초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

본 절차의 목적은 집속 이온 빔(focused ion beam)과 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 뇌 조직의 특정 영역에서 연속 이미지를 수집하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뇌를 슬라이스로 절편화한 후 염색하고 수지(resin)에 매립합니다. 두 번째 단계는 매립된 뇌 절편에서 관심 영역을 잘라내어 빈 수지 블록에 장착하는 것입니다.

세 번째 단계는 울트라 마이크로톰(ultra microtome)으로 레진 블록을 다듬고, 현미경의 이온 빔을 사용하여 이미징할 영역만 분리하는 것입니다. 마지막 단계는 이온 빔을 사용하여 각 이미지를 촬영하기 전에 얇은 층을 반복적으로 제거함으로써 레진 블록의 한 면을 연속적으로 이미징하는 것입니다. 결과적으로 관심 영역을 통과하는 연속 이미지를 얻을 수 있습니다.

이미지 시리즈는 자동으로 수집되며, 데이터셋은 일반적으로 등방성 복셀(isotropic voxels)을 가지므로 스택 내의 이미지 구조를 어느 각도에서나 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연속 절편 투과 전자 현미경(serial section transmission electron microscopy)과 같은 기존 방법보다 훨씬 더 높은 Z 분해능을 달성할 수 있다는 것입니다. 또한 전자 토모그래피(electron tomography)와 비교했을 때, 수지 임베딩 시료에 대해 최적의 분해능으로 훨씬 더 큰 부피를 이미징할 수 있습니다.

먼저 마취 후 관류 고정된 쥐의 뇌를 적출하는 것으로 절차를 시작합니다. 뇌를 플라스틱 몰드에 담긴 따뜻한 5% aeros에 매립하고, aeros가 굳기 전에 뇌를 정확한 각도로 조정합니다. 뇌가 포함된 aeros 블록을 vibrato slice 샘플 홀더에 장착합니다. 80 micron 두께로 관상 단면을 절단하며, 관심 영역이 포함될 때까지 필요한 만큼의 절편을 제작합니다.

다음으로 샘플을 20 milliliter 유리 절연 바이알에 넣습니다. 바이알당 최대 10개의 섹션을 넣습니다. 0.1 molar K coate buffer로 5분씩 세 번 샘플을 헹굽니다.

그 다음 0.1 M K coate 완충액에 포함된 1.5% potassium cyanide와 1% osmium tetroxide로 샘플을 30분 동안 염색합니다. 이어서 0.1 M K coate 완충액에 포함된 1% osmium tetroxide로 샘플을 30분 동안 추가 염색합니다. 이후 2회 증류수로 3분 동안 한 번 헹군 다음, 2회 증류수에 포함된 1% al acetate로 30분 동안 염색합니다.

다음으로, 절편을 2회 증류수로 5분 동안 헹군 후, 각 단계별로 2분씩 소요하며 단계별 알코올 시리즈로 탈수시킵니다. 다음 단계는 알코올과 혼합된 Duran resin의 농도를 높여가며 절편을 포매하는 것이며, 각 단계 사이에 30분의 간격을 둡니다. 에탄올과 resin의 비율을 50:50으로 시작하여, 30:70, 10:90 순으로 진행하고, 마지막으로 절편을 100% resin에 30분 동안 둡니다.

그 다음 배지를 100% 신선한 duran resin으로 교체합니다. 롤러 믹서에서 1시간 동안 천천히 교반합니다. 포매 후, 나무 칵테일 스틱을 사용하여 이형제가 미리 도포된 유리 현미경 슬라이드 위에 절편을 배치합니다.

슬라이드에 가능한 한 많은 섹션을 올리되, 슬라이드가 너무 붐비지 않도록 주의하십시오. 현미경 슬라이드 사이에 식별 라벨이 배치되었는지 확인하십시오. 슬라이드를 65 °C 오븐에 24시간 동안 보관하십시오.

다음 날, 오븐에서 샘플을 꺼냅니다. 면도날을 유리 현미경 슬라이드 사이에 조심스럽게 밀어 넣고, 손가락으로 레진 층을 잡은 상태에서 슬라이드 사이에서 샘플이 포함된 레진 층을 제거합니다. 흐르는 물에 샘플을 부드럽게 세척합니다.

몰드 분리제를 제거하기 위해, 저배율 대물렌즈와 투과 조명을 사용하는 해부 현미경 아래에 샘플을 놓습니다. 미세 바늘로 관심 영역을 표시합니다. 면도날을 사용하여 관심 영역 주변으로 3 mm × 3 mm 크기의 작은 정사각형을 절단합니다.

아크릴 접착제를 사용하여 작은 수지 블록을 공백 수지 블록 상단에 부착합니다. 다음으로, 울트라 마이크로톰의 홀더에 블록을 고정합니다. 부착된 실체 현미경을 통해 관찰하며, 면도날을 사용하여 관심 영역 주변을 다듬어 재료가 작은 피라미드 형태로만 남을 때까지 절삭합니다.

울트라 마이크로톰에 고정된 유리 나이프를 사용하여 블록의 상단 표면과 각도를 이루도록 관심 영역에 가깝게 블록 가장자리를 절단하십시오. 블록 표면의 크기에 맞춰 관심 영역을 정확하게 위치시킬 수 있도록 블록을 더 세밀하게 다듬으십시오. 울트라 마이크로톰에서 블록을 분리하여 투과광 현미경 아래에 놓으십시오.

관심 영역을 촬영합니다. 보석용 톱을 사용하여 트리밍된 블록을 카본 페인트가 칠해진 나머지 레진 스터브로부터 잘라냅니다. 분리된 SA 블록을 SEM 샘플 홀더에 부착하고, 이미징할 면이 가장 바깥쪽 가장단을 향하도록 방향을 잡습니다.

접착제가 건조되면, 시편을 크레센트 및 진공 증착 시스템으로 옮겨 블록 표면을 20 nanometers 이상의 얇은 금 층으로 코팅합니다. 이제 레진에 매립된 조직 블록을 집속 이온 빔 주사 전자 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다. 샘플 홀더에 고정된 시편을 저배율에서 현미경 내로 삽입하고, 이차 전자 이미징을 사용하여 관심 영역과 이미징할 블록의 측면이 정면을 향하도록 블록의 방향을 조절합니다.

작업자는 이미징할 면이 밀링 빔과 평행하도록 블록을 배치합니다. 이렇게 하면 13에서 27 nA의 이온 빔 전류와 30 kV의 전압을 사용하여 전자 빔이 해당 면에 대해 54도 각도로 정렬됩니다.

이미징할 영역의 전면부에서 좁은 띠 모양의 레진을 제거합니다. 다음으로, 관심 영역 위에 위치한 밀링된 면을 관찰하기 위해 후방 산란 이미징 모드로 전환합니다. 이전에 촬영한 광학 현미경 참조 이미지와 밀링된 면의 이미지를 사용하여, 현미경의 가스 주입 시스템을 이용해 밀링 및 이미징을 수행할 블록 상의 정확한 영역을 찾습니다.

700 picoamps의 전류를 사용하여 관심 영역 상단의 블록 표면에 약 1 micron 두께의 탄소 또는 금속 보호층을 증착합니다. 마지막으로, 최종 이미지를 촬영할 블록 영역을 밀링합니다. 표면에 밀링 아티팩트가 더 이상 보이지 않을 때까지 밀링 빔으로 이 이미지 면을 완전히 밀링하십시오.

표면의 연속 이미징을 위한 현미경 파라미터를 설정하십시오. 일반적인 파라미터는 전압 1.2~2 kV, 픽셀 크기 4~20 nm입니다. 표면을 밀링하고 이미지 하나를 획득하는 데 걸리는 총 시간이 2분 미만이 되도록 픽셀 dwell time은 약 10 µs로 설정해야 합니다.

열적 변화가 안정될 수 있도록 현미경을 최소 2시간 동안 그대로 둡니다. 그 후, 관심 영역의 연속 이미지를 획득하기 위해 밀링 및 이미징 프로세스를 시작하여 열을 방출시킵니다. 이 그림은 랩 브레인(wrap brain) 영역 내의 초미세 구조를 보여주는 블록 표면의 역대조 후방 산란 이미지를 나타냅니다.

모든 막과 거대 분자 구조가 관찰됩니다. 이 그림은 5 nm 간격으로 수집된 총 1,600장의 이미지로 구성되어 있으며, 그 결과 등방성 복셀(isotropic voxels)을 가진 이미지 스택이 생성되었습니다. 이 스택은 동일한 해상도로 어느 평면에서든 이미징이 가능합니다.

이 영상을 시청하신 후에는 집속 이온 빔 주사 전자 현미경을 이용한 연속 이미징을 위해 뇌 조직을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.