사전 이식 유전자 진단 생선

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

이 절차의 목적은 형광 in situ two hybridization 기술을 사용하여 유전적 기형의 위험이 있는 체외 인간 배아의 성염색체 또는 전좌 상태를 결정하는 것입니다. 이것은 3일째 배아에서 생검된 단일 세포를 유리 슬라이드에 넣고 핵을 공기 건조시키는 방식으로 이루어집니다. 두 번째 단계는 D nature를 코딩하고 다양한 색상의 형광 색소로 표지된 DNA 프로브로 표적 핵 DNA를 하이브리드화하는 것입니다.

다음으로, 과잉 프로브를 엄격한 세척을 사용하여 제거하고 핵을 DNA 특이적 형광 염색으로 염색합니다. 마지막 단계는 형광 현미경을 사용하여 핵을 보고 디지털 이미지를 캡처하는 것입니다. 궁극적으로 형광 현미경을 통해 표적 염색체 영역의 복제 수를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 형광 현장 혼성화 기술의 한계에 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 24시간 전에 세포 확산을 위한 세포 용해 완충액을 준비합니다. 용액을 여과하고 1mL 분취액을 10-15, 1.7mL 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 분주하고 생검 절차 직전에 섭씨 영하 20도에서 동결하기 전에 튜브에 라벨을 붙입니다.

용해 버퍼를 실온에서 해동합니다. 다이아몬드 펜을 사용하여 아민 코팅된 슬라이드의 아래쪽에 직경 약 5mm의 작은 원을 그린 다음 라텍스 장갑으로 슬라이드 BLO에 미리 레이블이 지정된 단단한 4H 연필을 사용합니다. 흑연 가루를 제거하려면 각 블래스터 미러에 대해 번호순으로 별도의 슬라이드를 사용하십시오.

이제 원 안에 작은 부피의 용해 버퍼를 배치합니다. 바이옵시 블래스터를 용해 완충액으로 옮깁니다. 세포를 용해하기 위해 필요에 따라 용해 버퍼를 추가합니다.

핵을 관찰하여 핵이 원 안에 남아 있고 손실되지 않았는지 확인합니다. 세포에 핵이 없거나 여러 개의 핵이 있는 경우 다른 세포를 생검합니다. 슬라이드를 실온에서 자연 건조시키십시오.

먼저, 실온에서 5분 동안 인산염 완충 식염수를 사용하여 coplan jars에 샘플을 사전 세척합니다. 그런 다음 멸균 증류수로 두 번 헹구고 실온에서 각각 2분씩 에탄올 시리즈로 탈수하고 자연 건조합니다. 슬라이드가 완전히 잠겼는지 확인하고 흑연 가루가 표면에 떠오르면 깨끗한 티슈로 흡수하십시오.

위상차 현미경으로 시각화하여 원 안에 있는 핵의 위치를 기록합니다. 그런 다음 실온에서 2분 동안 100% 에탄올로 샘플을 탈수하고 공기 중에서 건조시킵니다. 이제 2마이크로리터의 프로브 혼합물을 바르고 9 x 9mm 커버 슬립으로 덮습니다.

커버 슬립의 가장자리를 고무 시멘트로 밀봉하십시오. 코딩된 생성을 수행합니다. 섭씨 75도의 가열 블록을 5분 동안 밟은 다음 각 커플링 용기에 대해 섭씨 37도의 가습 챔버에서 밤새 하이브리드화합니다.

50 밀리리터의 0.4 배 SSC 엄격한 세척 용액을 섭씨 71 도의 수조에서 평형을 이룹니다. 엄격한 세척 병과 빈 커플 링 용기를 수조에 넣고 실온에서 섭씨 71도까지 가열하고 코친 항아리에 엄격하게 세척하고 디캔트합니다. 각 슬라이드에서 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하고 실온에서 SSC 0.05%tween 20 pH 7을 사용하여 커버 슬립을 헹굽니다.

섭씨 71도에서 5분 동안 0.4배 SSC 엄격하게 세척한 다음 실온에서 2분 동안 SSC 0.05% Tween 20을 4회 세척합니다. 간접적으로 라벨링된 프로브의 경우, 과도한 액체의 슬라이드를 배출하고 20 x 20mm 정사각형의 파라폼 아래에 20마이크로리터의 형광 접합 항체를 적용합니다. 섭씨 37도의 가습실에서 15분 동안 배양합니다.

파라 필름을 제거하고 실온에서 2분 동안 다음 세척을 수행합니다. 네 번, SSC 0.05%트윈 20, PBS에서 2분 동안 두 번. 슬라이드를 배수한 후 DPI가 포함된 6마이크로리터의 벡터 쉴드 장착 매체를 22 x 22mm에 적용합니다.

숫자 0 덮개는 덮개 위로 슬라이드를 밀어 넣고 뒤집습니다. 슬립, 블롯, 투명 네일 바니시로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 마지막으로 형광 현미경으로 샘플을 분석합니다.

두 명의 독립적인 분석가가 각 핵에 점수를 매깁니다. 또한 이미징 소프트웨어를 사용하여 시각적 진단을 확인하고 실험실 품질 보증의 일환으로 이미지를 보관하기 위해 핵의 이미지를 캡처합니다. 여기서 말초 혈액 림프구에서 준비된 중기 확산 및 간기 핵은 5 P, 14.3 및 9 P 2, 4.1의 단점과 함께 염색체 5와 9의 짧은 팔 사이의 상호 전좌의 운반체를 나타냅니다.

물고기 탐침은 trans located segment와 chromosome nine 신호의 중심 segment를 모두 비춥니다. 3일째의 단순한 핵을 계면 폭발에서 배아를 캡처한 다음 병합하여 복합 이미지를 형성할 수 있습니다. 각 프로브에 대한 두 개의 신호는 각 유전자 자리의 두 개의 복사본을 나타내며, 이는 정상 또는 균형 보수와 일치합니다.

전좌 염색체의 경우, 착색 신호는 염색체의 트랜스 위치 세그먼트 사본 5개, 염색체 9번 트랜스 위치 세그먼트의 사본 3개, CH 염색체 9의 중심 세그먼트 사본 2개를 나타냅니다. 이 데이터는 5P의 남자 소미의 불균형 곱과 일치한다: P 14.3 - 5 PT, 그리고 삼염색체는 9P 2, 4.1 - 9pt이다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 배아에서 생검된 단일 세포를 분석하고 형광 현장 혼성화 기술을 사용하여 단일 핵을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이는 배아의 성염색체 보체 또는 전좌 상태를 결정하기 위해 재현 가능하고 최적의 테스트 결과를 얻는 데 중요합니다.