Name: 사전 이식 유전자 진단 생선 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 학습하세요 형광 원위치 하이브리다이제이션(FISH) 기법을 이용한 인간 배아 단일세포 생검 및 핵 분석 방법입니다. 이 기술은 사전 이식 유전자 진단(PGD)에서 염색체 이상을 정확히 식별하여 생식 의학 연구에 활용됩니다.

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1. Lysing 및 Biopsied Blastomere에서 핵 스프 레딩 <ol><li> 확산 셀 (0.01 M HCL의 0.2 % Tween20, 산도 2.0)에 대한 세포 용해 버퍼는 사전에 24 시간 준비하고 -20 ° C.에 보관해야 멸균 20 ML의 주사기와 주사기 필터를 사용하여 30 ML 살균 보편적인 컨테이너로 100 ML 및 필터 20 ML을 준비합니다. 10-15 1.7 ML 살균 microcentrifuge 튜브에 1 ML aliquots 하는걸 닫기 사전 동결에 튜브 라벨. 이것은 새로운 배치가 만족스럽지 않은 경우 테스트되었으며 사용할 수있는 사용하는 것입니다 두 개의 다른 배치, 새로운 배치하고 이전 배치를하도록 권장합니다. </li><li> 서리를 없애다 30 분쯤 생검 절차 전에 상온에서 용해 버퍼. 실용적인 목적을 위해 작동 온도가 실내 온도와 손 온도 사이 여야합니다. </li><li> 다이아몬드 펜 및 Pre - 라벨 사건 번호, 고유 슬라이드 번호 및 생검 날짜와 슬라이드를 사용하여 아민 - 코팅 슬라이드 (예 : Genetix)의 아래쪽에 작은 원을 (약 5mm 직경) 점수. 별도의 숫자 순서대로 각 blastomere에 대한 슬라이드 및 배아 번호 라벨을 사용합니다. 슬라이드는 같은 4H로 열심히 연필로 표시하고, 모든 흑연 먼지를 제거하는 라텍스 장갑과 함께 "blotted"해야합니다. </li><li> 원 안에 용해 버퍼의 작은 볼륨을 넣으십시오. </li><li> 용해 버퍼에 biopsied blastomere을 전송합니다. 셀 lyse 시작할 때까지 필요한 동그라미 안에 용해 버퍼를 추가하는 경우, 전지가 완전히 lyse해야하며 세포질은 버퍼 증발하기 전에 분산. </li><li> 그것은 원 안에 남아 손실되지 않도록하기 위해 핵을 관찰, 세포는 핵을 가지고 또는 여러 개의 핵을 가지고하지 않는 경우, 다른 세포를 생검. </li><li> 상온에서 공기 건조에 슬라이드를 둡니다. </li></ol> 2. 단일 Blastomere 핵의 원위치 하이브리드화에서 <ol><li> 멸균 증류수에 만든 에탄올 시리즈 (70, 90 및 100 %) 준비합니다. </li><li> 전원을 켜고 75 핫 블록 (예 : Hybaid Omnislide 또는 Vysis Hybrite)을 설정 ° C. </li><li> 서리를 없애다 프로브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기. 시약은 목격하고 프로브 혼합물을하기 전에 정확하게 확인해야합니다. 피펫 0.65 ML 살균 microcentrifuge 관 및 사용하기 전에 와동과 원심 분리기에 프로브 혼합물을 만들기 위해 제조 업체가 지정한 볼륨. 프로브 혼합물의 총 부피는 핵 당 2 μL를 테스트하고 안전 마진을 허용하는 가장 가까운 10 μL로 반올림 수 있도록 충분해야합니다. </li><li> 상온에서 5 분. : 사용 인산염 버퍼 호수 (PBS) (0.14 M NaCl, 3 MM KCl, 10 MM 나 2 HPO 4 2 MM KH 2 PO 4 산도 7.0) 코플린 단지에있는 슬라이드를 미리 씻어 </li><li> 멸균 증류수에 두 슬라이드를 씻어. </li><li> 실내 온도와 공기 건조 2 분 각 에탄올 시리즈 (70, 90, 및 100 %)으로 슬라이드를 탈수. 확인 슬라이드 완전히 포장되어 및 흑연 먼지가 표면에 떠다니는 경우, 깨끗한 휴지로 흠뻑 젖어 있습니다. </li><li> 위상 콘트라스트 현미경으로 시각화하여 원 안에 핵의 위치를​​ 기록합니다. </li><li> 실내 온도와 공기 건조 2 분 100 % 에탄올로 탈수. </li><li> 프로브 혼합물 2 μL를 적용하고, 9 X 9mm coverslip (18 X 18mm 제일 coverslip의 사분의 일)으로 커버. </li><li> 고무 시멘트 (; 코 교정 예 코 껌)와 coverslip의 가장자리를 밀봉합니다. </li><li> 75 뜨거운 블록에 슬라이드를 Codenature ° 후 5 분 C 및 37에서 humidified 챔버에서 (16-20 H) 하룻밤 사이에 슬라이드를 잡종 ° C. centromere 프로브 (섹스 연결된 경우에 IE)의 전체로 구성 프로브 혼합은 하이브리드화 60 분 후에 만​​족스러운 결과를 줄 것이다. </li><li> 71 충분한 코플린 단지와 열 ° C.있는 물 목욕 준비 </li><li> 0.4x 표준 호수 구연 산염 (SSC) 엄격한 세척 솔루션 (71시 산도 7.0 ° C, 0.06 M NaCl, 6 MM C 6 H 5 나 3 O 7 0.2 H 2 O)과 물 목욕으로 더위를 준비합니다. </li><li> 필요한 코플린 항아리마다 엄격한 씻어 50 ML 하는걸하고 온도가 71되었는지 확인 ° C 즉시 깨끗한 온도계를 사용하여 사용하기 전에. </li><li> 조심스럽게 각 슬라이드에서 고무 시멘트를 제거하고 실온에서 4X SSC/0.05 % Tween20 (산도 7.0)를 사용하여 coverslip을 씻어. </li><li> 71에서 0.4x SSC 엄격한 세척에 슬라이드를 씻어 ° C를 5 분. 코플린 병 당 6 개 이상의 슬라이드도 씻으십시오 없습니다. </li><li> 2 분 실온에서 4X SSC/0.05 %의 Tween20에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 프로브 믹스가 간접적으로 표시된 프로브 (S)를 포함하는 경우, 초과 액체의 슬라이드를 분출과 Parafilm의 20 X 20mm 광장 아래의 찬란 복합 항체의 20 μL를 적용합니다. </li><li> 37 humidified 챔버에 품어 ° C를 15 분. </li><li> Parafilm를 제거 2 분 실온에서 한번 4X SSC/0.05 %의 Tween20에 씻으십시오. </li><li> PBS 2 분 두 번 씻어t 룸 온도와 슬라이드를 물기. </li><li> 아니 22 X 22mm에 DAPI / Vectashield (4 160 NG 'Vectashield 설치 매체 벡터 연구소 1 ML에서, 6 diamidino - 2 - phenylindole dihydrochloride) 6 μL을 적용합니다. 0 coverslip 및 coverslip 위에 슬라이드를 반전. </li><li> 얼룩과 맑은 손톱 바니와 coverslip의 가장자리를 밀봉. </li></ol> 3. 형광 현미경을 사용하여 분석 적절한 사용 프로브에 대한 적절한 필터를 탑재. <ol><li> 형광 현미경 및 분석의 각 fluorochrome 단일 대역 통과 필터를 사용하여 직접 시각화하여 점수 신호. 각 핵은 두 분석가에 의해 득점해야합니다. 일반적인 지침은 두 붙어있는 신호가 떨어져 미만 도메인 (신호 폭)하는 단일 신호의 점수로 연결되어야하지만, 경험을 바탕으로 판단 크기, 강도를 변화의 신호와 분리를 해석하는 행사해야합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어 (예 : 이시스, MetaSystems, Altlussheim, 독일, CytoVision, Genetix)를 사용하여 영상 진단의 확인에 대한 핵의 이미지를 캡처하고, 실험실 품질 보증 계획의 일환으로 아카이빙 이미지. </li></ol> 4. 대표 결과 : Metaphase 및 교양 말초혈 lymphocytes에서 계면 핵이 선택한 프로브는 중단점 (subtelomere 프로브의 중심에 translocated 세그먼트와 centromere 프로브 (S)에만 잡종을해야합니다에 대한 유익한 정보, translocation 염색체 특정되었는지 확인하기 위해 검사해야합니다 세그먼트 (S)) 및 계면 핵의 신호는 밝고 이산해야합니다. 각 파트너에서 100 계면 핵의 각 프로브에 대한 신호의 숫자를 채점하는 것은 분석의 효율성을 평가하는 것이 좋습니다. 이 경우 2 신호 95% 각 프로브에 대한 핵의 -99 %에 득점했다. 그림 1은 염색체 5 ~ 9의 짧은 팔 사이에 상호 translocation을위한 준비에서 metaphase 및 계면 핵을 보여줍니다. 배아 blastomeres에서 계면 핵으로 신호는 밝고 이산하고 사용되는 색상에 대한 별도의 밴드 패스 필터를 사용 득점해야합니다. 그림 2는 염색체 5 9 정상 또는 균형 염색체 보완과 일치 정상적인 신호 패턴 (테스트의 모든 loci 2 부), 그리고 translocation의 불균형 제품과 함께 일관성있는 비정상적인 신호 패턴과 함께 핵을 가진 blastomere 핵을 보여줍니다 그 염색체 5 염색체 9​​ translocated 세그먼트에 대한 trisomy (3 부)의 translocated 세그먼트에 대한 monosomy (한 사본)을하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 metaphase 확산과 짧은 염색체 5 무기와 5p14.3과 9p24.1에 중단점 9 사이의 상호 translocation의 이동 통신사에서 교양 말초 혈액 lymphocytes에서 준비 계면 핵 :. 46, XY는, T (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) 봐야죠 t (5; 9) (5ptel48 -, 9ptel30 +; 9ptel30 -, 5ptel48 +, 9cen +). 생선 프로브는 모두 translocated 세그먼트에 대한 선정 (5p14.3 → 5pter, 빨강 Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, 녹색 Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC)와 염색체 9​​ 중심의 세그먼트 (9p24.1 → 9qter, 푸른 애보트 CEP 9 알파 위성 SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 일 - 3 배아에서 계면 blastomere의 핵 그림 2. 신호는 각 fluorochrome와 합성 이미지를 형성 합병에 다른 필터를 사용하여 캡처. (A) translocation 염색체의 정상 또는 균형 보완과 일치 각 로커스, 두 개의 복사본을 나타내는 각 프로브에 대한 두 신호. (B) 하나의 빨간색 신호 세 녹색 신호와 염색체 5 translocated 세그먼트의 복사본 하나, 인접과 일치 염색체 9​​ translocated 세그먼트의 세 사본과 염색체 9​​의 중심 세그먼트의 두 복사본을 나타내는 두 청색 신호 9p24.1 → 9pter에 대한 5p14.3 → 5pter 및 trisomy에 대한 monosomy과 불균형 제품에 발생하는 translocation -1 분리.

<ol><li>Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+translocations%3A+segregation+modes+and+strategies+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis.</a> Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).</li>
<li>Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+of+human+preimplantation+embryos+in+two+hours+using+an+improved+spreading+method+and+fluorescent+in+situ+hybridisation+using+directly+labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes.</a> Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).</li>
<li>Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+major+chromosome+aneuploidies+in+human+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.</a> Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).</li>
<li>Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy%3A+theoretical+models+for+preimplantation+genetic+testing+of+a+single+nucleus+using+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.+Hum+Reprod%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod.</a> Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).</li>
<li>Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+preparation+of+preimplantation+embryo+interphase+nuclei+for+analysis+by+fluorescence+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).</li>
<li>Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fixation+technique+for+fluorescence+in+situ+hybridization+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis.</a> Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).</li>
<li>Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+polymorphisms+of+1%2C+9%2C+16%2C+and+Y+in+4+major+ethnic+groups%3A+a+large+prenatal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study.</a> Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).</li>
<li>Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+variants+with+D15Z1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Genet.+Technol%22%5BJournal%5D)">FISH variants with D15Z1.</a> J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).</li>
<li>Knight, S. J., Flint, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+endings%3A+a+review+of+subtelomeric+probes+and+their+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis.</a> J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).</li>
<li>Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium+%28PGS%29+ESHRE+PGD+Consortium+%27Best+practice+guidelines+for+clinical+preimplantation+genetic+diagnosis+%28PGD%29+and+preimplantation+genetic+screening+%28PGS%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.</a> Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).</li>
<li>Munné, S., Wells, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+requirements+for+preimplantation+genetic+diagnosis+to+improve+assisted+reproduction+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes.</a> Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).</li>
<li>Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+after+preimplantation+confirmation+of+euploidy+by+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization.</a> N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).</li>
<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
<li>Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyomapping%2C+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li>
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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

하나의 배아 세포 (blastomere)에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광의 응용 프로그램 practicalities 및 신호 패턴의 해석에 모두 특별한 도전을 선물한다. biopsied 세포는 현지화 다음 물고기를 촉진하기 위해 슬라이드에 사전 정의된 영역 내에서 전파해야, 극단적인 치료는 세포는 세포질이 분산되었다는, lysed입니다 확보에 주의할 필요하고, 그 핵 진단이 단일 셀, 엄격한 채점과 해석 지침이 적용되어야의 결과에 따라로서, 그리고, 보이는 그대로입니다. 그러나, 경험 손으로, 물고기는 임상 연습에 미리 주입 유전자 진단 (PGD)를위한 강력한 기법입니다. 물고기에 의해 PGD의 원리는 다른 fluorochromes 또는 haptens으로 표시 대상 특정 DNA 프로브는 특정 loci의 사본 번호를 검색하는 데 사용할 수있는 것이 있으며, 따라서 Robertsonian 포함한 염색체 rearrangements의 meiotic 분리 (1)과 관련된 염색체 불균형을 감지하는 translocations, 상호 translocations, 뒤집어, 복잡한 rearrangements (2). 생선도 더 돌연변이 특정 시험 (3, 4)가없는있는, X - 연결된 질환으로 가정에서 여성의 배아를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 더 controversially, 생선도 도움을 재생산 (5, 6)의 효율성을 시도하고 개선하기 위해 산발적 염색체 aneuploidy을위한 화면으로 사용되었습니다 있지만, FSIH를 사용하여이 테스트의 예측 가치에 unacceptably 낮은 될 가능성이 높습니다 대부분의 사람들이 손과 그것은 일상적인 임상 사용 (7)하지 않는 것이 좋습니다. 이 문서는 임상 단일 세포 진단에 적용 물고기의 기술적 측면과 한계에 중점을두고 있습니다. 단일 blastomeres을 전파하고 고칠 수있는 방법은 메탄올 / 초산 (5, 8), 트윈 / HCL (9), 그리고 트윈 / HCL과 메탄올 / 초산 (10)의 조합을 포함합니다. 유사 이전에 고정 후 및 / 또는 펩신과 paraformaldehyde 치료 확산에 셀 hypotonic 치료를 포함합니다. 방법을 적절히 실험실 (14)에 대한 검증해야합니다. 트윈 / HCL 방법은이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 트윈 / HCL 방법은 다른 실험실에서 기술적으로 단순하고 고도로 재현할 수 있습니다. 이 방법은 허용 진단 정확도 (7) 섹스 결정 및 염색체 rearrangements의 생선 진단을위한 단일 핵을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 프로브의 혼합은 다른 제조 업체의 프로브와 프로브를 직접 표시하고 간접적으로 표시 결합할 수 있습니다. 생식 파트너 모두에서 사전에 테스트하여 PGD에 대한 구체적이고 적합으로 표시하는 경우 사용할 수 있지만 알려진 다형성 염색체 영역에 대한 프로브 (11, 12), 또는 다른 염색체 (13)와 함께 상당히 상호 잡종으로 알려진 사람은 피해야한다 . 차별 프로브를 사용할 수 fluorochromes / haptens과 전략은 다음과 같습니다 텍사스 레드 (TR), 플루오레신 isothiocyanate (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, TR - 아비딘로 검색 biotinylated 프로브, FITC - 아비딘, 또는 싸이 - 5 streptavidin (FarRed 필터를 사용하여 시각), 노란색 신호, 하이브 리다이 제이션의 두 번째 라운드와) TexasRed과 SpectrumGold 필터를 사용 SpectrumOrange의 연속 캡처 만든 삼분의 일 색상을 생성하는 적색과 녹색의 프로브를 섞는다. X와 Y 염색체와 autosome 하나의 centromere 지역에 대한 구체적인 세 프로브를 포함하는 프로브 세트, 성별 결정 (14)을 권장하며 autosomal 프로브 (2N, 47 trisomy X를 구분하는 ploidy함으로써 구축하는 데 사용됩니다 , XXX)와 triploidy (3n, 69, XXX), 그리고 tetrasomy X (48, XXXX)과 tetraploidy (4N, 92, XXXX) 사이. 이 프로브 설정은 매우 낮은 다형성 비율을 가지고 시연되었으며, 따라서 전처리 작업 - 최대 생식 파트너, 전형적인 프로브는 알파 - 위성 X, Y, 18을 포함하고있는 애보트 AneuVysion 믹스는이 설정을 적용으로 설정 (14) 필요하지 않습니다. 특정 다시 정리하기위한 프로브 혼합합니다 이상적으로 염색체 불균형으로 다시 정리하기의 모든 예상 제품을 감지하는 적어도 충분한 프로브를 포함하고 있습니다. 이것이 불가 능할 경우, 프로브는 들키지 불균형 제품이 인식 임신이 아닌 실용적으로 평가하고 매우 낮은 유행이 (14) 허용 수 있습니다 가질 가능성이 어디에 있었는지 혼합. 모두 생식 파트너 교양 림프구 metaphases에서 테스트한다. 적어도 열 metaphase 확산은 프로브과 같이 다시 정리하기의 다른 세그먼트에 예상을 잡종 수 있도록 프로브 특이성, polymorphisms 및 교차 하이브 리다이 제이션에 대한 검사, 그리고 염색체 다시 정리하기 캐리어 위해해야​​합니다. 또한, 이러한 준비에서 최소한 100 계면 핵은 신호 특이성, 밝기, 그리고 discreteness (14)을 평가하기 위해 득점해야합니다. Commercial PGS 프로브 세트 사용할 수 있습니다 (예 : 애보트 MultiVysion PB 또는 PGT), 자주 개념의 제품 aneuploid 수있는 염색체를 대상으로하고, 대상 염색체 당 하나의 프로브로 구성된. 일반적으로 핵은 염색체 13, 15, 16, 18, 21, 22, 그리고 XY (14)에 대한 분석을 제공하는 추가적인 염색체를위한 탐사선과 두 번째 하이브리드화가있을 수 있습니다. 확산 및 생선 기술은 여기에 설명된를 사용하여이 테스트의 예측 가치는 대부분의 사람의 손에 unacceptably 낮은 가능성이 높습니다 그리고 그것은 일상적인 임상 사용 (7, 15)을 위해 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이러한 단일 세포에 적용 비교 게놈의 하이브 리다이 제이션 (CGH)로 기술 (2001. 윌턴 외) 모든 염색체의 사본 번호를 테스트 할 수 있으며, 단일 염기 polymorphisms의 사용 (SNP)는 배열과 정량 분석 (웰스 외 . 2008) 또는 &quot;karyomapping&quot;genotyping은 (핸디 외. 2009) 염색체 aneuploidy을 감지하는 대안 기법을 약속하고 있습니다. 그러나, 세그먼트 불균형에 대한 해결 한도와 정확도가 불확 실한 남아 그것은 물고기가 작은 세그먼트를 포함하는 염색체 rearrangements을위한 최고의 기술로 지속 가능성이 높습니다.

<table><tbody><tr><td>염산, 2.5L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>염화 나트륨, 5kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨, 250g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>무수 인산수소이나트륨, 500g</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>제일인산칼륨, 500g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 펠릿, 500g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 2.5L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>관세 지급 완료</td></tr><tr><td>구연산삼나트륨, 5Kg</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>카우검, 250mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>더 이상 제공되지 않음</td><td>오래된 재고는 여전히 미술 도구점에서 찾을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0.125&amp;mu;g/mL, 500μL</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;바이알 회수&amp;rsquo;각 Cytocell TEL Probe와 함께 제공됨</td></tr><tr><td>네일 바니시, 12mL</td><td>부츠</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>아민 코팅 슬라이드, 25매</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0.1mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-avidin, 0.001mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-아비딘, 0.001mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 Streptavidin, 0.001mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리 튜브, 1.75mL, 500개입</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>마이크로원심분리관, 0.6mL, 1000개입 박스</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>30ml 범용 용기, 400개입/박스</td><td>스테릴린(Sterilin)</td><td>128B</td><td>NHS Supply Chain에서 구입 가능, 카탈로그 번호 KCP053</td></tr><tr><td>핫 블록</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알코올 램프 알코올 램프 소켓 알코올 램프 심지</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>마개 달린 유리 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>티슈, 100박스</td><td>NHS 공급망</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>금속 배양 트레이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 멜라민 트레이</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>오븐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 피펫 마우스피스</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시린지 필터, 0.2$\mu$m&amp;mu;m 공극 크기, 직경 25mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 펜</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드용 핫 블록</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 롤</td><td>NHS 공급망</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>슐리퍼데커 자(Schieferdecker Jar)</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>코플린 자(Coplin Jar)</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>둔단 핀셋</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>1000mL 비커</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>섬유 제거 블로팅 카드, 100매입</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>청색 프로스트 현미경 슬라이드, 100매입</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 18x18mm, No. 1, 200개입 박스</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> 커버스립, 22x22mm, No. 0, 200개입</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 22x50mm, No. 0, 100매입</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기, 100개입 한 박스</td><td>NHS 공급망</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>1mL 피펫 팁, 1000개입 10랙</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>배양기</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항온수조</td><td>연구비 지원 장비</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>알코올 온도계</td><td></td><td></td><td>이용 가능한 다양한 소스</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>pH 전극</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>Jenway pH 미터 3305용 BNC 플러그</td></tr><tr><td>가열 교반기</td><td>비비(Bibby)</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>1mL 파스퇴르 피펫, 500개입/박스</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50mm x 75m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

사전 이식 유전자 진단 생선

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

사전 이식 유전 진단 (PGD)은 사전 산후 진단하기 위해 설립된 대안이며, 보조 생식 기술 (ART)에 의해 생성된 일대에서 미리 주입 배아를 선택 포함됩니다. 이 선택 때문에 가족 monogenic 질환 (예 : 낭성 섬유증)의 요구, 혹은 파트너가 염색체 다시 정리하기 (예 : 양방향 상호의 translocation) 수행하기 때문에 수 있습니다. PGD​​는 염색체 rearrangements, 재발성 유산이나 불임의 경우에는 이전의 영향을받는 아이가, 그리고 / 또는이 커플에 사용할 수 있습니다. Oocytes는 다음과 난소 자극이 정액의 체외의 집중 (IVF)에 의해 또는 개별 정자 (ICSI)의 intracytoplasmic 주입에 의해 수정된 아르 aspirated. 사전 주입 절단 단계의 배아는 보통 3 일 후 수정에 대한 단일 세포의 제거에 의해 biopsied 있으며, biopsied 세포는 배아의 유전자 상태를 설정하는 테스트입니다. 대상 - 특정 DNA 프로브와 함께 biopsied 세포의 고정 핵에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광가있는 X - 링크된 질환과 염색체 rearrangements과 관련된 염색체 불균형을 감지하고, 가족 여성 배아를 선택하는 선택의 기술이다 더 돌연변이없는 특정 테스트합니다. 물고기도 지원 복제의 효율성을 시도하고 개선하기 위해 자발적인 염색체 aneuploidy (또한 PGS 또는 PGD - AS라고도 함)에 대한 화면 배아하는 데 사용되었습니다 있지만, 확산 및 생선 기술을 사용하여이 검사의 예측 가치는 여기에 설명된 대부분의 사람의 손에 unacceptably 낮은 가능성이 높습니다 그리고 그것은 일상적인 임상 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브리드화에서 임상 환경에서 PGD에 적용 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

착상 전 유전자 진단(PGD)은 산전 진단의 확립된 대안으로, ...로부터 착상 전 배아를 선택하는 과정을 포함합니다.

본 절차의 목적은 형광 인시튜 하이브리드 형성(fluorescence in situ hybridization) 기술을 사용하여 유전적 이상 위험이 있는 체외 수정 인체 배아의 성염색체 또는 전좌 상태를 결정하는 것입니다. 이는 3일차 배아에서 생검한 단일 세포를 유리 슬라이드 위에서 용해하고 핵을 공기 건조함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 표적 핵 DNA를 변성시키고, 서로 다른 색상의 형광색소로 표지된 DNA 프로브와 하이브리드 형성시키는 것입니다.다음으로 엄격한 세척(stringent wash)을 통해 과잉 프로브를 제거하고, 핵을 DNA 특이적 형광 염색약으로 염색합니다. 마지막 단계는 형광 현미경을 사용하여 핵을 관찰하고 디지털 이미지를 캡처하는 것입니다. 최종적으로 형광 현미경 관찰을 통해 표적 염색체 부위의 복제 수를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.일반적으로 이 기술에 익숙하지 않은 개인은 형광 제자리 부합법(fluorescence in situ hybridization technique)의 한계치에 가까운 작업이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 24시간 전에 세포 도말을 위한 세포 용해 버퍼를 준비하십시오. 용액을 여과한 후 1.7 mL 멸균 마이크로 원심분리 튜브 10~15개에 1 mL씩 분주하고, 생검 절차 직전에 -20 °C에서 냉동하기 전 튜브를 닫고 라벨을 부착하십시오.용해 버퍼를 상온에서 해동합니다. 다이아몬드 펜을 사용하여 아민 코팅 슬라이드 뒷면에 지름 약 5 mm의 작은 원을 긋고, 라텍스 장갑을 낀 상태에서 4H 하드 연필을 사용하여 슬라이드에 BLO라고 미리 표시합니다. 흑연 가루를 제거하기 위해, 각 블래스터 미러에 대해 번호 순서대로 별도의 슬라이드를 사용하십시오.이제 원 안에 적은 양의 lysis buffer를 넣습니다. biopsy blaster를 lysis buffer로 옮깁니다. 세포를 용해시키기 위해 필요한 만큼 lysis buffer를 추가합니다.핵이 원 내에 유지되고 소실되지 않았는지 관찰하십시오. 세포에 핵이 없거나 여러 개의 핵이 있는 경우, 다른 세포를 생검하십시오. 슬라이드를 실온에서 자연 건조시키십시오.먼저, 인산염 완충 식염수를 사용하여 실온에서 5분 동안 코플란 자(coplan jar)에서 시료를 예비 세척합니다. 그 다음 멸균 증류수로 2회 헹구고, 실온에서 에탄올 시리즈로 각각 2분씩 탈수시킨 후 공기 중에서 건조합니다. 슬라이드가 완전히 잠겼는지 확인하고, 흑연 가루가 표면에 떠오르면 깨끗한 티슈로 흡수하여 제거하십시오.위상차 현미경으로 관찰하여 원 내의 핵 위치를 기록합니다. 그다음 실온에서 100% ethanol로 2분 동안 시료를 탈수시킨 후 공기 중에서 건조합니다. 이제 2 µL의 프로브 혼합액을 처리하고 9 by 9 mm 커버슬립으로 덮습니다.커버 슬립의 가장자리를 러버 시멘트로 밀봉합니다. 코딩된 변성 과정을 수행합니다. 각 결합 용기를 75 °C의 히트 블록에서 5분 동안 가열한 후, 37 °C의 습윤 챔버에서 밤새 하이브리드화합니다.71 °C 항온수조에서 0.4배 SSC 엄격 세척 용액 50 milliliters를 평형화합니다. 엄격 세척액 병과 빈 커플링 용기를 항온수조에 넣고 상온에서 71 °C까지 가열한 후, 엄격 세척액의 pH를 조절하여 코친 병에 붓습니다. 각 슬라이드에서 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하고, 상온에서 4배 SSC 0.05% tween 20 pH 7 용액을 사용하여 커버 슬립을 헹굽니다.샘플을 71°C에서 0.4배 SSC 엄격 세척액(stringent wash)으로 5분 동안 세척한 후, 실온에서 4배 SSC 0.05% Tween 20으로 2분 동안 세척합니다. 간접 표지된 프로브의 경우, 슬라이드에서 과잉 액체를 제거하고 20 by 20 mm 크기의 파라폼(paraform) 사각형 아래에 형광 결합 항체 20 µL를 도포합니다. 습윤 챔버 내 37°C에서 15분 동안 배양합니다.파라필름을 제거하고 다음의 세척 과정을 실온에서 2분 동안 수행합니다. 4x SSC 0.05% tween 20으로 1회, 그리고 PBS로 2분 동안 2회 세척합니다. 슬라이드의 액체를 모두 제거한 후, DPI가 포함된 vector shield 마운팅 용액 6 µL를 22 by 22 mm 크기로 도포합니다.0번 커버 슬립을 사용하고 슬라이드를 커버 위에 뒤집어 덮습니다. 흡수지로 여분의 액체를 닦아내고 커버 슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉합니다. 마지막으로, 형광 현미경으로 시료를 분석합니다.두 명의 독립적인 분석가가 각 핵을 판독합니다. 또한, 시각적 진단을 확인하고 실험실 품질 보증의 일환으로 이미지를 보관하기 위해 이미징 소프트웨어를 사용하여 핵 이미지를 캡처합니다. 여기에서 말초 혈액 림프구로 준비된 중기 분열상과 간기 핵은 5번 염색체 단완의 5 P 14.3과 9번 염색체 단완의 9 P 24.1 지점에서 절단점이 발생한 5번과 9번 염색체 간의 상호 전좌 보인자를 나타냅니다.FISH 프로브는 9번 염색체의 전좌된 분절과 중심절 분절 신호를 모두 비춥니다. 3일 차 배아의 간기 배반포 핵을 포착한 후 이를 병합하여 합성 영상을 생성할 수 있습니다. 각 프로브당 두 개의 신호는 각 유전자 좌위의 두 복제본을 나타내며, 이는 정상 또는 균형 잡힌 보체와 일치합니다.전좌 염색체의 경우, 색상 신호는 5번 염색체의 전좌된 분절 1카피, 9번 염색체의 전좌된 분절 3카피, 그리고 9번 염색체의 중심절 분절 2카피를 나타냅니다. 이 데이터는 5p14.3에서 5pt까지의 부분 삼염색체성(man somi) 및 9p24.1에서 9pt까지의 삼염색체성(trisomy)이라는 불균형 생성물과 일치합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 인간 배아에서 생검한 단일 세포를 분석하고 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 기술을 사용하여 단일 핵을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이는 배아의 성염색체 구성 또는 전좌 상태를 결정하기 위해 재현 가능하고 최적의 테스트 결과를 얻는 데 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

다른 유전자에 의해 보상이있다면 유전자 기능이 손실의 기능 실험에 드러나지 수 있습니다. zebrafish 모델은 생활 배아에서 이러한 기능 중복을 나타내기 위해 상대적으로 높은 처리량 방법을 제공합니다.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

이 프로토콜은 제브라 피쉬의 차 기자로 기본 기자와 GFP / RFP로 인 Gal4-VP16을 사용하여 유전자 트랩 insertional 돌연변이 유발의 방법을 설명합니다. 약 한 고 표현 F0 물고기 수익률 유전자 트랩 자손을 GFP 및 RFP를 공동으로 표현하는 10 명 중. 심사 절차는 쉽게 insertional 돌연변이 화면을 수행하는 실험실의 크기에 적응하기 위해 확장 할 수 있습니다.

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

제브라피쉬는 고등 척추동물과의 유전적 유사성으로 인해 발생 생물학 및 인간 질병 연구를 위한 강력한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 초기 배발생에 필수적인 유전자의 열성 돌연변이를 식별하기 위한 전방 스크리닝 전략에 활용할 수 있는 반수체 제브라피시 배아를 만드는 방법론을 설명합니다.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 배아에서 유전자 편집에 대 한 간단 하 고 효율적인 microinjection 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜에서 RNAs 가이드 및 Cas9 단백질 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected 했다. 이 프로토콜은 두 채널 메기 면역 관련 유전자를 노크 하 여 검증 되었습니다 않았습니다.

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

여기서는 짧은 처리 시간, 낮은 비용 및 높은 처리량의 장점을 가진 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 염기서열 분석 방법을 소개합니다.

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

이 프로토콜은 반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 이수성에 대한 이식 전 유전자 검사에 필요한 전체 실험실 내 절차를 제시합니다. 여기에서는 전체 게놈 증폭, DNA 단편 선택, 라이브러리 구축, 템플릿 준비 및 대표적인 결과와 함께 시퀀싱 작업 흐름의 자세한 단계를 제시합니다.

반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 Aneuploidy에 대한 이식 전 유전자 검사

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

학습하세요 형광 원위치 하이브리다이제이션(FISH) 기법을 이용한 인간 배아 단일세포 생검 및 핵 분석 방법입니다. 이 기술은 사전 이식 유전자 진단(PGD)에서 염색체 이상을 정확히 식별하여 생식 의학 연구에 활용됩니다.

사전 이식 유전자 진단 생선

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