 염료 로딩을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 이미징 시스템을 두 개의 CCD 카메라를 가지고 : HR 카메라는 1.4 MS되고있는 최고의 시간적 해상도를 가진 더 나은 공간 해상도를 제공하는 큰 센서 칩 (6.4 mm X 4.8 mm)를 가지고, HS 카메라는 작은 (2.9 mm에게 X 2.1 mm)를 가지고 있지만 최선의 시간적 해상도 0.7 MS를 가지고 빠르게 영상을 허용 빠른 센서 칩. 염료 로딩의 단계는 다음과 같습니다 : <ol><li> Microelectrodes이 함께 가져온하는 P - 97 플라밍 - 브라운 (셔터 인 스트 루먼트, 노바토, CA, 미국) 길이 10cm를 사용하여 전극 풀러, 필라멘트 (GB100TF 8P, 과학 제품, Hofheim, 독일)와 1mm 외경 유리 튜브. 전극의 저항을 가지고 행진25 범위 - 3M KCl 40 MOhm (해당 당기 매개 변수 설정이 전극 풀러의 제조 업체에서 제공하는 피펫의 요리책을 따르십 경우). </li><li> 냉동 염료 솔루션은 용융하고 그것의 매우 작은 금액은 microfil 바늘 (MicroFil - 34G, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국) -로 빨아 빨아 염료가 microfil 바늘의 2 / 3 차 주위를 채우고 . </li><li> microfil 니들의 염료 솔루션은 microelectrode의 일각에 주입합니다. microelectrode은 15 분 동안 어두운 상자에 배치됩니다. </li><li> microelectrode는 3M KCl 솔루션 backfilled입니다. 전극은 다음 microelectrode의 행동 모세관 힘의 흡입에 의한 전극의 좋은 팁을에 도달하기 위해 염료 솔루션을 수 있도록 다른 10-20분에 대한 어두운 전극 보관 상자에 다시 배치됩니다. </li><li> 준비 microelectrode는 전극 홀더에 위치하고 세포내 앰프의 headstage (IA - 251A, 워너 인 스트 루먼트 주식 회사, 햄든, CT, 미국)에 고정됩니다. </li><li> 세포 증폭기는 microelectrode로 현재 펄스를 운전하는 펄스 신호를 제공하는 데이터 수집 보드에 연결됩니다. </li><li> microelectrode는 microelectrode의 속이는 사람을 (PatchStar, Scientifica (주), 어크필드, 영국)를 사용하여 STG 신경 세포의 세포막에 부드럽게 배치됩니다. 10X 목적의 작동 거리 (UMPLFL10XW, NA 0.30, WD 3.3mm, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본) 이후 이미징 현미경은 아주 작은이고, microelectrode는 경사 위치에 위치 (30 ° 정도)과 운동해야 오른쪽 위치로 microelectrode의 현미경 목표의 다시 초점을 microelectrode 이동의 여러 단계가 필요합니다. microelectrode를 시작하려면은 그 끝은 STG 위에 그러한 위치에 이동합니다. 전극 팁 초점이 나타날 때까지 현미경 목표가가 낮아됩니다. 그렇다면 그것은 더욱 저하하지만 microelectrode을 만지는만큼 않습니다. 그것은 목표의 초점을 다시 나타날 때까지 microelectrode이 저하됩니다. 뉴런이 목표의 초점 평면에 명확하게 나타날 때까지이 단계를 반복합니다. 그것이 만지는하고 부드럽게 선택한 STG의 신경 세포의 세포막을 피어 때까지 microelectrode이 저하됩니다. 이것은 오실로 스코프를 사용하여 모니터링할 수 있습니다. </li><li> 세포내 전극은 그 활동을 프로필과 활동 및 세포 전극 2,3,7에서 기록된 STG 활동 사이의 관계를 주어진 신경 세포를 식별하기 위해 선택한 STG의 신경 세포의 활동을 기록하는 데 사용됩니다. </li><li> 세포 증폭기는 현재 분사 모드로 전환합니다 1 초 동안 마지막으로이 microelectrode로 현재는 주입과 일초 간격으로 구분되는 microelectrode에 긍정적인 현재 단계 NA 10 주입 30 분 동안 사용됩니다. 기록된 신경 세포에 주입 전류 드라이브 적극적으로 청구 염료 분자. 장비를 사용할 경우 여러 개의 뉴런이 동시에 주입 수 있습니다. </li><li> 사출 기간에 및 사출의 종료 후 10 분 신경 세포 내에 염료의 확산을 확인합니다. 필터 큐브 MSWG2을 통해 (와,이 작업을 수행하기 위해 우리는 초저 파급 할로겐 광원 (Moritex, 도쿄, 일본 HL - 151)에 의해 10X 객관적이고 조명과 MiCAM02 이미징 시스템 (SciMedia 주, 도쿄, 일본)을 사용 480-550 nm의 여기 필터, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본). 이미징 시스템은 192 X 128 픽셀 해상도, 40 MS 이미징 시간 'hbin'모드, 그리고 이미지 세션 당 10 프레임으로 HR 카메라를 사용하도록 설정되어 있습니다. 염색 작성에 성공하면 영상이 microelectrode의 위치 주변의 신경 세포의 염색 패치를 표시해야하고,이 염색 패치 10 분 후 30 분 후에 촬영한 이미지 사이에 성장한다. 염료의 확산은 30 분 후에 부족한 경우 더 주입 시간이 부여됩니다. 또한, 새로운 염료 전극을 사용할 수 있습니다. </li><li> 전극이 신경 세포에서 철수되고 신경 세포는 적어도 20~30분 기분 전환을 위해서 남아 있습니다. 이 시간 이내에 다음 신경 세포가 색소를 주입 수 있습니다. </li></ol> 4. 염색 뉴런의 이미징 단일 뉴런의 활동은 염료 작성 절차 후 몇 군데 있습니다. 또는 두 개 이상의 뉴런이 이미지를 여러 STG의 뉴런의 동시 활동을 가득 수 있습니다. 원칙적으로 많은 그리고 아마도 모든 STG 뉴런은 염료로 가득 수 있습니다. 뉴런의 이미지는 HR 카메라를 사용하여 MiCAM 02 이미징 시스템으로 이루어집니다. 다음과 같이 이미지의 절차는 다음과 같습니다 <ol><li> 현미경 목표가 변경되고 높은 광 전송 효율 20x 목적 (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본)은 이미징 데이터 수집에 사용됩니다. 이 목표는 또한 10X 객관적이고이 뉴런의 상세한 이미지를 제공하는 높은 배율을 제공 것이 훨씬 더 빛을 수집합니다. 바인 염료 로딩의 소량이 이미 우리가 염료에 의해 뉴런으로 인해 발생할 수 있습니다 잠재적인 사진 손상을 줄일 수 이미징에 대한 낮은 빛의 강도를 사용할 수 또한이 목표와 함께 볼 수 있다고 g 불이 더 효율적인 것을 의미합니다. </li><li> 현미경의 운영 단계는 몇 군데가 의미하는 뉴런의 목적의보기의 분야에 있고 목표가 그들에 초점을 맞추고 있습니다 그러한 위치입니다. </li><li> 세포외 녹음 데이터는 또한 아날로그 입력 채널을 통해 MiCAM 02 이미징 시스템으로 공급됩니다. 이것은 분석 단계에서 광학 신호와 대응하는 모터 패턴이나 extracellularly 기록 스파이크의 관련된 비교적 쉽게 사용할 수 있습니다. </li><li> MiCAM 02 시스템은 2.2 MS 이미징 시간 1.5 MS 이미징 시간 48 X 32 픽셀 해상도를 가진 96 X 64 픽셀 해상도를 사용하도록 설정되어 있습니다. 뉴런의 염색이 매우 강한되지 않은 경우 두 가지 경우 모두에서 'hbin'설정을 사용할 수 있습니다. </li><li> 가벼운 수준은 사진 변조와 기록 뉴런의 사진 손상을 방지하려면 (뉴런에있는 색소 즉, 여전히 이미징에 대한 충분한 형광을 생성한다) 가능한 한 낮게 설정되어 있습니다. </li><li> 실내 조명 및 모든 나머지 광원이 꺼져 있습니다. 또한, 검은 커튼이 외부 소스에서 빛의 노출을 방지하기 위해 녹음 장비 주위 닫힙니다 수 있습니다. </li><li> 길이 16초 - 이미지 세션 4 사이로 설정되어 있습니다. </li><li> 염색 뉴런의 자발적인 활동은 여러 이미지 세션을 통해 기록됩니다. </li></ol> 5. 광학 이미징 데이터 분석 MiCAM 02 이미징 시스템과 관련, 영상 자료를 분석하기 위해 우리는 BVAna 소프트웨어 (SciMedia 주, 도쿄, 일본 버전 10.08)을 사용합니다. 소프트웨어는 이미지 데이터의 시각화를 지원하고뿐만 아니라 분석 도구의 범위를 제공합니다. 데이터 분석 및 해석의 단계는 다음과 같습니다 : <ol><li> 관심 적절한 원형 지역은 각각 기록 뉴런에서 선택됩니다. 일반적으로 우리는 2를 사용 - 48 X 32 픽셀 해상도 뉴런, 그리고 6 조사에 대한 관심을 3 픽셀 반경 지역 - 96 X 64 해상도에서 뉴런을 조사에 대한 관심의 8 픽셀 반경의 지역. </li><li> 데이터의 시간적 스무딩는 염료가 데이터에 형광 (낮은 배경 가치의 상대적으로 낮은 금액을 생성 이것을 나타냅니다 특히, 필요할 수 있습니다, 그것은 사용하는 낮은 조명 수준 또는 낮은 수준의 염색 로딩 원인일 수 있습니다, 예를 들어 기록된 신경 세포의 neurite에서). 일반적으로 이러한 경우에 우리는 3 관자놀이 케어를 사용 - 5 시간 단위. </li><li> 광학 녹음 이외에 우리는 이미징 시스템의 아날로그 입력을 표시하는 선택하여 세포 녹음을 표시합니다. </li><li> 광학 데이터와 아날로그 입력의 시각화에 대한 매개 변수는 컴퓨터 화면에 표시되는 모든 레코딩을 볼 수 있도록 적절하게 설정해야합니다. </li><li> 뉴런, lvn에서 세포외 기록, 그리고 이전 세포내 기록을 바탕으로 신경 세포의 분류 광학 녹음 고려, 이것은 신경 세포의 신원을 확인하고에서 기록된 신경 활동의 활동을 연관 수 있습니다 신경. </li><li> 이것은 광학 녹음이 명확하게 보여줄 것으로 기대하고, 여러 개의 유사한 이벤트, extracellularly 기록 스파이크와 또 다른 뉴런의 활동에 의해 발생 억제 후 시냅스 후보로 subthreshold 이벤트에 해당하는 신경 활동을 통해 평균의 필요없이. 것입니다 </li><li> BVAna 소프트웨어의 데이터 내보내기 기능은 관심이 선택한 지역과 또한 lvn에서 녹음을 포함하고있는 아날로그 입력에 대한 계산 광학 녹음을 수출하는 데 사용할 수 있습니다. 내보낸 데이터 처리 및 추가 다른 데이터 분석 소프트웨어뿐만 아니라 (가장 간단한 경우는 예를 들어 Microsoft Excel에서이 (마이크로 소프트, 레드 몬드, WA, 미국) 추가 시각화 및 데이터 처리를 위해 사용될 수있다)를 사용하여 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 lvn의 기록과 함께 STG 게의 pyloric 중앙 패턴 발생기에, 그림 2는 두 뉴런 (PD, pyloric 확장시키는 신경 세포 LP, 측면 pyloric 신경 세포)의 동시 녹음을 보여줍니다. 그들의 세포 기록을 바탕으로 식별 LP와 PD 뉴런의 광학 녹음이 표시되는 LP와 PD 뉴런에 해당하는 세포 레코딩 잘 실제로이 일치합니다. 신경절 및 세포외 기록 사이트 간의 axonal 전송 지연으로 인해 스파이크 봉우리의 광학 및 lvn 녹음 사이의 일관성 12 MS의 지연 (그림 2 삽입된 페이지 참조)이 있습니다. 발표 자료는 또한 기록 뉴런의 스파이크에 해당하는 소마의 신경 활동이 명확하게 감지할 수있다는 것을 보여줍니다. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "고도는 ="그림 1 "/&gt; 그림 1. stomatogastric 신경계 (STNS)의) 도식 다이어그램. 코그, commissural 신경절, OG, 식도 신경절, STG, stomatogastric 신경절, 미역, stomatogastric 신경, lvn, 측면 심실 신경. B) 게 stomatogastric 신경절 (STG) - 이미지 STG 뉴런의 반원의 사후 배치를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 함께 lvn의 기록과 동시 PD의 단일 스위프 기록 및 LP 신경 세포. 데이터는 광학 및 신경 녹음 잘 일치하고 우리가 신경을 형성 기록 스파이크에 해당하는 신경 활동을 확인할 수 보여줍니다. 광학 및 전기 기록된 활동 사이의 일치를 보여주는 그들의 평균 - 모두 광학 및 전기 기록 - 삽입된 페이지는 LP 액션 잠재력 여러 감시 장치의 오버레이를 보여줍니다. 우리의 광학 녹음 방식은 우리도 PD와 LP 뉴런 14 특성 느린 막 잠재적인 변경 사항을 기록할 수있는 데이터의 낮은 주파수 구성 요소를 필터링하지 않는다는 사실 때문에.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전통적인 전기 생리학 방식 (내부 및 세포외 전극 녹음)와 함께 신경을 STG의 전압에 민감한 염료 영상 8,9 어떻게이 작은, 잘 알려진 여전히 복잡한 신경 시스템 작동의 향상된 이해를하실 수 있습니다. STG는 중앙 패턴 발생기 (CPG)의 연결을 네트워크 10, 11, 따라서 STG의 응급 기능적 특성에 대한 이해도 방법을 일반적으로 이해하기 위해 도움이 될 것입니다 (이것은 pyloric 및 위장 밀 리듬 네트워크를 포함)의 프로토 타입입니다 CPG 네트워크는 네트워크 수준의 기능을 생성합니다. CPG 네트워크 또한 높은인지 기능 13 모터 제어 12 중요한 역할을, 따라서 그들의 응급 속성의 이해는 신경 과학의 여러 분야에서 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MiCAM02</td><td>사이미디어</td><td></td><td>이미징 시스템</td></tr><tr><td>BVAna v.10.08</td><td>사이미디어</td><td></td><td>MiCAM 02 이미징 시스템용 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>HL-151</td><td>Moritex, 일본 도쿄</td><td></td><td>초저리플 할로겐 광원</td></tr><tr><td>BX51 작업 지침서</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>에피형광 이미징용 정립 현미경</td></tr><tr><td>20배 배율 이미징 대물렌즈 </td><td>Olympus Corporation</td><td>XLUMPLFL20XW/0.95</td><td>NA 0.95, WD 2.0mm</td></tr><tr><td>10배 배율 이미징 대물렌즈 </td><td>Olympus Corporation</td><td>UMPLFL10XW</td><td>NA 0.30, WD 3.3mm</td></tr><tr><td>480-550 nm 여기 필터 및 590 nm 방출 필터가 포함된 필터 큐브 </td><td>Olympus Corporation</td><td>MSWG2</td><td></td></tr><tr><td>제진대</td><td>Scientifica Ltd</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>PatchStar 전극 조작기</td><td>Scientifica Ltd</td><td>PS-7000C</td><td>미세전극 조작기</td></tr><tr><td>CED Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>데이터 수집 보드</td></tr><tr><td>DL708E 오실로스코프</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>세포 내 증폭기</td></tr><tr><td>AC 차동 증폭기</td><td>독일 카이저슬라우테른 대학교</td><td></td><td>세포 외 증폭기</td></tr><tr><td>P-97 플래밍 &amp;#8211; 브라운 타입 전극 추출기</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>전극 인입기</td></tr><tr><td>Sigma 마이크로원심분리기 1-14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>Genex Pipettors Mline</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP7774</td><td>PIP7774</td></tr><tr><td>필라멘트가 포함된 유리 마이크로피펫</td><td>과학 제품</td><td>GB100TF 8P</td><td>마이크로슬라이드용 유리&amp;#8211;전극</td></tr><tr><td>마이크로필(MicroFil) &amp;#8211; 34G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Microfil 바늘</td></tr><tr><td>Spike 2 v6.10</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>전기생리학 소프트웨어</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPQ</td><td>Cambridge BioScience</td><td>BT61014</td><td>형광 전압 민감성 염료</td></tr><tr><td>F-127 플루로닉산, DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>용매</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>게 전용 식염수 성분</td></tr><tr><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>게 전용 식염수 성분</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>게 염수 성분, 전해질 용액</td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>게 염수 성분</td></tr><tr><td>Trizma 염기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>게 전용 식염수 성분</td></tr><tr><td>말레산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>게 염수 성분</td></tr><tr><td>Elastosil RT-601</td><td>Wacker, 독일 뮌헨</td><td></td><td>페트리 접시 코팅</td></tr></tbody></table>

전압에 민감한 염료와 크랩 stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

뉴런의 전압에 민감한 염료 영상은 네트워크의 연결을 구성하는 방법에 대한 이해를위한 주요 방법이며 어떻게 참여 뉴런의 동시 활동이 네트워크의 핵심 기능의 출현에 이르게한다. 여기서 우리는 게 stomatogastric 신경절에서 확인된 패턴 생성 뉴런이 기술의 응용 프로그램의 방법론을 제시한다. 우리는 형광 전압에 민감한 염료 디 - 8 - ANEPPQ 이러한 뉴런의 로딩을 설명하고 어떻게 이미지 MiCAM02 고속 및 고해상도 CCD 카메라 이미징 시스템을 사용하여 염색로드 뉴런의 활동를 보여줍니다. 우리는 MiCAM02 이미징 시스템과 관련된 BVAna 이미징 소프트웨어를 사용하여 기록된 이미지 데이터의 분석을 보여줍니다. 게 stomatogastric 신경절에서 여러 뉴런의 세부 활동의 동시 전압에 민감한 염료 영상은 전통적인 전기 생리학 기법 (세포내 및 세포외 레코딩)하는 방법 중앙 패턴 발생기 신경 네트워크 작업에 대한 이해를 위해 급격하게 새로운 기회를 열어 함께 적용.

여기 게는 stomatogastric의 신경절의 뉴런에 대한 자세한 활동의​​ 신속하고 고해상도 형광 전압에 민감한 염료를 영상에 대한 방법론을 제시한다.

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

뉴런의 전압 민감성 염료 이미징은 뉴런 네트워크가 어떻게 조직되는지, 그리고 어떻게 동시다발적으로...

본 실험의 목적은 전압 민감성 염료를 사용하여 갑각류 St Somatic asterisk 신경절의 중앙 패턴 생성기 내 뉴런 간의 막 전위 변화와 시냅스 상호작용을 광학적으로 기록하는 것입니다. 이는 샤프 마이크로 전극을 이용한 이온 레티크 주입법으로 확인된 뉴런에 DD eight 및 at PQ를 로딩하고, 동시에 운동 신경 활동을 세포 외 기록으로 측정함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 전압 민감성 염료의 형광을 녹색광으로 여기시켜 세포막 전위 변화에 상응하는 형광 변화를 이미징합니다. 다음으로, 뉴런 막의 관심 영역을 선택하고 광학 신호를 기록된 세포 외 활동과 비교 분석하여 활동 전위와 시냅스 전위를 식별합니다.이미지 뉴런 결과는 시냅스로 상호작용하는 패턴 생성 뉴런의 광학적 기록이 전통적인 기록 기술을 보완할 수 있으며, 중앙 패턴 생성기 신경망의 기능 방식을 이해하는 새로운 기회를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 세포 외 및 세포 내 기록과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 염료 충전 후 전위 변화와 시냅스 상호작용의 광학적 기록이 전극 배치로 인한 입체적 제약 없이 가능하며, 장기 기록 중 뉴런에 추가적인 손상을 주지 않고 수행될 수 있다는 점입니다. 이 방법은 갑각류 위장의 위 신경절에서 일어나는 패턴 생성에 대한 추가적인 통찰을 제공할 수 있습니다.이 방법은 척추동물의 이동 및 호흡과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 D selection 주입과 준비 과정이 까다롭고, 막 전위 변화를 감지하기 위해 이미지 데이터 분석 파라미터를 적절하게 설정해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 플라스틱 바이알에 형광 염료 용액을 만드는 것으로 준비를 시작하십시오. 5 mg의 형광 전압 민감성 염료 D eight 및 FPQ를 1 mL의 DMSO 내 F1 27 onic acid 용액과 혼합합니다.다음으로, 용해된 염료를 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 마이크로 전극을 막을 수 있는 더 큰 D 입자들을 분리하기 위해, 상층액의 상위 200 µL를 흡입하여 별도의 플라스틱 바이알에 옮깁니다. 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 바이알을 알루미늄 호일로 감쌉니다.실험 당일 D 용액을 -20°C 냉동고에 보관하십시오. 랩으로 감싼 바이알을 25°C 물에 10~15분 동안 담가 염료 용액을 해동하십시오. 기록 준비를 위해 먼저 게의 STS 체성 위 신경계를 분리하고 체성 위 신경절의 외초를 제거하십시오.외측 뇌실 신경(lateral ventricular nerve, LVN)의 일부 구역 주변에 바셀린을 도포하여 전기적으로 격리된 구획을 만듭니다. 모델링 클레이를 사용하여 페트리 접시를 이미징 현미경의 조작 플랫폼에 고정합니다. LVN으로부터 신호를 기록하기 위해 바셀린 구획 내에 스테인리스강 전극 와이어를 배치하고, 기준 전극으로 사용할 또 다른 스테인리스강 전극을 배양액에 배치합니다.D 용액이 해동되면, 마이크로필 니들의 약 3분의 2를 채울 수 있을 만큼의 D 용액을 흡입합니다. 마이크로필 니들을 통해 유리 미세 전극의 팁 부분으로 D 용액을 주입합니다. 염료가 채워진 전극을 상자로 덮고 15분 동안 기다립니다.그런 다음 미세 전극을 3 M 염화칼륨 용액으로 다시 채웁니다. 모세관 현상에 의해 용액이 전극의 미세한 팁 끝까지 끌어올려질 수 있도록 미세 전극을 어두운 전극 보관함에 10~20분 동안 넣어둡니다. 10~20분 후, 미세 전극을 전극 홀더에 끼우고 이를 세포 내 증폭기의 헤드 스테이지에 연결합니다.세포 내 증폭기를 데이터 수집 보드에 연결하며, 이 보드는 미세 전극으로 전류 펄스를 보내기 위한 펄스 신호를 제공합니다. 다음으로, 미세 전극을 사선 각도로 조절하고 팁을 체성 위 신경절 위에 위치시킵니다. 전극 팁에 초점이 맞을 때까지 현미경 대물렌즈를 내립니다.그런 다음 마이크로 전극에 닿기 전에 멈추도록 주의하며 대물렌즈를 내립니다. 그 후 마이크로 전극이 다시 보일 때까지 전극을 내립니다. 오실로스코프로 진행 상황을 모니터링하며 대물렌즈의 초점 범위 내에서 선택한 체성 위 신경절 뉴런의 세포막을 조심스럽게 관통합니다.이 단계에서 세포 내 및 세포 외에서 기록된 활동 전위를 비교하십시오. 삽입된 뉴런을 식별하기 위해, 세포 내 앰플리파이어를 전류 주입 모드로 전환하고 미세 전극에 10 nA의 양성 전류 단계를 주입하여 염료 주입을 시작하십시오. 전류 단계는 1초 동안 지속되어야 하며, 전류가 흐르지 않는 1초의 간격으로 구분되어야 합니다.현재의 주입을 30분 동안 계속합니다. 염료 주입 10분 후에 MYCA zero two 이미징 시스템을 사용하여 뉴런 내의 염료 확산을 확인합니다. 30분 후에도 이 과정을 반복하여 확인합니다.염료 충전이 성공적이라면, 10분 후와 30분 후의 이미지 사이에서 미세 전극 주변의 염색된 영역이 확장되어야 합니다. 뉴런에서 전극을 뽑아내고, 염료가 세포 내로 더 퍼질 수 있도록 뉴런을 최소 20분에서 30분 동안 안정시킵니다. 이 시간 동안 다른 뉴런에 염료를 주입할 수 있습니다.MYAM zero two 이미징 시스템의 투과 효율이 높은 20배 대물렌즈로 교체하십시오. 필요에 따라 현미경의 작동 스테이지 위치를 조정한 후, D 필드 뉴런에 초점을 맞추십시오. 아날로그 입력 채널을 통해 세포 외 기록 데이터를 이미징 시스템으로 전송하십시오.실내 조명과 나머지 모든 광원을 끕니다. 또한, 외부 광원으로부터의 빛 노출을 방지하기 위해 기록 장치 주변의 검은색 커튼을 닫습니다. 이미징 시스템을 도표에 표시된 적절한 픽셀 해상도와 이미징 시간으로 설정합니다.뉴런의 염색 강도가 매우 강하지 않은 경우 H 빈(bin) 설정을 사용하십시오. 기록되는 뉴런의 광변조 및 광손상을 방지하기 위해 현미경의 광량을 가능한 한 낮게 설정하십시오. 이미징 세션의 길이는 4초에서 16초 사이로 설정하십시오.그런 다음 여러 차례의 이미징 세션에 걸쳐 DY 뉴런의 자발적 활동을 기록합니다. BV A NA 이미징 소프트웨어를 사용하여 광학 응답 분석을 시작하려면, 데이터의 시간적 평활화(temporal smoothing)가 필요한 경우 기록된 각 뉴런에 적절한 원형 영역을 선택하십시오. 예를 들어, D가 상대적으로 낮은 수준의 형광을 생성하는 경우, 소프트웨어를 사용하여 3~5 시간 단위로 시간적 평활화를 적용하십시오.이 그림의 왼쪽 상단에 염료가 주입된 두 뉴런은 세포 내 기록을 근거로 PD 뉴런과 LP 뉴런으로 식별되었습니다. 오른쪽에 표시된 전압 트레이스는 각 뉴런에서 나타난 자발적 광응답을 보여줍니다. LVN의 세포 외 기록은 그림 하단에 표시되어 있습니다.LP 및 PD 뉴런은 게의 체성 위신경절에 있는 유문 중앙 패턴 생성기의 일부이며 서로 억제 관계에 있습니다. 이들의 광학 기록은 LVN의 세포외 기록과 잘 일치합니다. 하단의 삽입도는 LP 활동 전위의 여러 스윕과 그 평균을 겹쳐서 보여주며, 이는 광학적으로 기록된 활동과 전기적으로 기록된 활동 사이의 일치성을 입증합니다.이 기술을 숙달하여 적절히 수행한다면 1시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에는 면역염색과 같은 다른 방법을 수행하여, 관찰된 막 전위 변화를 유도하는 데 어떤 유형의 시냅스가 관여했는지와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 위 강글리온(stomach gastric ganglia)에서 정체 및 상호작용하는 다수의 뉴런을 광학적으로 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 염료가 조정 해상도 등 기니 돼지 장용 신경계의 plexuses으로 손상 신경망에서 전기 활동의 광학 녹음을 활성화하는 방법 전압에 민감한 개념 단일 세포에서 다중 ganglionic 회로 등을 꼽을 수 있습니다.

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

이 비디오는 전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편에서 신경 활동의 변화를 관찰하는 절차를 보여줍니다. 염료는 형광 강도를 변경하여 뉴런의 막 전위의 변화를 반영합니다. 전기 자극과 고급 이미징 기술의 적용을 통해 이 프로세스를 통해 VSD 형광을 기반으로 신경막 전위의 실시간 변화를 시각적으로 추적할 수 있습니다.

전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편의 신경 활동에 대한 광학 기록

출처: Shannonhouse, J., et al. 생체 내 온전한 배근 신경절의 1차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 형질전환 마우스의 배측근신경절(DRG)에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 생체 내 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. DRG 뉴런은 칼슘에 결합할 때 형광 강도를 증가시키는 칼슘 지표를 발현합니다. 뒷발에 가해지는 기계적 또는 열적 자극은 DRG로 전파되는 활동 전위를 생성하여 뉴런에 칼슘 유입을 유도하고 형광 방출을 증가시킵니다.

In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

여기에서는 가재의 복부 신경삭 해부에 대해 설명합니다. 우리는 또한 수영 운동 뉴런의 가상 운동을 기록하는 전기 생리학 기술을 보여줍니다.

왕새우의 Swimmeret 시스템 : 신경 코드 및 모터 패턴의 세포 외 녹음의 해부를위한 실무 가이드

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다.

칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.

비 트랜스제닉 무척추 동물의 단일 신경 해상도를 가진 네트워크 역학을 기록하기위한 포토다이오드 기반 광학 이미징

여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

배우세요 전압에 민감한 염료를 이용한 광학 기록법으로 게의 위장신경절에서 뉴런 활동과 시냅스 상호작용을 실시간으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 중추 패턴 생성기의 신경망 역학 연구에 활용됩니다.

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

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