광학 투명 인듐 틴 산화물 전극에 Patterning 셀

안녕하세요, 저는 Isha입니다. Zen 박사님 연구실의 석박사 통합과정 2년 차 학생입니다. 저희는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스의 의생명공학과에 있습니다.

오늘은 미세 가공된 광학적 투명 Indium 10 oxide 전극 상의 이온 제어 방법을 보여드리겠습니다. 조직 공학 및 재생 분야에서는 장기의 미세 환경을 모사하기 위한 노력이 이어져 왔습니다. 이러한 미세 환경을 인비트로(in vitro)로 구현하기 위해서는 기판 위에서 세포를 공간적, 시간적으로 분리하는 것이 필수적입니다. 저희는 서로 다른 간세포 유형의 위치를 제어할 수 있는 표면을 설계하는 것에 관심을 두고 있습니다.

오늘의 실험에서는 표면 개질, 미세 가공 및 전기화학을 이용하여 세포 비부착성에서 세포 부착성으로 전환 가능한 표면을 형성해 보겠습니다. 첫 번째 단계는 포토리소그래피입니다. 이 공정이 어떻게 진행되는지에 대한 흐름도가 여기 있습니다.

파란색은 유리 기판이며, 초록색은 유리 기판 위에 코팅된 인듐 10 산화물입니다. 먼저, 인듐 10 산화물이 코팅된 유리 기판 위에 여기에 표시된 적색의 포토레지스트를 스핀 코팅합니다. 그런 다음 포토마스크를 통해 자외선을 조사하며, 노출된 영역은 현상액에서 현상하게 됩니다.

포토레지스트로 보호되지 않은 ITO 영역은 ITO 식각 공정을 통해 제거됩니다. 마지막으로, 남은 모든 포토레지스트를 아세톤으로 제거하여 ITO 전극을 형성합니다. 다음은 나머지 세 단계의 흐름도입니다.

먼저, 전체 표면을 peg cylin으로 수식합니다. 이렇게 하면 표면이 비오염성(non-fouling)이 되어 세포나 단백질이 결합하지 않게 됩니다. 다음으로, 전기화학적 방법을 사용하여 이전에 제작한 두 전극에서 peg cylin을 특이적으로 흡착시킵니다.

마지막으로, 섬유아세포를 표면 위에 배양하면 이 세포들이 스트립 영역에만 선택적으로 결합하게 됩니다. 이제 실험을 시작할 준비가 되었습니다. 첫 번째 단계는 클린룸에서 수행되는 포토리소그래피 공정입니다.

이제 클린룸으로 들어가 보겠습니다. 현재 클린룸에 들어와 있습니다. 실험을 시작하기 전에, 인듐 주석 산화물(indium tin oxide) 또는 ITO가 코팅된 샘플을 오븐에서 200 °C로 베이킹하겠습니다.

이렇게 함으로써 모든 표면을 탈수할 수 있습니다. 200 °C에서 베이킹한 후 스핀 코터에 올려 포토레지스트를 실제로 도포할 예정입니다. 따라서 ITO 기판을 탈수시킨 후, 이를 가져와 스핀 코터의 척 위에 배치하겠습니다.

이 척은 유리 램프의 4분의 1을 고정하기에 충분한 크기입니다. 그런 다음 진공을 가합니다. 그 후 기판 위에 양성 톤 포토레지스트를 도포합니다.

포토레지스트 도포 후, 곧바로 다음 단계를 진행합니다. 이는 두 단계로 구성됩니다. 첫 번째는 도포(spreading)이며, 두 번째는 도포 단계에서의 스핀 코팅입니다.

척이 800 RPM으로 회전하며 포토레지스트를 전체 표면에 균일하게 도포합니다. 그다음은 스핀 단계로, 4,000 RPM에서 회전시켜 매우 얇은 층을 형성합니다. 여기서 얇다는 것은 약 1 µm 정도를 의미합니다.

photoresist라는 단어를 나누어 보면 photo와 resist가 됩니다. 이는 빛에 의해 활성화됩니다. 따라서 우리는 클린룸에서 작업하며, 포토레지스트가 빛에 의해 활성화되지 않도록 필터링된 광원을 사용합니다. 또한 포토레지스트는 식각 공정 시 활용하게 될 화학 물질에 대해 내성을 가집니다.

이제 스핀 코팅을 통해 표면에 포토레지스트 도포를 완료했으므로, 시료를 꺼내 다음 단계로 넘어가겠습니다. 샘플을 1분 45초 동안 베이킹한 후, 핫플레이트에서 꺼내 캐넌 마스크 얼라이너(cannon mask aligner)로 옮깁니다. 여기서 필요한 마스크를 가져와 기판 위에 배치하며, 포토레지스트가 도포된 기판과 마스크 사이에 접촉 인쇄가 이루어지도록 4인치 글라스 웨이퍼를 올려 무게를 가해 줍니다.

해당 단계를 마치면 셔터를 다시 닫고 샘플을 UV 광선에 노출시킵니다. 노출이 완료되면 역순으로 덮개를 제거합니다. 유리 웨이퍼와 마스크를 꺼낸 다음, 기판을 분리하여 현상 단계로 옮깁니다.

샘플을 노광시킨 후, 현상액에 넣습니다. 샘플이 UV 광선에 노출되면 수소 이온이 형성되며, 이는 염기성 현상액과 중화되어 표면에서 실제로 제거됩니다. 따라서 샘플 작업을 수행할 때 기판을 지속적으로 흔들어 주어야 합니다.

그렇게 하면 처음 1분에서 1분 30초 정도 사이에 노출된 영역이 실제로 현상되어 표면에서 제거되는 것을 확인할 수 있습니다. 하지만 완전한 현상이 이루어지도록 현상액에 약 5분 동안 담가 둡니다. 현상이 완료되면 샘플을 꺼내 DI water로 세척한 다음, 질소 건(nitrogen gun)을 사용하여 건조합니다.

샘플을 건조한 후, 이를 현미경으로 옮겨 관찰하겠습니다. 현재 현미경으로 샘플을 살펴보고 있습니다. 5분 동안 현색 과정을 거친 후 막 꺼낸 상태입니다.

여기서는 두 영역을 확인할 수 있는데, 포토레지스트가 도포된 어두운 영역과 포토레지스트가 제거된 밝은 영역입니다. 앞서 사용한 마스크와 비교해 보면, 마스크의 어두운 영역이 현재 현미경 하에서 보이는 어두운 영역이 되며, 여기서 보이는 밝은 영역은 마스크에서 투명했던 부분입니다. 여기에 표시된 디자인 중 하나는 500 µm에서 50 µm까지 다양한 크기의 배열이며, 다른 디자인은 서로 연결된 1000 µm 크기의 원들입니다.

여기 동일한 절차를 통해 제작된 다른 디자인이 있습니다. 여기에는 개별적으로 주소 지정이 가능한 전극들이 있습니다. 이는 ITO의 서로 다른 영역들이 상호 연결되어 있어 각각 다르게 활성화될 수 있음을 의미합니다.

예를 들어 여기에서 중앙의 원형 영역은 이쪽의 전극 패드 하나에 연결되어 있는 반면, 가장 바깥쪽의 직사각형 영역은 다른 전극 패드에 연결되어 있습니다. 이러한 방식으로 서로 다른 두 표면을 서로 다른 시점에 자극할 수 있습니다. 샘플을 확인한 후, 다음 단계로 샘플을 식각합니다.

사진에 의해 보호되지 않는 모든 영역은 ITO 식각 공정에서 식각되어 제거됩니다. 이를 수행하기 전, ITO 식각액에는 산이 포함되어 있으므로 적절한 보호구를 착용해야 합니다. 이제 산 보호 가운을 입고 안면 보호구를 착용한 상태에서, 유리 비커에 ITO 식각액을 붓겠습니다.

ITO 식각액은 20% 염화수소, 5% 질산, 그리고 나머지는 초순수로 구성됩니다. 그런 다음 시료를 가져와 식각액에 넣습니다. 앞서 현미경으로 확인했을 때, 포토레지스트로 보호되지 않은 영역들이 일부 있었습니다.

ITO 식각에 사용된 산성 물질이 해당 영역을 공격하여 그 부분의 ITO가 식각되어 제거되었습니다. ITO가 표면부터 천천히 분해되면서 색상이 변합니다. 여기서 원래 가지고 있던 푸르스름한 색에서 보랏빛 색으로 변했고, 이제는 노란색으로 변하고 있는 것을 확인할 수 있습니다.

색상이 변하는 것은 ITO가 식각되고 있음을 나타냅니다. 이제 15분이 경과했습니다. 모든 ITO가 완전히 식각되었습니다.

현재 보시는 사진은 보호된 ITO 영역입니다. 식각이 완료된 후에도 표면에는 일부 산 성분이 남아 있습니다. 이러한 산을 제거하기 위해 시료를 탄산나트륨 용액에 넣어 모든 산을 중화시키겠습니다.

산성 용액을 중화시킨 후, 샘플을 꺼내 DI water로 세척하고 질소 가스로 건조합니다. 이제 산 식각 과정이 완료되었습니다. 더 이상 산을 사용하지 않으므로, 내산성 가운을 벗겠습니다.

이제 시료를 꺼내어 옮긴 후 현미경으로 관찰하겠습니다. 현재 현미경으로 시료를 관찰하고 있으며, 이는 ITO 식각을 수행한 후의 모습입니다.

이 경우, 더 어두운 영역은 ITO가 식각되어 제거된 유리 영역입니다. 그리고 더 밝은 영역은 이번 사례에서 포토레지스트에 의해 보호된 ITO 영역입니다. 다시 한번 설명하자면, 이것들은 500에서 50 $\mu$m까지의 어레이이며, 다른 사례에서는 각각 1,000 $\mu$m 크기의 서로 연결된 원형 패턴이 있습니다.

현미경으로 관찰하여 유리 영역과 ITO 영역이 있음을 확인했으며, ITO 영역은 포토레지스트에 의해 보호되어 있었습니다. 이제 이 포토레지스트를 제거해야 합니다. 기판을 아세톤에 넣은 다음, 이를 초음파 세척기에 넣고 10분 동안 초음파 처리하겠습니다.

이를 통해 모든 포토레지스트가 제거되었음을 보장합니다. 단독으로 토너를 사용할 수도 있지만, 음파를 이용해 충격을 주는 소니케이션(sonication)을 통해 포토레지스트가 정확하게 제거되도록 합니다. 소니케이터에서 꺼낸 후 DI water로 세척하고 질소로 다시 건조하면, 이제 유리 기판 위에 패턴이 명확하게 보입니다. 이것들이 처음에 포토레지스트에 의해 보호되었던 패턴들입니다.

샘플을 확인하고 ITO 패턴을 찾거나 제작했으므로, 이제 실험의 두 번째 단계를 시작하겠습니다. 이 단계에서는 PEG 실란의 자기조립 단분자층을 이용해 표면을 수식합니다. 하지만 그전에 표면이 반응성을 가지고 있는지 확인해야 합니다.

이를 위해 샘플을 플라스마 세정기에 넣습니다. 이 과정은 표면에 히드록실기를 도입하여 반응성을 높여줍니다. 샘플을 플라스마 세정기에 넣은 후 진공 펌프를 작동시키면 됩니다.

산소를 공급하고 메인 전원을 켭니다. 이 전원은 산소 가스를 플라즈마로 변환하는 데 사용되며, 변환된 플라즈마가 주입되어 하이드록실 홈을 형성하게 됩니다. 전원을 켠 후, 시작 버튼을 누릅니다.

이제 공정이 완료되었으므로, 기판을 꺼내 디시에 보관한 후 클린룸 밖으로 나가 방진복을 벗고 다음 단계로 이동합니다. 클린룸에서 나와 아이디얼 패터닝(ideal patterning)을 마쳤으므로, 이제 방금 패터닝한 표면을 폴리에틸렌 글리콜 실란(polyethylene glycol silane) 또는 PEG 실란으로 수식하겠습니다. PEG 실란은 수분에 반응한다는 점을 유의하는 것이 중요합니다.

따라서 나무 재질의 모든 도구는 수분이 없어야 합니다. 여기서 사용한 유리 기구와 페트리 접시는 100 °C에서 하룻밤 동안 건조되었습니다. 또한 용매로 사용할 톨루엔 역시 무수물입니다.

수분이 포함되어 있지 않습니다. 이제 두 개의 유리 비커에 무수 톨루엔을 부어줄 것인데, 그중 하나에는 샘플이 들어 있습니다. 수정을 진행할 용기가 필요하므로 두 개의 페트리 접시를 사용해야 합니다.

그리고 나머지 하나는 표면 개질이 끝난 후 기판을 세척하는 용도로 나중에 사용할 것입니다. 유리 피자 디쉬에 담은 후, 이를 글로브 박스의 에어록 챔버로 옮기겠습니다. 에어록 챔버를 닫은 다음, 챔버 내에 질소를 주입하겠습니다.

현재 메인 챔버는 이미 질소로 충전되어 있습니다. 따라서 질소가 충전되지 않은 상태에서는 이 챔버를 열어서는 안 됩니다. 두 챔버 모두 질소로 충전되면, 피펫을 사용하여 모든 샘플을 옮기겠습니다.

나중에 샘플을 옮길 때 사용할 페그와 핀셋을 준비하겠습니다. 장갑을 착용한 후 챔버를 열고, 에어락에 있는 모든 물품을 천천히 주의 깊게 꺼내어 메인 챔버에 배치합니다. 여기에는 기질이 담긴 페트리 접시와 세척용으로 사용할 톨루엔만 담긴 페트리 접시가 있습니다.

포함된 pxi는 질소 충전 포장되었으므로, 질소 환경이 아닌 곳에서는 이 병을 열지 마십시오. 따라서 샘플을 꺼낸 후에는 즉시 다시 백에 넣어야 합니다. 실린더를 꺼내십시오. 사용될 농도는 toluene 내 2%입니다.

그 다음 그것을 꺼내어 톨인 용액에 넣고 혼합합니다. 또한 챔버를 사용하여 충분히 혼합되었는지 확인한 후, 샘플을 톨인 용액에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 2시간이 지나 샘플이 Pxi에 머물렀으므로, 샘플을 꺼내어 새로운 톨인 용액으로 옮깁니다. 여기서 짧게 세척하며 가볍게 흔들어준 뒤, 에어락 챔버로 이동시킵니다.

에어락 챔버에 넣은 후, 챔버를 열어 표면 처리가 완료된 시편을 꺼내 질소 건으로 건조합니다. 이를 다시 깨끗하고 건조한 페트리 접시에 담아 100 °C의 오븐에서 2시간 동안 더 가열합니다. 이제 샘플을 100 °C 오븐에서 2시간 동안 가열했으므로, 준비된 전극에 와이어를 연결하겠습니다.

실버 에폭시와 경화제를 1:1 비율로 혼합하여 이를 수행합니다. 이것이 실버 에폭시이며, 여기에 동일한 양의 경화제를 추가합니다. 충분히 잘 섞어준 다음, 이것을 사용하여 와이어를 부착합니다.

사용하고자 하는 전극 위에 와이어를 배치한 다음 코팅합니다. ITO에는 솔더링이 되지 않으므로 silver epoxy와 경화제를 사용해야 합니다. 그 후 베이킹 공정을 통해 이전에 사용한 경화제를 제거하고 단단하게 굳혀 전극으로 사용할 수 있게 합니다.

두 단계를 마쳤으므로, 이제 실험의 세 번째 단계인 전기화학 분석을 시작하겠습니다. 이를 위해 샘플을 채취하여 전기화학 셀에 넣습니다. 샘플을 전기화학 셀에 넣은 후, 그 위에 O-링을 배치합니다.

이렇게 하면 전기화학 반응이 일어날 영역이 분리되며, 그 후 셀을 밀봉합니다. 이제 전선이 연결된 시료를 전기화학 셀에 배치했습니다. 이제 포텐시오스탯을 사용하여 전압을 인가할 준비가 되었습니다.

따라서 흰색 전선은 기준 전극에, 빨간색 전선은 상대 전극에, 그리고 마지막으로 녹색 전선을 작업 전극에 연결하겠습니다. 모든 전극이 연결되면 1x 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS 용액을 전기화학 셀에 첨가합니다. 여기서 명확히 하자면, 현재 전체 표면은 pxi로 수식된 상태입니다.

따라서 주변의 유리 영역을 포함한 모든 전극이 pxi로 수정되었습니다. ITO가 존재하는 곳, 즉 우리가 설계한 전극 부위에 전압을 가하면, 해당 표면에서만 PEG 아일랜드가 제거되며 주변 영역에는 아무런 영향이 없습니다. 결과적으로, 기판에서 PEG 아일랜드를 선택적으로 제거할 수 있습니다.

이제 재생 버튼을 누르면 작동 전극에 -1.4 V의 전압이 인가되기 시작합니다. 전압이 인가되면 전극에서 색상 변화를 확인할 수 있습니다. 투명한 녹색빛이 도는 푸른색에서 갈색으로 변합니다.

전극에서 갈색으로 변하게 만드는 산화 반응이 일어나는 것으로 추정됩니다. 이는 표면의 pxi가 실제로 제거되었음을 나타내는 지표 중 하나이기도 합니다. 다시 한번 말씀드리자면, 갈색으로 보이는 모든 부분은 peg island가 제거된 곳입니다.

그리고 주변 유리 영역에는 여전히 PXI가 조립되어 있습니다. 따라서 -1.4 V의 전압을 60초 동안 가합니다. 이렇게 하면 전극에 존재하던 모든 PXI를 제거하기에 충분한 시간이 확보됩니다.

이 방법은 개별적으로 주소 지정된 전극을 박리하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 사례에서는 박리할 세 줄의 원형 전극이 있습니다. 세 가지 서로 다른 전극을 사용하여 박리하려는 대상을 선택할 수 있습니다.

이제 ITO 전극에서 PG 실링을 선택적으로 제거하는 전기화학의 세 번째 단계를 성공적으로 마쳤습니다. PBS와 초순수로 빠르게 세척한 후, 와이어를 제거하고 샘플을 일반적인 6웰 플레이트에 옮겼습니다. 이제 다음 단계로 넘어가 이 전극 위에서 세포를 배양하겠습니다.

이제 조직 배양실에 도착했습니다. 실험의 마지막 단계에서는 오늘 섬유아세포인 3T3 세포를 사용할 예정입니다. 세포 파종에 사용하는 농도는 1ml당 0.5~1.5 million cells 사이로 설정합니다.

세포를 파종한 후, 샘플 위에 약 20분 동안 유지합니다. 이렇게 하면 세포가 박리된 영역에 부착될 수 있는 충분한 시간이 확보됩니다. 이제 인큐베이터에 넣겠습니다.

이제 20분이 경과하여, 앞서 보았던 갈색 영역인 ITO 박리 영역에 패턴 형성된 세포들을 살펴볼 준비가 되었습니다. 세포들은 오직 해당 영역에만 특이적으로 결합하며 그 외의 영역에는 부착되지 않습니다. 여기서 갈색 영역은 pxi가 박리된 ITO 영역임을 알 수 있습니다. 전기화학적 방법을 통해 세포들이 주변 유리 영역이 아닌 이 갈색 영역에만 부착되었습니다.

다른 프레임에서도 다시 한번, 세포가 박리된 영역에 부착되는 것을 볼 수 있습니다. 갈색으로 표시된 영역이 바로 그곳인데, 이 갈색 영역 위쪽을 보시면 ITO 디자인 PEG가 박리되지 않았기 때문에 세포가 부착되지 않은 것을 거의 확인할 수 있습니다. 네, 여기까지입니다.

프로토콜을 모두 마쳤으며, ITO 전극 위에 세포가 패턴을 형성하여 우리가 원했던 결과가 정확히 도출되었습니다. 지금까지 미세 가공된 광투과성 산화인듐(indium 10 oxide) 전극 상에서 세포 접착을 제어하는 방법을 보여드렸습니다. 오늘은 이 전극들 위에 세 개의 섬유아세포(fibroblasts)를 패턴화하는 방법을 살펴보았습니다.

우리는 또한 동일한 절차를 사용하여 Hep G two 세포, 위성 세포 및 쥐 일차 세포를 패턴화하였습니다. 현재의 세포 패턴화 기술은 표면에 두 가지 세포 유형만 조립할 수 있습니다. 이 기술의 유연성은 향후 표면에 공간적으로 분리된 여러 세포 유형을 조립하는 것을 가능하게 할 것입니다.

우리는 생체 내 미세환경을 모사하기 위해 ITO 기판 위에 세 가지 서로 다른 간 세포 유형을 공간적으로 분리 배치하는 기술을 사용할 계획입니다. 이를 통해 미성숙 세포 또는 줄기세포를 성숙 세포 및 지지 세포와 함께 공간적으로 분리할 수 있습니다. 이는 미성숙 세포가 성장하고 분화할 수 있는 유도 환경을 조성하게 될 것입니다.