Name: 경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 배우세요 쥐 심장에서 관상동맥 결찰 및 심근내 주사를 위한 미세수술 기법을. 허혈/재관류 손상 연구에 활용할 수 있는 실용적인 방법론을 제공합니다.

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난 그들의 경계와 도움을 비교 의학 연구 및 부서를 지원하기 위해 기금을 제공하는 연구 및 졸업 연구학과를 인정하고 싶습니다. 나는 또한 그들의 도움을 그들의 지원과지도에 대한 생리학의학과뿐만 아니라, 내 연구실에서 학생과 기술자를 인식하고 싶습니다. 마지막으로, 내가 마우스 미세을 알게되는 시간 동안 교육 기회에 대한 내 포스트 박사 멘토, 닥터 찰스 E. 머리를 감사하고 싶습니다.

<ol><li> 무균 수술기구 (표 1) 3 "무명 밀고 applicators은 살균 underpad에 표시됩니다. 구슬 살균기 (Germinator 500)가 설정되어 있습니다. </li><li> 마우스 (나이 :&gt; 6주, WT :&gt; 18g)는 tribromoethanol의 20μl / g BW (; 기간 - 약 40 분 250mg/kg)의 IP 주사로 anesthetized 있습니다. </li><li> 쥐가 발끝 - 찔러봐, 살균 윤활제 (눈물이 갱신)에 응답하는 경우 탈수와 가슴의 왼쪽에서 그들을 보호하기 위해 눈에 적용은 피부에서 모피를​​ 제거하는 depilatory (예 : 나이르)으로 코팅됩니다. </li><li> depilatory는 따뜻한 실행 물과 betadine / 알코올 보라고가 수술 영역을 소독하는 데 사용됩니다 함께 씻겨입니다. </li><li> 마우스는 플렉시 글라스 테이블에 고정 따뜻한 deltaphase 등온 패드에 배치됩니다. 각 갈기갈기는 테이프를 사용하여 고정하고 두꺼운 스레드 장소에서 위턱을 보유 가기 치아 아래에 수평으로 배치됩니다. </li><li> 테이블이 수직으로 위치하며 fiberoptic 빛이 transesophageal 조명에 대한 목 지역에 직접 빛났다입니다. 이것은 따라서기도는 PE 관의 삽입을 용이하게하기 위해 시각 될 수 있도록, 인후의 구멍이 잘 조명 구멍으로 볼 수 있습니다 그러한 정확한 위치를 필요로합니다. </li><li> 속도 125 숨을 / 분,, 피크 inspiratory 압력 10-12 CMH 2 O; * 참고 튜브 그런 다음 일정한 양압 환기 (토포 호흡기 관리 환풍기 (95 % O 2 / 5% CO 2에 연결)에 연결 : 설정) 부담 및 성별 1-3과 다를 수 있습니다. 환기가 동기 가슴의 움직임에 의해 확인되면, 연결이 수술하는 동안 extubation 않도록 테이프로 패드에 고정됩니다. </li><li> # 3 메스를 처리하기 위해 첨부 # 10 멸균 메스 블레이드, 가슴의 피부를 잡아 이빨 집게를 사용하여 멀리하는 것은 흉골에 피부가 병렬로 1.5cm 절개를하는 데 사용됩니다. </li><li> 곡선 바나의 microscissors는 pectoralis 근육을 잘라 늑간 근육의 작은 구멍을 만들기 위해 사용됩니다. </li><li> 스트레이트, 뭉툭한의 microscissors 3 늑골을 통해 절단하는 데 사용됩니다. </li><li> 9mm 소아 안과 검경은 갈빗대를 철회하는 데 사용됩니다. </li><li> 곡선 집게를 사용하면, 거리의 중심에서 심낭을 당겨 부드럽게 열어 눈물에 톱니 집게를 사용합니다. </li><li> Castroviejo 니들 홀더, 6mm 테이퍼 포인트 8분의 3 바늘 스레드를 사용하여 관상 동맥을 (마음의 긴 축을 따라) 내림차순 왼쪽 앞쪽에 아래 8-0 폴리에틸렌 봉합은 수직. <ol><li> 초과의 reperfusion 위해 제거할 수 있습니다 임시 묶인 들어, PE90의 멸균 0.5 - 1cm 조각은 관상 동맥에 병렬로 마음에 배치됩니다. 처음으로 관상 동맥에 따라 반복되었습니다 봉합은 다음 튜브에 묶여있다. 그것이 공개하는 동시에, 묶인이 느슨하게됩니다. 원하는 및 폐색 / reocclusion의 시간이 4 수정할 수 있듯이 이것은 반복 수 있습니다. 프로토콜 및 사용 마취의 종류의 길이에 따라 보완이 필요할 수 있습니다. </li><li> 영구 폐색은 관상 동맥에 따라 레이스 묶인 단순히 묶여 있습니다. 창백하고 운동 이상증은 분명하며 봉합의 긴 끝을 50-10 절단됩니다. </li><li> 에 대한 intramyocardial 사출 (S), 30 게이지 바늘로 살균 beveled 살균 해밀턴 주사기는 묶인의 오른쪽에 부상의 영역 위에있는 마음의 기지에 소개됩니다. 바늘은 다음 상해의 영역으로 고급 약간 그래서 베벨은 약 국경 지대에서 볼 수 철회합니다. 주사기 (2 - 3μl)의 솔루션 중 일부는 심장에 주입하고 바늘이 장소에서 개최됩니다. 주사기는 또 1~3mm 철회하고 솔루션의 나머지 주입니다. 솔루션 형성 물집이 없어져요 때까지 주사기는 장소에서 개최됩니다. 주사 바늘을 뺍니다. 어떠한 출혈이있다면 출혈이 멈출 때까지 5-7, 솜 밀고 작은 주걱은 부드럽게 바늘을 삽입 사이트에 누르면됩니다. </li></ol></li><li> 심근 조작이 완료되면, 갈비뼈 견인기이 제거되고 흉강은 6-0 surgipro의 봉합사를 사용하여 2-3 매트리스 봉합과 함께 닫힙니다. </li><li> 둘, 셋 매트리스 봉합은 다음 멸균 식염수로 0.25 % marcaine의 1시 10분 (0.1ml/25g 마우스)의 1-3 방울, pectoralis 근육을 닫습니다 만들어진 것은 근육에 적용 후 2-3 매트리스 봉합을 위해 만들어진다 피부를 닫습니다. </li><li> 마우스는 환풍기에서 제거됩니다. 얕은, 급속한, 일단 리듬 호흡이 확인, 마우스 extubated 수 있습니다. </li><li> 0.5ml 따뜻한 멸균 생리는 등의 피하 공간에 주입하고 이동성 (1 시간 최소)을 차릴 때까지 마우스는 새장에 온난 패드에 배치됩니다. </li><li> 생존 실험 들어, 생쥐들은 연습장에 다시 배치되고 희생의 시간까지 동식물 사육장으로 돌아왔습니다. 처음 2 일 동안, 음식이 moistened(그들이 고통을 일으킬 수있는 최대에 도달하지 않아도됩니다) 공급을 촉진하기 위해 케이지 바닥에 배치하고 buprenorphine는 모든 6 - 12hr을 관리해야합니다. 포스트 수술 치료는 적절한 이동성, 정리하고, 식습관을 확인하는 첫 번째 주일 동안 매일 모니터링을 포함합니다. </li><li> 수술 악기는 에탄올로 닦아하고 다음 수술 전에 비드 살균기에 삽입됩니다. </li><li> 희생의 시간에, 마우스는 pentobarbital 나트륨 (; 55-65 MG / kg 65mg/ml)와 anesthetized 있습니다. 마취의 적절한 비행기가 달성되면, 흉강가 열립니다. </li><li> 심장이 계속 뛰는이지만, 23 게이지 차가운 칼륨 염화물을 포함하는 바늘 (KCl, 30mM) 또는 2,3 - butanedione와 주사기가 monoxime는 (BDM, 10mM)입니다 찔린 뇌실의 후부 기초 영역과 솔루션에 사용됩니다 심장이 심장 확장에 체포 때까지 천천히 챔버에 주입. </li><li> 심장이 제거되면, PBS를 포함하는 주사기는 retrogradely 남아있는 혈액을 제거하는 마음을 씻어 perfuse하는 데 사용됩니다. 급성 연구, reperfusion 기간의 끝에, 그 소년은 폐색의 원래 시점에 다시 출혈도 잡았입니다. 1퍼센트 에반의 파란색을 포함하는 솔루션은 대동맥에 주입합니다. 심장이 추출되면, 그것은 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 1 % 안에 incubated, 동등한 두께의 3 섹션으로 transversely 절단하고, morphometric 분석 11 군데입니다. 만성 연구, 마음 그 후 일상적인 절차에 따라 처리 및 임베디드, 정착액에 포장되어 있습니다. 슬라이드는 다음 histologically 스테인드 및 9,10,12 (귀공자, NIH 이미지 J, 또는 이미지 프로 플러스를 사용하여) morphometric 분석을 위해 몇 군데 있습니다. </li></ol> 대표 결과 : 생쥐에서 올바르게, 생존 가격 (남성 : 연령 80~10주, 22-28g, 여성 : 연령 10-12주, 20-26g)는 다음과 같습니다의 90 % 이상 급성 국소 빈혈 / reperfusion 및 허혈성 preconditioning 실험을 통해 영구 동맥 내고 연구 85 %, 그리고 intramyocardial 주사에 대한 약 80 %. 초기 부상이 더 쉽게 보이는 신진 대사 변화보다는 국소 빈혈 / reperfusion의 구조, 경색의 크기 결정과 허혈성 preconditioning 실험 내사가 제공하지 않는 마음을 perfuse됩니다 대동맥에 1% 에반의 파란색 염료를 일으키는 수행하여 (때문에 그림 1A). 심장이 반으로 제거하고 transversely 절단되면, 조직은 경색의 크기 (그림 1B)를 측정하는 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물의 1 % 용액에 incubated입니다. 영역 귀공자 또는 동일한 배율에서 몇 군데 마이크로 미터를 사용하여 보정 수있는 NIH 이미징 소프트웨어를 사용하여 측정하고 있습니다. 이 번호는 위험 / 좌심실과 경색 위험 11시 크기 / 영역에 영역을 계산하는 데 사용됩니다. 스트레인 차이 신경이 심장 무게, 체중, 또는 비교 목적을 위해 경골 길이 이러한 조치를 정상화로 이동해야 체중과 심장의 크기에 따라서 차이가 발생할 수 있습니다. 같은 괴사 등 총 구조적 변화에 영구 동맥 내고 결과, 벽면은 밝은, 그리고 챔버 지연. 경색 크기와 영구 폐색 모델 (그림 2A)에서 좌심실, 실내 공간, septal 벽과 왼쪽 심실 무료 벽 두께에 비해 괴사에 대한 치료 및 / 또는 시간의 효과 비교도 귀공자 또는 NIH 이미지를 사용하여 측정할 수 소프트웨어. picrosirius 빨간색 / 빠른 그린 (그림 2B)와 콜라겐의 얼룩은 벽면 stiffening의 8-10의 기능 지표에 연결합니다 insterstitial 섬유증을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3의 이미지는 영구 동맥 내고 다음과 마음의 국경 지대에 주입 6ul 솔루션 (에반의 파란색)의 분포를 나타냅니다. 그뿐만 아니라 기본 방향으로 또한 transmurally 부상의 방향으로 진행되는지 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. A. 에반의 블루. 전에 절단하는 대동맥에 주입이 이미지는 마음 (스테인드)와 occluded 지역 (흠없는)의 perfused 영역을 보여줍니다. B. 에반 '급성 국소 빈혈 / reperfusion 상해 다음의 블루와 TTC의 얼룩이. 이것은 unoccluded 지역뿐만 아니라 metabolically 가능한 조직의 TTC의 얼룩 (적색)을 스테인드 청색 색소의 분포를 보여주는 대표적인 이미지 (20x)입니다. 괴사성 지역 얼룩없고 그래서 그들은 (설명) 창백 남아 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. A. Hematoxylin 및 eosin는 얼룩.이 포스트 MI (20x) 사일의 경색이 지역을 통해 transversely자를 마우스 심장의 H &amp; E 염색법의 대표 이미지 (20x)입니다. *이 조직 괴사를 나타냅니다, 화살표는 과립 조직 만들기를 가리킨 다음 RV = 우심실과 LV = 좌심실. B. Picrosirius 빨간색 빠른 녹색 얼룩.이가picrosirius 레드 / 사후 MI 사주에서 마우스 마음의 단면의 빠른 녹색 얼룩의 대표적인 이미지 (20x). 세포질의 얼룩의 녹색과 콜라겐 섬유가 빨간색입니다. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 6ul intramyocardial 분사 다음 그림 3. 에반의 청색 색소 착색 분포. 이것은 즉시 관상 동맥 내고 (12 배) 다음과 같은 국경 지대에서 6ul intramyocardial 사출 다음 심장에 걸쳐 에반의 청색 색소의 글로벌 및 transmural 분포를 보여주는 대표 이미지입니다.

이 동물의 프로토콜은 승인과 이스트 카롤 리나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라가되었습니다.

관상 심장 질환은 epidemiologically과 fiscally 중요한 공중 보건 문제가되고 있습니다. 상당한 기초 연구는 아직 부상과 개조를 진행하는 메커니즘과 방법들이 임상 사용하기 위해 개발해야하는 경우 잠재적인 치료제가 이러한 프로세스를 조절 수 있습니다 이해가 필요합니다. 설치류는 가장 일반적으로 사용 가능한 유전자 변형 생쥐의 다양한 수종이 더 매력적인 모델을 만들 수 있습니다. 마우스와 다른 종 사이의 차이가 있지만, murine 모델에 많은 장점이 있습니다. 간단한 해부 범위 또는 돋보기의 사용을 잘 조명 조건 vasculature가 쉽게 (vasculature에 대한 자세한 총 해부학에 대한, 살토 - 텔레 즈 외 참조하십시오., 2004 13) 볼 수 있습니다. 25g 마우스의 총 혈액 볼륨 미만 2ml 14 년부터 이후 수술 사망률의 위험을 줄이기 위해서는 대형 선박을 severing 피하기 위해 매우 중요합니다. 과도한 출혈이 발생하는 경우, 압력이나 정확하게의 소작의 부드러운 응용 프로그램은 출혈을 멈추게하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 또한 다양한 방법으로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스는 isoflurane, 마취제 / xylazine, 또는 나트륨 pentobarbital하고 적절한 선택이 프로토콜 15-18 기간에 의해 결정됩니다를 사용하여 anesthetized 수 있습니다. 발가락 - 핀치 반사는 마취의 깊이에서 가장 일반적으로 사용되는 인덱스입니다. 또한, 장기적인 생존 가능성을 향상시키기 위해, 몇 가지 조사가 치명적인 arrhythmias 19,20 그러나이 최근 급성에서 antiapoptotic 속성을 가지고 표시되었는지 고려해야한다의 발생을 줄이기 위해 같은 lidocaine과 같은 antiarrhythmic 약물을 사용 모델 21. 또한, 포스트 수술 고통을 줄이기 위해 같은 buprenorphine과 같은 진통제는 수술 3,16,17,22,23 후 첫 48 시간 시행하실 수 있습니다. 수술 중 체온을 (특히 이상 프로토콜)을 유지하기 위해 가열 패드와 시리즈의 직장 프로브은 종종 등온 패드 대신 사용됩니다. 영구 폐색 들어, 경색의 크기는 묶인의 위치를​​ 조정하여 수정할 수 있습니다,, 폐색 (S)과 reperfusion (S) 기간은 변경될 수 있습니다 국소 빈혈 / reperfusion 및 / 또는 허혈성 사전 또는 postconditioning에 대한 그리고 intramyocardial 주사 (예 : 세포, 단백질)를, 1-3 주입 위치가있을 수 있으며, 사출 당 볼륨을 15 μl 24까지 수 있습니다. 세포가 주입되는 경우, 바늘의 게이지는 바늘의 내부 직경이 쉬어링 피할 정도로 큰되도록 5,25,26는 세포의 크기에 따라 선택한다 (일반적으로 26-30) 사용됩니다. 수술에 의해 발생한 염증 과정으로 인해 confounds을 피하기 위해, 일부 조사는 수술 후 27-29 어느 시점 닫힌 가슴 마우스의 마음을 막다하고 reperfuse 전 (前) 생체내을 조작하는 올무를 사용하여보고있다. 최근 가오 외. 30 임시 및 영구 폐색이 통풍을위한 필요없이 수행할 수 있으며 몇 연구소가 폐쇄 가슴 intramyocardial 주사 25,31을 수행하기 위해 초음파를 사용하여 시작하는 것으로 나타났습니다. 생쥐에서 관상 동맥을 ligating의 가능성을 보여주는 첫 연구가 1954 32 존스와 올슨에 의해 출판 되었음 때문에, 많은 사람들이이 모델을 채택하고 심근 상해 및 리모델링 3,33-45의 다양한 측면을 연구하기 위해 그것을 수정했습니다. 크기, 생식 능력과 구매 및 유지 보수에 대한 비교적 적은 비용의 관점에서 생쥐의 성격이 종에게 physiologic과 pathophysiologic 연구 광범위한 매력적인 도구를합니다. 생체내의 진보 46-49의 이미징을위한 기술의 소형화뿐만 아니라이 수행하고 대규모 게놈과 proteomics, 약물 검사, 세포 기반 및 / 또는 단백질 요법의 효능뿐만 아니라 결합 biomaterials 50-64을 분석하는 수단으로 유비 쿼터스 또는 조직 특정 유전자 변형이나 돌연변이 / 녹아웃 마우스에서 유전자 조작 여유의 점점 다양한, 심근 경색의 murine 모델은 의심의 여지없이 급성 심장 부상 장기적인 리모델링을 평가에 귀중한 도구가 될 것입니다. 따라서, 안정 reproducibly 이러한 실험을 수행할 수있는에 나무랄 데없는 가치가있다.

<table><tbody><tr><td>롱 바나 가위(Long Vanna Scissors)</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-159</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위(Micro Dissecting Scissors)</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-161</td><td></td></tr><tr><td>포셉 &amp;#8211; 직선형, 1x2 치형</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-205</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 #3</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-64</td><td>#10 멸균 블레이드</td></tr><tr><td>포셉 &amp;#8211; 반곡형 세레이션</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-19</td><td></td></tr><tr><td>조직 가위</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-410</td><td></td></tr><tr><td>카스트로비에호 지침기(Castroviejo Needle Holder)</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-1828</td><td></td></tr><tr><td>쿡 안검 견인기(Cook Eye Speculum)</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-63</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 8-0</td><td>Suture Express</td><td>VP-900-X</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Suture Express</td><td>8776</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 비드 멸균기</td><td>Cellpoint Scientific</td><td>65369-1</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase 등온 패드</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 시린지 - 25&amp;mu;l</td><td>Hamilton Co</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge 경사 바늘</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>인공호흡기</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO</td><td></td></tr></tbody></table>

경색의 murine 모델에서 관상 동맥 내고과 intramyocardial 사출

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

마우스 모델은 심근의 급성 손상 및 만성 리모델링을 in vivo에서 연구하는 데 있어 가치 있는 도구입니다. 전신 또는 심근에 대한 유전자 변형과 다양한 생물학적 및/또는 합성 재료의 등장은, 이러한 요소들의 조합을 통해 급성 허혈성 손상의 정도를 완화하고 심근 리모델링에 따른 심부전의 발생을 억제할 수 있는 큰 가능성을 제시합니다.
본 논문에서는 이러한 미세수술을 안정적으로 수행하기 위해 사용된 방법과 재료, 그리고 일시적(재관류 포함) 또는 영구적 관상동맥 폐쇄 연구 및 심근 내 주사를 위한 수정 사항을 제시합니다. 조직학적 평가와 더불어, 시술 중 및 실험 종료 시 관찰할 수 있는 심장의 반응을 통해 효능을 검증할 것입니다.
요약하자면, 수술 준비 과정은 마우스 마취, 흉부 털 제거, 그리고 수술 부위 소독 순으로 진행됩니다. 기관 내 삽관은 광섬유 조명을 이용한 식도 투과 조명법으로 수행합니다. 그 다음 튜브를 인공호흡기에 연결합니다. 흉부를 절개하여 흉근을 노출시킨 후, 이를 절개하여 갈비뼈를 확인합니다. 허혈/재관류 연구의 경우, 심장 위에 1 cm 길이의 PE 튜브 조각을 배치하고 여기에 결찰사를 묶어 폐쇄/재관류를 맞춤 설정할 수 있도록 합니다. 심근 내 주입의 경우, 멸균된 30gauge 베벨 바늘이 장착된 Hamilton 시린지를 사용합니다. 심근 조작이 완료되면 갈비뼈, 흉근, 피부 순으로 차례대로 봉합합니다. 피부 봉합 전 근육층에 멸균 식염수에 희석한 0.25% marcaine을 투여하여 신경 차단 진통법을 시행합니다. 마우스에 식염수를 피하 주사하고, 복와위로 안정될 때까지 가온 챔버에 둡니다. 그 후 마우스를 사육실로 옮겨 조직 수집 시점까지 표준 조건에서 사육합니다. 희생 시점에 마우스를 마취하고, KCl 또는 BDM을 사용하여 심장을 이완기에 정지시킨 후, 식염수로 헹구고 고정액에 침전시킵니다. 이어서 처리, 포매, 절편 제작 및 조직학적 염색을 위한 일반적인 절차를 수행합니다.
마우스의 비수술적 삽관과 설명된 미세수술 조작은 이 모델을 학습하고 재현성을 확보하는 데 있어 기술적으로 매우 까다로운 과제입니다. 이러한 절차는 정해진 시간에 따른 폐쇄 및 재관류, 또는 심근 내 주사를 위해 결찰사를 일관되게 조작하는 어려움과 결합되어 생존율에 영향을 미칠 수 있으므로, 최적화와 일관성 유지가 매우 중요합니다.

수많은 유전자 조작 및 / 또는 유전자, 단백질, 세포 및 / 또는 biomaterials의 intramyocardial 주사는 급성 국소 빈혈 / reperfusion 부상과 생쥐의 만성 리모델링의 연구에 시간의 차원에 따라 겹쳐있다. 이 동영상은 국소 빈혈 / reperfusion에 대한 microsurgical 절차, 영구적인 관상 동맥 내고, 그리고 intramyocardial 사출 공부를 보여줍니다.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

마우스 모델은 생체 내(in vivo) 심근의 급성 손상 및 만성 리모델링을 연구하는 데 있어 가치 있는 도구입니다. ...에 대한 유전자 변형 기술이 등장함에 따라

다음 실험의 전반적인 목적은 마우스 심장에서 일시적 또는 영구적 관상동맥 결찰을 수행하기 위한 미세수술 방법과 심근 내 주사법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수술 부위를 준비하고 소독합니다. 그 다음, 흉강 절개술 동안 양압 환기를 제공하기 위해 PE 90 튜브로 마우스에 기관 삽관을 실시합니다.관상동맥을 분리한 후, 일시적 또는 영구적으로 폐쇄할 수 있습니다. 또한, 심장에 특정 물질을 주입할 수 있습니다. 조직학적 및 형태 계측적 종말점, 조직 및 혈청 단백질 마커, 그리고 기능적 지표를 바탕으로 심장에 가해진 손상 정도를 보여주는 결과를 얻게 됩니다.제 이름은 TKA Rag이며, 이스트 캐롤라이나 대학교 브로디 의과대학 생리학과 소속입니다. 이 영상의 목적은 생쥐 심장의 일시적 및 영구적 관상동맥 결찰에 사용되는 미세수술 절차와 심근 내 주사 방법을 시연하는 것입니다. 우선, 멸균된 수술 기구와 3인치 면봉을 멸균 패드 위에 준비하십시오.다음으로, 개별 수술 사이에 기구를 멸균할 수 있도록 비드 멸균기를 켭니다. 수술을 위해 동물을 준비하려면, 마취된 마우스의 눈에 멸균 윤활제를 도포합니다. 그다음, nare와 같은 제모제를 사용하여 가슴 왼쪽의 털을 제거합니다.화학적 화상이나 피부염을 방지하기 위해 제모 크림을 철저히 닦아냅니다. 플렉시글라스 테이블에 고정된 delta phase 등온 패드 위에 마우스를 놓습니다. 테이프로 각 사지를 고정하고, 위턱을 고정하기 위해 윗니 아래에 굵은 실을 배치합니다.수술 부위를 Betadine과 알코올로 총 세 번 닦아냅니다. PE 튜브 삽입 시 기관을 잘 시각화할 수 있도록 광섬유 조명을 사용하여 목 부위를 비춥니다. 조명이 확보되면 튜브를 입을 통해 조심스럽게 삽입합니다.양압 환기를 실시하기 위해 튜브를 인공호흡기에 연결합니다. 흉부의 동기화된 움직임을 통해 환기가 확인되면, 연결 부위가 고정되도록 테이프로 패드에 고정합니다. 수술 중에 치상 포셉을 사용하여 피부를 흉부에서 위로 들어 올려 당긴 후, 흉골과 평행하게 피부를 1.5 centimeter 절개합니다.다음으로, 곡선형 Vana 미세 가위를 사용하여 흉근을 절개하고 늑간근에 작은 구멍을 냅니다. 근육을 견인한 후, 직선형 둔단 미세 가위를 사용하여 갈비뼈 3개를 절단합니다. 견인기를 사용하여 흉곽을 견인합니다.TRO Viejo 니들 홀더와 테이퍼드 포인트 바늘 실을 사용하여 심낭을 조심스럽게 열어 심장을 시각화합니다. 일시적 결찰을 위해 좌전하행 관상동맥 아래에 폴리에틸렌 봉합사를 배치하며, 이는 정해진 시간의 재관류를 위해 나중에 제거할 수 있습니다. PE 90 조각을 0.5에서 1 cm 길이로 잘라 심장 위에 놓습니다. 관상동맥과 평행하게, 관상동맥 아래로 루프가 형성된 봉합사를 튜브에 묶습니다. 정해진 시간이 지난 후, 결찰을 풀어 재관류가 이루어지게 하거나 영구적인 폐쇄를 수행합니다.관상동맥 아래로 묶은 결찰사를 조입니다. 창백해짐과 운동이상증이 뚜렷하게 나타나야 합니다. 심근 내 주사를 위해 봉합사의 긴 끝부분을 잘라내고, 결찰사 오른쪽의 손상 부위 상단 심장 기저부에 30 gauge 멸균 바늘을 삽입합니다.바늘을 손상 부위로 전진시킨 후, 베벨(bevel)이 경계 구역 근처에서 보일 정도로 약간 후퇴시킵니다. 용액을 소량 주입하고 바늘을 그 자리에 고정합니다. 주사기를 1~3mm 정도 더 후퇴시킨 후 나머지 용액을 주입합니다.용액에 의해 형성된 혈액이 사라질 때까지 주사기를 고정합니다. 혈액이 사라지면 바늘을 제거합니다. 출혈이 발생할 경우, 출혈이 멈출 때까지 면봉으로 해당 부위를 가볍게 누릅니다.심근 조작이 완료되면 늑골 견인기를 제거하고 흉강을 2~3개의 매트리스 봉합사로 봉합합니다. 다음으로 대흉근을 2~3개의 매트리스 봉합사로 봉합합니다. 멸균 식염수에 희석한 0.25% marking 용액을 근육에 1~3방울 도포하고, 추가로 2~3개의 매트리스 봉합사를 사용하여 피부를 봉합합니다.마우스를 인공호흡기에서 분리하고 리드미컬한 빠른 얕은 호흡(rapid shallow breathing)이 이루어지는지 확인합니다. 0.5 milliliters의 따뜻한 멸균 식염수를 등 쪽 피하 공간에 주입하고, 마우스가 가동성을 회복할 때까지 가열 패드가 있는 케이지에 둡니다. 생존 실험의 경우, 마우스를 원래의 사육 케이지로 옮겨 희생 시점까지 동물실(vivarium)로 되돌려 보냅니다.수술 기구들을 에탄올로 깨끗이 닦아 비드 멸균기에 넣습니다. 분석용 샘플 수집을 위한 다음 수술을 준비하기 위해 심장을 분리하고, 차가운 potassium chloride 또는 2,3-butanedione solution이 담긴 바늘로 심실의 후기저부를 찌릅니다. 심장이 이완기 상태에서 정지될 때까지 용액을 챔버에 천천히 주입합니다. 심장을 제거하고 PBS로 관류하여 남아 있는 혈액을 제거합니다.관류가 완료되면 심장을 고정액에 담그고, 이후 일반적인 절차에 따라 심장을 처리 및 포매합니다. 일시적인 결찰로 인해 발생한 급성 손상은 염색을 통해 시각화할 수 있습니다. 이 이미지에서 청색 염료는 심장의 폐쇄된 영역에 분포하며, TTC 염색은 대사적으로 생존 가능한 조직을 표시합니다.빨간색으로 표시된 괴사 부위는 염색되지 않아 창백하게 남습니다. 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 좌심실 대비 위험 구역의 면적과 위험 구역 대비 경색 면적을 계산할 수 있습니다. 본 예시에서는 심근경색 후 4일째에 손상된 심장의 경색 부위를 횡단면으로 절단하여 hemat, hematin 및 eoin으로 염색한 모습입니다.별표는 조직 괴사를 나타내며 화살표는 육아 조직의 콜라겐 염색을 가리킵니다. Sirius red, fast green은 간질성 섬유화를 측정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 벽 경직도의 기능적 지표와 상관관계가 있습니다. MI 발생 4주 후 마우스 심장의 이 이미지는 세포질을 녹색으로, 콜라겐 섬유를 적색으로 보여줍니다.이 일련의 이미지들은 영구적인 동맥 결찰 후 심장의 경계 구역에 주입된 6 µL의 Evan's blue 염료 용액의 분포를 나타냅니다. 염료가 손상 부위 방향뿐만 아니라 기저부 및 관통벽 방향으로 퍼지는 것을 확인하십시오. 관상동맥을 시각화하고 확실하게 폐쇄하는 것은 매우 까다로우며, 숙달되기까지 많은 연습이 필요합니다.시술 과정 중 폐를 찌르지 않도록 주의하고, 수술 조작 중에 동물의 기관내관이 빠지지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.I.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 심근 국소 빈혈의 pathobiological 및 pathophysiological 프로세스를 연구하기위한 빠르고 안정적​​인 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

내사 - 결합 : 심근 경색의 Murine 모델

쥐 실험 심근 경색을 유발하는 데 사용되는 외과 수술은 심장과 왼쪽 폐의 앞쪽 표면을 시각화하기 위해 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 왼쪽 thoracotomy로 시작합니다. 왼쪽 관상 동맥이 출혈도 잡았되어 가슴이 폐쇄되고 마우스가 저절로 복구 할 수 있습니다.

마우스의 관상 동맥 결합에 대한 수정 기술

이 비디오에서는 좌측 전방 하행 관상 동맥을 영구적으로 결찰하여 심근 경색의 마우스 모델을 생성하는 수술 절차에 대해 설명합니다.

심근경색의 쥐 모델 생성: 마우스 모델에서 좌측 전방 하행 관상동맥의 영구 결찰을 위한 수술 절차

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

최소한의 침습적 조작으로 마우스의 심근 경색에 대한 재현성이 높은 모델을 설명합니다. 모델을 쉽게 수행할 수 있어 재현성과 생존율이 높습니다. 따라서 설명된 모델은 3R 원칙(Replacement, Refinement and Reduction)에 의해 요청되는 대로 필요한 동물의 수를 줄일 것입니다.

쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술

심부전은 입원의 주요 원인이자 사망의 주요 원인입니다. 마우스에서 좌측 전방 하행 관상동맥의 영구 결찰 모델을 적용하여 심근경색 후 심실 리모델링 및 심장 기능 장애를 조사합니다. 마우스의 침습적 혈류역학적 측정 기술이 제시됩니다.

마우스의 왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰 : 심근 경색 리모델링과 심장 마비의 모델

우리는 마우스 모델에서 좌측 전방 하행 동맥(LAD) 결찰에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 기관 내 삽관, 좌측 개흉술 접근법 및 흉강천자를 포함하는 다른 방법보다 상대적으로 덜 침습적입니다. 이 방법은 급성 및 만성 심근 경색(MI)에 대한 모델로 사용할 수 있습니다.

쥐 왼쪽 앞쪽에 내림차순 (LAD) 관상 동맥 결찰 : 심근 경색에 대한 개선 및 단순화 된 모델

여기서 우리는 마우스에서 좌측 전방 의 관상 동맥의 영구적 인 결찰을 달성하는 방법을 보여주는 외과 적 절차를 설명합니다. 이 모형은 심근 경색의 병리생리학 및 수반되는 생물학 프로세스를 조사하기 위하여 높은 관련성입니다.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

여기에 제시된 것은 생쥐에서 왼쪽 관상 동맥의 영구 결찰을위한 수술 절차입니다. 이 모델은 심근 경색 후 병태생리학 및 관련 염증 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

좌측 관상동맥 결찰술: 심근경색의 외과적 쥐 모델

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

배우세요 쥐 심장에서 관상동맥 결찰 및 심근내 주사를 위한 미세수술 기법을. 허혈/재관류 손상 연구에 활용할 수 있는 실용적인 방법론을 제공합니다.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

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