Name: 초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 학습하세요 초점을 맞춘 이온 빔 주사 전자 현미경을 이용한 뇌 조직의 3차원 고해상도 이미징 방법을. 레진 포매된 뇌 샘플에서 연속 이미지를 수집하여 뇌 조직 구조를 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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1. 샘플 고정 및 수지 삽입 <ol><li> 신선한 조직과 세포의 샘플은 2 % paraformaldehyde에 적어도 2 시간 동안 고정하고, 7.4의 산도에 0.1 M 인산 완충액에서 2.5 %의 글루 타 알데히드입니다. 샘플 크기가 충분히 침투 또는 정착액을 허용 두께 0.150 mm를 넘지 않아야합니다, 12 시간 이상에 대한 수정에 남아있을 수 없습니다. </li><li> 20ml 유리 섬광 튜브 안에 샘플을 놓고 그들에게 0.1M cacodylate 버퍼에 세 번 5 분 각각, 린스. </li><li> 1.5 % (W / V) 30 분 0.1 M cacodylate 버퍼 (0.1 M, pH를 7.4)에 칼륨 ferrocyanide 1 % (W / V) 오스뮴의 tetroxide로 얼룩. </li><li> 30 분 0.1M cacodylate 버퍼에서 1.0 % (W / V) 오스뮴의 tetroxide로 얼룩. </li><li> 3 분 두 번 증류수로 한번 헹구어. </li><li> 1퍼센트 (W / V) 30 분 더블 증류수에 uranyl 아세테이트와 청바지. </li><li> 등급 알코올 시리즈 2 분 각 변경 (1 X 50 %, 1 X 70 %, 1 X 90 %, 1 X 95%, 2 X 100 %)에서 탈수 후 두 번 증류수로 5 분 섹션을 씻어합니다. </li><li> 70 %, 90 %, 95% 후 100 % : 에탄올의 50 % Durcupan에서 시작 에탄올과 혼합 Durcupan 수지, 각각의 변화 30 분, 증가 농도에 임베드 다음 다음. </li><li> 신선한 Durcupan로 교체하고 4 시간 동안 천천히 선동. </li><li> 플레이스 섹션, 금형 분리 요원과 함께 코팅하고, 65 곳에 유리 현미경에 나무 칵테일 스틱을 사용하여 슬라이드 24 시간 동안 ° C 오븐. </li></ol> 2. 동기 / SEM에 대한 샘플을 준비 <ol start="11"><li> 두 유리 현미경 슬라이드 사이에서 샘플을 포함, 수지 층을 분리하고 에이전트를 분리하는 곰팡이를 제거하는 완전히 씻으십시오. </li><li> 낮은 전력 목표와 전송 가벼운 현미경을 사용하거나, 수지의 단면 내에서 관심 영역을 식별하는, 전송 조명과 현미경을 해부. </li><li> 면도날을 사용하여 관심 지역의 주위에 사각형 소형 (3mm X 3mm)을 잘라 아크릴 접착제로 빈 수지 블록 (그림 1)의 상단에 넣어 둬요. 다음 단계로 진행 후 강화하는 접착제에 대한 5 분 기다려합니다. </li><li> ulramicrotome의 소유자로 블록을 고정하고, 첨부된 stereomicroscope를 사용하여 재료 남아의 단지 작은 피라미드까지 면도날과 관심의 주변 지역 장식. </li><li> 또한 관심의 영역이 정확하게와 관련하여 블록의 표면 (그림 1)의 크기를 찾을 수 있도록 ultramicrotome에 고정 유리 칼을 사용하여 블록을 잘라. 블록 중 하나 가장자리를 잘라 수직 단계는 (그림 1 및 2) 샘플을 통해 절단 있도록 관심있는 지역에 인접해 있습니다. 이 단계는 이미징 얼굴 (그림 2)을 형성한다. </li><li> 전송 가벼운 현미경을 사용하여 ultramicrotome 및 사진 블록 내에서 관심있는 지역에서 블록을 제거합니다. </li><li> 나머지 수지 스텁 멀리 손질 블록을 잘라 버릴거야. 이것은 보석의보고를 사용하여 수행되며 작은 블록이 동기 / SEM 안에는 것을 보장합니다. 이 블록의 총 높이가 5mm 이상해서는 안됩니다. </li><li> 몇 군데되는 측면이 바깥쪽 가장자리 (그림 1)에 있도록 탄소 붙여넣기와 알루미늄 스텁에 접착제가 블록. </li><li> 접착제가 마른 후, 황금의 얇은 층 (&gt; 20 NM, 크레싱턴 진공 증발 시스템)과 함께 코트 블록을. </li></ol> 3. 동기 / SEM의 영상 <ol start="20"><li> 낮은 배율에서, 그리고 관심과 블록의 측면의 선택 영역이 몇 군데 수 있도록 보조 전자 이미징 (5 KV, 0.5 nAmp), 동양 블록을 사용하여 (그림 2 C, D) 연산자에 직면하고 있습니다. </li><li> 동양 얼굴이 몇 군데 수 있도록 블록 밀링 빔에 평행하게 놓여 있습니다. 이것은 전자빔이 얼굴에 54 ° (그림 2 B)에서 지향을 의미합니다. </li><li> 13 현재 이온 빔 사용 - 30 KV에서 27 nAmps 것은 몇 군데로 지역의 정면에서 수지의 좁은 밴드를 제거합니다. </li><li> 관심 지역을 overlies 가공된 얼굴을 볼 수 backscattered 이미징 모드로 전환합니다. </li><li> (그림 2) 가공된하고 몇 군데로 구역에서 정확한 지역을 찾아 빛을 현미경 참고 이미지 (단계 16 촬영)와 가공된 얼굴의 이미지를 사용합니다. </li><li> 관심 지역 (그림 2) 위의 블록의 표면에, 현미경의 가스 주입 시스템을 사용하여 탄소 (또는 금속)의 보호 계층 (약 1 미크론 두께)를 입금. </li><li> 700 picoAmps, 잘게 밀 최종 이미지가 촬영되는 시간 블록의 영역의 전류를 사용합니다. </li><li> 완전히 밀이 이미지의 얼굴을 더 밀링 유물이 얼굴에 볼 수 없습니다까지로 밀링 광선을 둡니다. 얼굴의 전체 공장은보기의 전체 분야에 걸쳐 각 후속 이미지의 변화를 관찰하여 검사합니다. 부적 절한 밀링도 vertica을 나타나는 흰색 줄무늬 또는 '커튼'로 볼 수 있습니다베드로 이미지 인치 </li><li> 분산 어떤 온도 변화에 대한 최소 2 시간 현미경을 둡니다. 이것은 블록 얼​​굴 고르지 이미지 결과 이​​미징 동안 드리프트 것이라는 위험을 줄여줍니다. </li><li> 얼굴을 순차적으로 영상에 대한 현미경 매개 변수를 선택합니다. 전자빔은 블록 얼​​굴 소재의 매우 얕은 깊이에만 이미지를 충분히 낮은 전압을 가지고 있는지 확인합니다. 이것은 제거할 수있는 얼굴의 두께보다 훨씬 얕은해야합니다. 이미지에 대한 일반적인 매개 변수는 1.2 사이의 전압 있습니다 - 사이의 픽셀 크기 2.0 KV 4-20 NM. 픽셀 밀 얼굴을하고 하나의 이미지를 얻기위한 총 시간 (그림 3) 이분 아래에 유지되도록 10 μsecs 주위 보관 시간 요구를 머물러. </li></ol> 4. 성공의 비밀 단계 1) 샘플을 150 마이크론 이상의 두께되지 않습니다 확인하십시오. 이것은 물질에 다른 얼룩과 수지의 적절한 삽입을 가능하게합니다. 이것은 바로 고정 후 vibratome와 함께 샘플을 sectioning하여 얻을 수 있습니다. 이 두께는 뇌 조직에 적합합니다. 다른 조직은 적절한 고정과 얼룩을 보장하기 위해 테스트해야합니다. 단계 3) 샘플은 자유롭게 솔루션 전반에 걸쳐 분산,이 보조 정착액가 소개되는 동안 유리병의 한 부분에 함께 clumped 안해야합니다. 이것은 샘플의 최대 침투를 보장하고이 고정 과정에서 왜곡되는 샘플을 줄일 수 있습니다. 이것은 부드럽게 솔루션에 추가됩니다 즉시 유리병 내에 샘플을 소용돌이 치는 의해 이루어진다. 단계 15) 관심의 영역이 (&lt;30 미크론) 이하 바로 블록의 표면에 위치하고 있는지 확인하십시오. 이것은 이미지 수집 단계 중 이온 빔에 의해 밀링의 양을 줄일 수 있습니다. 단계 22) 이온 빔의 스캔 시간은 전체 영상 얼굴이 완전히 가공된 것을 보장하기 위해 adequte해야합니다. 부적 절한 밀링은 이미징 얼굴 아래로 수직으로 나타나는 흰색 줄무늬, 또는 '커튼'으로 표시됩니다. 단계 26) 최종 가공된 얼굴이 몇 군데있는 얼굴보다 큰해야합니다. 가공된 수지가 바로 근처에있는 블록 표면에 블록과 redeposits에서 나옵니다 때문입니다. 이 redeposition은보기의 이미지 필드에 잠식 수 있고, 몇 군데보다 훨씬 넓은 지역을 밀링에 의해 피할 수있다. 20 미크론 폭 이미지 창은 가공된 블록 얼굴은 30 마이크론 넓이보다 큽니다. 단계 29) 전자빔 매개 변수는 이미지 블록의 표면의 단지 처음 몇 나노미터에서 나오는 전자에 의해 생성되는 그러한 것을 중요 좋습니다. 이 2 KV 아래에 전압을 최소화되며 전자는 너무 멀리 침투하지 않는함으로써 acheved. 이것은 또한 높은 에너지와 단지 전자 최종 이미지에 기여하는 것을 너무 탐지기에 그리드 전압을 사용하여 도왔다는. 일반적으로, 1.3 KV의 그리드 장력은 1.5 KV의 영상 전압에 사용됩니다. 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 수지 블록의 준비.) 수지 steromicroscope에서 볼 성인 쥐 두뇌를 통해 코로나 섹션 (80 미크론 두꺼운)을 내장. 이미지가 명확하게 메스 블레이드를 사용하여 섹션 (B)에서 컷 수있는 서로 다른 뇌 영역을 보여줍니다. 여기 피질에서 1mm 광장이 제거되고 (C). D) 수지 블록이 다음 ultramicrotome에 탑재 유리 나이프로 손질하고, 일단 블록이 유일한을 떠날 감소되었습니다 빈 수지 블록에 붙어있다 관심 지역은 (E) 단계 F)가. 포함된 소재의 전면 표면에 수직 절단이 전체 손질 지역은 다음 수지의 나머지 부분에서 절단되며에서 알루미늄 금속 코팅 준비 스텁 및 이미징에 탑재 전자 현미경을 검사합니다. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2.가.) 동기 / SEM 영상을위한 블록의 얼굴을 준비하고 B) 블록과 이미징 얼굴 (검은 머리 이중 화살표로 표시) 만들기 가공된있는 가장자리에 그림을 표시합니다. 이온 빔 (흰색)의 위치는 이미징 얼굴에 평행하게 표시됩니다, 그리고 전자빔 (회색)가 이온 빔 54 °에서 얼굴을 때리는가 표시됩니다. C)이 전자빔로 촬영한 블록의 전경을 보여줍니다 그리고 이차 전자와 함께 몇 군데. 블록의 측면을 따라 어두운 지역 (점선 흰색 상자로 표시) 약 가공된되었습니다 얼굴의 일부를 보여줍니다 (이중 머리로 표시에드 검은색 화살표)는 기본 샘플을 공개합니다. D)이 지역에만 backscattered 전자를 사용하여 몇 군데 때 내장 조직 볼 수 있습니다. 여기는 임베디드 조직 섹션의 전체 너비는 이중 달린 흰색 화살표로 표시됩니다. C 규모 표시줄) 100 미크론이다. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 등방성 voxels과 뇌 조직의 이미징은 볼륨.) 쥐 두뇌의 영역 내에서 ultrastructure를 보여주는 블록의 얼굴 대조 backscattered 이미지를 레버 스드. 모든 점막이 표시뿐만 아니라 대형 macromolecular 구조입니다. B) 1600 이미지 전체가 등방성 voxels. C)이 스택이 동일한 해상도를 가진 비행기로 몇 군데 수있는 이미지 스택의 결과 5 nm의 간격에서 수집되었다. 이 이미지는 XY 평면과 yz 평면에 몇 군데있다 단일 시냅스 연결을 보여줍니다.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

관심의 영역이 너무 크게하지 않을 때 동기 / SEM의 기술은 최적의 작동합니다. 몇 군데 볼륨에 대한 상한은 이온 빔 및 지역에 따라 그런거야 많은 시간 동안 반복적으로 일관 밀 수 있습니다. 지금까지이 60 주변 X 60 미크론의 영역 완료되었습니다 그러나, 영상이 전체 면적은 적합한 이미지 해상도와 같은 큰 이미지를 수집 시간 요소를 주로 인해 불가능합니다. 예를 들어, 픽셀과 4 kx 4 K 이미지 10 마이크로초 시간 2 분 취득 40 초가 걸릴 것입니다, 60 미크론의보기의 필드에이 단 15 NM의 픽셀 크기를 줄 것입니다 머물러. 이미징 세포와 조직의 ultrastructure 들어, 작은 픽셀 크기가 더 적합하다, 일반적으로 4 십 nm의 / 픽셀 사이. 현미경이 기능을했다하더라도 60 X 60 미크론의 영역에 대한 이미지가 10 시간 내에 취득 것입니다. 이러한 이유로, 현미경은 10 × 10 × 10 미크론, 또는 전체 세포의 중요한 영역의 순서로 이미지 볼륨에 이상적인 도구입니다. 이것은 쉽게이 절차와 잘 대비 아르 샘플에서 48 시간 기간 내에 할 수 있습니다. 지금까지 프로토콜은 뇌 조직뿐만 아니라 coverslips을 준수하는 교양 포유 동물 세포의 다양한 유형을 중심으로 사용되고 있습니다. 그러나, 고정 및 얼룩 절차는 동일하게 잘 대비 이미지 스택을 생산하는 식물을 포함한 생물 학적 물질의 많은 다른 유형과 함께 사용할 수 있습니다. 따라서이 기술의 주요 장점은 등방성 voxels와 이미지 볼륨의 용량입니다. 이런 종류의 이미지 스택은 스택에 비행기에서 촬영한 이미지를 사용하여 3D 볼륨의 분석을 위해 수 있습니다. 이 혜택은 모든 방향에서 이미지 시리즈와 큰 이미지를 세부 (그림 3)을 제공하는 이미지 기능 감시자를 허용하는 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Cyanoacrylate 접착제 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 해부 현미경 : Leica MZ8 </td><td> Leica 이크로 시스템즈, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan 수지 </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td></td></tr><tr><td> 동기 / SEM 현미경 (자이스 혈구, NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 조직학 슬라이드 </td><td> 멘젤 - 글레이저, 독일 </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> 유리 나이프 메이커 : Leica EM KMR2 </td><td> Leica 이크로 시스템즈, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 섬광 튜브 (20ml) </td><td> EMS, 미국 </td><td> 72,634 </td></tr><tr><td> 글루 타 알데히드 </td><td> EMS, 미국 </td><td> 16,222 </td></tr><tr><td> 쥬얼리의 본 </td><td> EMS, 미국 </td><td> 72,010 </td></tr><tr><td> 몰드 분리 에이전트 </td><td> Glorex, 스위스 </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> 오스뮴의 tetroxide </td><td> EMS, 미국 </td><td> 19,110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMS, 미국 </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> 인산염 버퍼에 대한 인산 염 </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td> 71642 및 71496 </td></tr><tr><td> 나트륨 cacodylate </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td> 20,840 </td></tr><tr><td> 골드 목표로 Coater의 스퍼터 </td><td> 크레싱턴, 미국 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 (TBS) </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome : Leica UCT </td><td> Leica 이크로 시스템즈, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl 아세테이트 </td><td> EMS, 미국 </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

이 프로토콜은 방법을 생물 학적 샘플, 뇌 조직처럼 초점을 맞춘 이온 빔 / 스캐닝 전자 현미경 (동기 / SEM)을 사용하여 3 차원에 몇 군데 수 있습니다 설명합니다. 샘플은 오스뮴의 tetroxide와 uranyl 아세트산을 사용하여 aldehydes, 중금속 묻은로 고정됩니다. 그들은 알코올로 다음 건조하고 다음 강화된있다 수지와 침입. 가벼운 현미경 유리 나이프와 ultramicrotome를 사용하여 표면에 가까운 영역이자를 포함하는 작은 블록이 이루어집니다. 블록은 다음 동기 / SEM 안에 배치하고, 이온 빔 가까운이 지역에, 블록의 한쪽을 따라 약 밀 수직 얼굴을하는 데 사용됩니다. 이미지 기본 구조를 backscattered 전자를 사용하여 작은 얼굴은 다음 미세한 이온 빔을 가공된하고 표면은 몇 군데와 가공된 수 얼굴의 정확한 지역을 파악하기 위해보다 긴밀하게 시시콜콜 따지는 것입니다. 현미경의 매개 변수는 다음 시리얼 이미지 블록의 볼륨을 통해 수집되도록 얼굴이 반복적으로 가공된하고 몇 군데되도록 설정되어 있습니다. 이미지 스택은 일반적으로 각 방향으로 작은 4 NM 같은 크기로 등방성 voxels이 포함됩니다. 모든 이미지 비행기에서 본 이미지 품질은 사용자가 이미지 스택 내의 모든 시야각에서 셀 ultrastructure을 분석 수 있습니다.

이 프로토콜은 수지 내장 뇌 조직은 전자 현미경을 스캐닝, 초점을 맞춘 이온 빔의 3 차원에 준비하고 몇 군데 수있는 방법에 대해 설명합니다.

본 프로토콜은 뇌 조직과 같은 생물학적 시료를 집속 이온 빔/주사 전자...를 사용하여 3차원으로 이미징하는 방법을 설명합니다.

본 절차의 목적은 집속 이온 빔(focused ion beam)과 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 뇌 조직의 특정 영역에서 연속 이미지를 수집하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뇌를 슬라이스로 절단한 후 염색하고 레진에 매립합니다. 두 번째 단계로는 매립된 뇌 절편에서 관심 영역을 절단하여 빈 레진 블록에 장착하는 과정을 수행합니다.세 번째 단계는 울트라 마이크로톰(ultra microtome)으로 레진 블록을 다듬고, 현미경의 이온 빔을 사용하여 이미징할 영역만 분리하는 것입니다. 마지막 단계는 이온 빔을 사용하여 이미지를 촬영하기 전 얇은 층을 반복적으로 제거함으로써 레진 블록의 단면을 연속적으로 이미징하는 것입니다. 최종적으로, 관심 영역을 통과하는 연속 이미지를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이미지 시리즈는 자동으로 수집되며, 데이터셋은 일반적으로 등방성 복셀(isotropic voxels)을 가지므로 스택 내의 이미지 구조를 어느 각도에서나 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 직렬 절편 투과 전자 현미경(serial section transmission electron microscopy)과 같은 기존 방법보다 훨씬 더 높은 Z 해상도를 달성할 수 있다는 점입니다. 또한, 전자 토모그래피(electron tomography)와 비교했을 때, 수지 임베딩 샘플에 대해 최적의 해상도로 훨씬 더 넓은 부피를 이미징할 수 있습니다.절차는 마취 후 관류시킨 쥐의 고정된 뇌를 적출하는 것으로 시작합니다. 뇌를 플라스틱 몰드에 담긴 따뜻한 5% aeros에 매립하고, aeros가 굳기 전에 뇌를 올바른 각도로 조정합니다. 뇌가 포함된 aeros 블록을 진동 절편기(vibrato slice)의 샘플 홀더에 장착합니다. 80 micron 두께의 관상면 절편(coronal sections)을 생성하며, 관심 영역이 포함될 수 있도록 필요한 만큼 충분한 수의 절편을 절단합니다.다음으로 시료를 20 milliliter 유리 절연 바이알에 넣습니다. 바이알당 최대 10개의 섹션을 넣으십시오. 0.1 molar K coate 완충액으로 시료를 5분씩 3회 헹굽니다.그런 다음 0.1 M K cacodylate 완충액에 포함된 1.5% potassium cyanide와 1% osmium tetroxide로 샘플을 30분 동안 염색합니다. 이어서 0.1 M K cacodylate 완충액에 포함된 1% osmium tetroxide로 샘플을 30분 동안 추가 염색합니다. 그 후 이중 증류수로 3분 동안 한 번 헹궈낸 다음, 이중 증류수에 포함된 1% al acetate로 30분 동안 염색합니다.다음으로, 절편을 2회 증류수로 5분 동안 헹군 후, 농도별 알코올 시리즈로 각 단계마다 2분씩 탈수시킵니다. 다음 단계는 알코올과 혼합된 Duran resin의 농도를 점차 높여 절편을 포매하는 것이며, 각 교체 단계 사이에 30분을 둡니다. 에탄올과 resin의 비율을 50:50으로 시작하여, 30:70, 10:90 순으로 진행하고, 마지막으로 절편을 100% resin에 30분 동안 둡니다.그 다음 배지를 100% 신선한 duran resin으로 교체합니다. 롤러 믹서에서 1시간 동안 천천히 교반합니다. 포매 후에는 나무 칵테일 스틱을 사용하여, 미리 몰드 분리제가 코팅된 유리 현미경 슬라이드 위에 절편을 배치합니다.슬라이드에 가능한 한 많은 섹션을 올리되, 슬라이드가 너무 붐비지 않도록 주의하십시오. 현미경 슬라이드 사이에 식별 라벨이 배치되었는지 확인하십시오. 슬라이드를 65 °C 오븐에 24시간 동안 보관하십시오.다음 날, 오븐에서 샘플을 꺼냅니다. 면도날을 유리 현미경 슬라이드 사이에 조심스럽게 밀어 넣고, 손가락으로 레진 층을 잡은 상태에서 슬라이드 사이에서 샘플이 포함된 레진 층을 제거합니다. 흐르는 물에 샘플을 부드럽게 세척합니다.몰드 분리제를 제거하기 위해, 저배율 대물렌즈와 투과 조명이 갖춰진 실체 현미경 아래에 시료를 놓습니다. 미세 바늘을 사용하여 관심 영역을 표시합니다. 면도날을 이용해 관심 영역 주변으로 3 mm × 3 mm 크기의 작은 정사각형으로 절단합니다.아크릴 접착제를 사용하여 작은 레진 블록을 공백 레진 블록의 상단에 부착합니다. 다음으로, 울트라 마이크로톰의 홀더에 블록을 고정합니다. 부착된 실체 현미경을 통해 관찰하면서, 면도날을 사용하여 관심 영역 주변을 다듬어 재료가 작은 피라미드 형태로만 남을 때까지 깎아냅니다.울트라 마이크로톰에 고정된 유리 나이프를 사용하여 블록의 상단 표면에 대해 각도를 주어 관심 영역에 가깝게 블록의 가장자리를 절단합니다. 블록 표면의 치수를 기준으로 관심 영역을 정확하게 위치시킬 수 있도록 블록을 추가로 다듬습니다. 울트라 마이크로톰에서 블록을 분리하여 투과광 현미경 아래에 놓습니다.관심 영역을 촬영합니다. 보석용 톱을 사용하여 트리밍된 블록을 카본 페인트가 도포된 나머지 레진 스터브에서 절단하여 분리합니다. 분리된 SA 블록을 SEM 샘플 홀더에 부착하고, 이미징할 면이 가장 바깥쪽 가장단을 향하도록 배치합니다.접착제가 건조되면, 준비물을 크레센트 및 진공 증착 시스템으로 옮겨 블록 표면에 20 nanometers 이상의 얇은 금 층을 코팅합니다. 이제 레진에 매립된 조직 블록을 집속 이온 빔 주사 전자 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다. 샘플을 홀더에 끼워 현미경에 넣고 저배율에서 이차 전자 이미징을 사용하여, 관심 영역과 이미징할 블록 면이 정면을 향하도록 블록의 방향을 조절하십시오.작업자는 이미징할 면이 밀링 빔과 평행하도록 블록을 방향 설정합니다. 이렇게 하면 13에서 27 nano amps의 이온 빔 전류를 사용하여 전자 빔이 이 면에 대해 54도 각도로 정렬됩니다. 전압은 30 kilovolts로 설정합니다.이미징할 영역의 전면에서 좁은 띠 모양의 레진을 제거합니다. 다음으로, 후방 산란 이미징 모드로 전환하여 관심 영역 위에 위치한 밀링된 면을 관찰합니다. 앞서 촬영한 광학 현미경 참조 이미지와 밀링된 면의 이미지를 사용하여, 현미경의 가스 분사 시스템을 통해 블록에서 밀링 및 이미징을 수행할 정확한 영역을 찾습니다.700 picoamps의 전류를 사용하여 관심 영역 상단의 블록 표면에 약 1 micron 두께의 탄소 또는 금속 보호층을 증착합니다. 마지막으로, 최종 이미지를 촬영할 블록 영역을 밀링합니다. 표면에 밀링 아티팩트가 더 이상 보이지 않을 때까지 밀링 빔으로 이 이미지 면을 완전히 밀링하십시오.표면의 연속 이미징을 위한 현미경 파라미터를 설정하십시오. 일반적인 파라미터는 전압 1.2~2 kV, 픽셀 크기 4~20 nm입니다. 표면을 밀링하고 이미지 한 장을 획득하는 데 걸리는 총 시간이 2분 미만이 되도록 픽셀 체류 시간(dwell time)은 약 10 µs로 설정해야 합니다.현미경의 열적 변화가 안정될 수 있도록 최소 2시간 동안 그대로 둡니다. 이후 밀링 및 이미징 프로세스를 시작하여 관심 영역의 연속 이미지를 획득합니다. 이 그림은 랩 브레인(wrap brain) 영역 내의 초미세 구조를 보여주는 블록 표면의 역대조 후방 산란 이미지를 나타냅니다.모든 막과 거대 분자 구조가 관찰됩니다. 이 그림은 5 nm 간격으로 수집된 총 1,600장의 이미지로 구성되어 있으며, 이를 통해 등방성 복셀을 가진 이미지 스택이 생성되었습니다. 이 스택은 동일한 해상도로 모든 평면에서 이미징이 가능합니다.이 영상을 시청하신 후에는 focused ion beam scanning electron microscope를 이용한 연속 이미징을 위해 뇌 조직을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

뉴런 축삭돌기와 수상돌기를 나타내는 쥐 피질 뇌 조직의 고정된 부분을 취합니다. 수상돌기는 축삭돌기와 함께 시냅스를 형성하는 수지상 가시로 알려진 돌출부를 가지고 있습니다. 지질에 결합하는 오스뮴-페로시아나이드로 조직을 배양한 다음, 이미징을 위한 구조적 대비를 향상시키는 또 다른 오스뮴 적용을 수행합니다. 거대분자에 결합하고 대비를 향상시키는 중금속 화합물로 얼룩이 있습니다. 수지 포매를 위해 알코올 농도를 증가시켜 탈수합니다. 티슈를 레진에 삽입하고 홀더에 장착한 다음 금으로 코팅하여 이미징 품질을 최적화합니다. 3차원 이미징을 위해 집속 이온 빔 주사 전자 현미경을 사용합니다. 이온 빔을 사용하여 수지가 내장된 조직의 얇은 층을 제거하여 이미징 표면을 노출시킵니다. 노출된 표면에 전자빔의 초점을 맞추고 후방 산란된 전자를 검출하여 이미지를 생성합니다.  연속 슬라이싱 및 이미징을 수행하고 3차원 이미지를 재구성하여 구문으로 연결된 피질 신경 네트워크를 드러냅니다.

Synaptically Linked Neuron의 3D 재구성을 위한 Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy

이 비디오는 주사 전자 현미경(SEM)과 투과 전자 현미경(TEM)의 요소를 결합하여 고해상도 이미지를 생성하는 기술인 대규모 주사 투과 전자 현미경(STEM)을 사용하여 제브라피시 유충의 뇌 손상을 조사하는 방법을 보여줍니다. 뇌 손상을 식별하기 위해 샘플을 준비하고 고해상도 STEM 이미지를 획득하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

Investigating a a Zebrafish Larval Brain Injury Using Large-Scale Scanning Transmission Electron Microscopy(대규모 주사 투과 전자 현미경을 사용한 제브라피시 유충 뇌 손상 조사)

대규모 2D 전자 현미경(EM) 또는 나노토미는 나노 단위 해상도 EM의 조직 전체 응용 분야입니다. 여기에서는 제브라피시 유충의 뇌의 건강과 비침습적 뇌 손상을 조사하기 위해 적용되는 보편적인 나노절개술 방법을 설명합니다.

건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

포유류 뇌 조직에서 미토콘드리아 시각화 및 분석은 어려운 작업입니다. 여기에서는 연속 블록면 주사 전자 현미경(SBFSEM)의 3차원(3D) 재구성 분석을 사용하여 이 중요한 에너지 생성 소기관의 형태학적 및 체적 분석에 대한 통찰력을 얻는 방법을 설명합니다.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

여기서, 우리는 관심 있는 지역을 표적으로 하기 위하여 직렬 블록 면 및 집중된 이온 광선 주사 전자 현미경 을 능등하게 결합하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 3차원으로 효율적으로 검색하고 넓은 시야에서 드문 이벤트를 찾을 수 있습니다.

직렬 블록 얼굴 및 집중된 이온 빔 검사 전자 현미경 검사법을 사용하여 표적으로 한 연구 결과

우리는 나노 아키텍처를 피질 내 미세 전극 장치로 에칭하면 염증 반응을 감소시킬 수 있으며 전기 생리학적 기록을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 본 명세서에 기재된 방법은 나노-아키텍처를 비기능적이고 기능적인 단일 생크 실리콘 의 표면에 에칭하는 접근법을 설명한다.

마이크로 전극에 에칭 나노 아키텍처에 초점을 맞춘 이온 빔 리소그래피

여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

이 워크플로우는 극저온 삼중 일치 이미징 플랫폼을 사용하여 작고(축 범위 &lt;1μm) 희귀한(세포당 1개 사본) 형광 표지된 생물학적 구조를 표적으로 하는 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 스캐닝 전자 현미경을 단일 초점 위치에 통합하고 밀링 중 동시 형광 현미경을 가능하게합니다.

세포의 표적 밀링을 위한 극저온 일치 형광, 전자 및 이온빔 현미경을 사용한 워크플로

우리는 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 새로운 영상 기술을 도입했는데, 이는 뇌 표본의 모든 세포를 중간 규모에서 편향 없이 촬영할 수 있게 하며, 동일한 샘플에 대한 테이프 기반 직렬 주사 전자현미경의 영상 워크플로우에 원활하게 통합할 수 있게 합니다.

중간경적 전세포 뇌 지도화를 위한 주사 전자현미경 호환 광학 영상 방법

학습하세요 초점을 맞춘 이온 빔 주사 전자 현미경을 이용한 뇌 조직의 3차원 고해상도 이미징 방법을. 레진 포매된 뇌 샘플에서 연속 이미지를 수집하여 뇌 조직 구조를 정밀하게 분석할 수 있습니다.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

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