광학 투명 인듐 틴 산화물 전극에 Patterning 셀

안녕하세요, 저는 이샤입니다. 저는 Dr.Zen 연구실의 2학년 대학원생입니다. 저희는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스(University of California Davis)의 의생명공학과에 있습니다.

오늘 저는 조직 공학에서 미세하게 제작된 광학적으로 투명한 인듐 10 산화물 전극에서 Ian을 제어하는 방법을 보여 드리고 장기의 미세 환경을 모방하기 위한 재생 노력이 이루어졌습니다. 이러한 미세환경을 in vitro에서 만들기 위해서는 기질에서 세포를 공간적, 시간적으로 격리하는 것이 필수적입니다. 우리는 다양한 간 세포 유형의 위치를 제어할 수 있는 표면을 설계하는 데 관심이 있습니다.

오늘 실험에서는 표면 개질, 미세 가공 및 전기 화학을 사용하여 셀 비접착에서 셀 접착제로 전환할 수 있는 표면을 형성할 것입니다. 첫 번째 단계는 포토리소그래피입니다. 다음은 해당 프로세스가 어떻게 작동하는지에 대한 흐름도입니다.

파란색은 유리 조명이고 녹색은 유리 조명 위에 코팅된 인듐 10 산화물입니다. 먼저, 우리가 할 일은 인듐 10 산화물 코팅 유리 광 위에 여기에 표시된 스핀 코트 포토 레지스트 레드입니다. 그런 다음 포토 마스크를 통해 자외선에 전달하고 노출 영역은 개발 솔루션에서 개발될 것입니다.

포토 레지스트로 보호되지 않는 ITO 영역은 IT OING에서 제거됩니다. 그런 다음 마지막으로 나머지 모든 포토 레지스트는 아세톤에서 제거되어 ITO 전극을 형성합니다. 다음은 나머지 세 단계의 흐름도입니다.

먼저 페그 사이린으로 전체 표면을 수정할 것입니다. 이것은 표면을 오염시키지 않고 세포나 단백질이 결합하지 않도록 할 것입니다. 다음으로 우리는 전기화학을 사용하여 이전에 만든 I 두 전극에서 페그 실린을 특이적으로 흡수할 것입니다.

마지막으로, 우리는 표면 위에서 섬유아세포를 배양할 것이고 그것들은 스트립 영역에만 선택적으로 결합할 것입니다. 이제 실험을 시작할 준비가 되었습니다. 첫 번째 단계는 클린룸에서 수행될 포토리소그래피입니다.

자, 이제 클린룸으로 들어가 보겠습니다. 그래서 지금 여기 우리는 클린 룸에 있습니다. 실험을 시작하기 전에 우리가 할 일은 인듐 주석 산화물 또는 ITO 코팅 샘플을 오븐에서 200°C에서 굽는 것입니다.

그렇게 하면 모든 표면을 탈수할 수 있습니다. 그리고 200°C에서 베이킹한 후 스핀 기술에 놓고 실제로 포토 레지스트를 적용할 때입니다. 따라서 ITO 기판을 탈수한 후 이를 가져다가 스핀 기술의 척에 놓을 것입니다.

이 척은 유리 조명의 1/4을 담을 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 그런 다음 진공을 적용할 것입니다. 그 후, 우리는 기판에 긍정적 인 톤, 포토 레지스트를 적용합니다.

포토 레지스트를 적용한 후 계속 진행합니다. 여기에는 두 단계가 포함됩니다. 첫 번째는 살포이고 두 번째는 살포 단계의 스핀 코팅입니다.

척은 800RPM으로 회전하며 포토 레지스트를 전체 표면에 균일하게 퍼뜨립니다. 그러나 다음은 4, 000 RPN과 4, 000 RPM에서 정말 얇은 층을 형성하는 스핀 단계입니다. 얇다는 것은 약 1미크론을 의미합니다.

'사진', '저항하다'라는 단어를 끊으면 사진으로 바뀌고 저항한다. 그것은 빛에 의해 활성화됩니다. 따라서 우리는 클린룸에서 작업하고 필터링된 빛을 사용하여 포토 도어 레지스트가 빛에 의해 활성화되지 않고 자산에 저항력이 있도록 하여 나중에 에칭을 할 때 사용할 속성을 사용합니다.

이제 스핀 코팅, 표면의 포토 레지스트 작업이 완료되었으며 이를 제거하고 다음 단계로 넘어갈 것입니다. 따라서 샘플을 1분 45초 동안 베이킹한 후 핫 플레이트에서 샘플을 가져와 캐논 마스크 라이너로 옮길 것입니다. 여기서 우리는 우리가 필요로 하는 마스크를 취한 다음 포트 레지스트가 있는 기판과 마스크 사이에 접촉 인쇄를 하기 위해 기판 위에 마스크를 놓고 무게를 추가하기 위해 4인치 유리 웨이퍼로 배치합니다.

그리고 이 작업이 끝나면 셔터를 다시 끼우고 샘플을 자외선에 노출시킵니다. 노출이 완료되면 역순으로 뚜껑을 옮기기만 하면 됩니다. 유리 웨이퍼를 꺼내고, 마스크를 꺼낸 다음, 기판을 제거하고 현상을 위해 넘겨받습니다.

샘플을 노출한 후 개발자 솔루션에 배치합니다. 샘플이 자외선에 노출되었을 때 수소 이온 형태가 있었는데, 이는 염기와 현상액으로 중화되어 실제로 표면에서 제거되었습니다. 이제 샘플을 채취할 때 기질이 지속적으로 방향을 바꾸고 있는지 확인해야 합니다.

그렇게 하면 약 1분 또는 1분 30초 안에 노출된 영역이 실제로 개발되어 표면에서 제거되는 것을 볼 수 있습니다. 그러나 완전한 개발이 이루어지려면 약 5분 동안 개발자 솔루션에 그대로 둡니다. 개발이 완료되면 꺼내서 씻고 물을 뿌린 다음 질소 건을 사용하여 건조할 것입니다.

샘플을 건조시키고 나면 샘플을 가져와서 현미경으로 시각화할 것입니다. 여기서 우리는 현미경으로 샘플을 보고 있습니다. 5분 동안 개발한 후 바로 꺼냈습니다.

여기에서 볼 수 있는 두 가지 영역이 있는데, 하나는 포토 레지스트로 덮인 어두운 영역이고 다른 하나는 포토 레지스트가 제거된 밝은 영역입니다. 앞서 사용했던 마스크와 관련하여, 마스크의 어두운 영역은 현미경으로 지금 볼 수 있는 어두운 영역인 반면, 여기에서 보이는 투명한 영역은 마스크에서 투명했습니다. 여기에 표시된 디자인 중 하나는 500미크론에서 50미크론까지 다양한 크기의 배열인 반면, 다른 디자인은 상호 연결된 1000미크론 원입니다.

그래서 여기에 동일한 절차를 사용하여 만들어진 다른 디자인이 있습니다. 여기에 개별적으로 주소 지정이 가능한 전극이 있습니다. 제가 의미하는 바는 ITO의 서로 다른 영역이 상호 연결되어 있고 다르게 활성화될 수

예를 들어, 여기에서 중앙 원형 영역은 여기에서 하나의 전기 패드에 연결되는 반면 가장 바깥쪽 직사각형 영역은 다른 전기 패드에 연결됩니다. 이런 식으로 우리는 서로 다른 시점에서 이 두 개의 다른 표면을 자극할 수 있습니다. 샘플을 살펴본 후 다음 단계로 넘어갈 단계는 샘플을 에칭하는 것입니다.

사진으로 보호되지 않는 모든 영역은 ITO 에칭에서 에칭될 것입니다. 그렇게 하기 전에 ITO 에칭에는 산이 포함되어 있으므로 적절한 옷을 입었는지 확인해야 합니다. 그리고 이제 산성 보호 가운을 입고 안면 보호대를 착용한 후 유리 비커에 ITO 에칭을 부을 것입니다.

ITO 에칭은 20%염화수소, 5%질산으로 구성되고 나머지는 DI수입니다. 그런 다음 내 샘플을 가져와 에칭에 넣습니다. 현미경의 앞부분에서, 우리는 Photo Raises에 의해 보호되지 않는 일부 영역이 있음을 확인했습니다.

ITO 에칭의 산은 해당 영역을 공격하고 해당 영역의 ITO를 에칭 제거했습니다. ITO가 표면에서 서서히 분해됨에 따라 색상이 변합니다. 여기에서 원래 가지고 있던 푸르스름한 변화에서 이 자줏빛 변화로 바뀌었고 이제 노란색 거래소로 이동하고 있음을 볼

색상의 변화는 ITO가 에칭되고 있음을 나타냅니다. 이제 15분 남았습니다. 모든 ITO는 완전히 새겨져 있습니다.

그리고 지금 보시는 것은 사진이 ITO 지역으로 보호된다는 것입니다. 따라서 에칭이 완료된 후에도 표면에 남아 있는 산이 여전히 남아 있습니다. 이 산을 제거하기 위해 탄산나트륨 용액에 넣으면 모든 산이 중화됩니다.

산을 중화한 후 꺼내서 DI 물로 세척한 다음 질소가 완료된 상태에서 건조시킬 것입니다. 이제 산성 에칭이 완료되었습니다. 더 이상 산은 없어, 나는 뜨거운 가운에서 벗어났어.

우리는 그것을 꺼내서 옮기고 현미경으로 시각화할 것입니다. 이제 우리는 현미경으로 샘플을 관찰하고 있습니다. 이것은 ITO 에칭을 수행한 후입니다.

이 경우 더 어두운 영역은 ITO가 에칭된 유리 영역입니다. 그리고 더 밝은 영역은 이 경우 포토 레지스트로 보호되는 ITO입니다. 다시 한 번, 이것들은 500에서 50 미크론까지의 어레이이고 다른 경우에는 각각 천 미크론의 상호 연결된 원이 있습니다.

그래서 우리는 현미경 아래를 보았고 유리 영역과 ITO 영역이 있지만 ITO 영역은 포토레지스트에 의해 보호된다는 것을 알았습니다. 이제 이 포토레지스트를 제거해야 합니다. 그래서 우리가 할 일은 기판을 가져다가 아세톤에 넣은 다음 이것을 초음파 처리에 넣고 10 분 동안 초음파 처리하는 것입니다.

이렇게하면 모든 사진 저항이 제거되고 그 자체로 톤으로 사용할 수 있지만 음파를 사용하여 부딪히고 사진 저항이 올바르게 제거되도록하는 음파 타격을 통해 얻을 수 있습니다. 음파 공기에서 꺼낸 후 DI 물로 세척하고 질소로 다시 건조하면 이제 유리 기판에서 패턴을 명확하게 볼 수 있습니다. 이것들은 처음에 포토 레지스트에 의해 보호되었던 패턴입니다.

이제 샘플을 살펴보고 ITO 패턴을 찾거나 만들었으므로 실험의 두 번째 단계를 시작하겠습니다. 이 단계는 PEG cycline의 자체 조립 단층으로 표면을 수정하는 것을 포함합니다. 그러나 그렇게 하기 전에 표면이 반응하는지 확인해야 합니다.

이를 위해 플라즈마 클리너에 넣습니다. 이것은 표면에 수산기를 도입하여 반응성을 만듭니다. 이를 위해 샘플을 플라즈마 클리너에 넣은 다음 진공 펌프를 켜기만 하면 됩니다.

우리는 산소를 켜고 주 전원을 켭니다. 이 힘은 산소 가스를 플라즈마로 변환하는 데 사용되며, 플라즈마는 도입되어 하이드록실 홈을 형성합니다. 그리고 전원을 켜면 계속해서 시작을 누릅니다.

이제 프로세스가 완료된 후 기판을 꺼내 접시에 보관하고 클린 룸 de 가운 밖으로 향하고 다음 단계로 이동합니다. 이제 클린룸에서 나와 이상적인 패터닝을 마쳤으므로 폴리에틸렌 글리콜, CYLIN 또는 PEG Cylin으로 방금 패터닝한 표면을 수정할 것입니다. 페그 실린이 수분에 반응한다는 것을 아는 것이 중요합니다.

따라서 우리가 나무를 사용하는 모든 것은 습기가 없어야 합니다. 우리가 여기서 사용한 유리 그릇, 애완 동물 요리는 하룻밤 동안 100°C에서 구워졌습니다. 그리고 우리가 용매로 사용할 tun도 무수입니다.

수분이 포함되어 있지 않습니다. 이제 저는 툰(tun), 무수 톨루(inhydrous tolu)를 이 두 개의 유리 스피커에 부어넣을 건데, 그 중 하나에는 우리의 샘플이 들어 있습니다. 이제 두 개의 페트리 접시를 사용해야 하는데, 그 중 하나가 수정을 할 곳이기 때문입니다.

그리고 다른 하나는 나중에 수정이 끝나면 실제로 기판을 씻는 데 사용할 것입니다. 그래서 우리의 유리 피자 접시에 넣은 후, 저는 그것을 가져다가 여기 글로브 박스에 있는 에어록 챔버로 옮길 것입니다. 에어록 챔버를 닫은 후 챔버에 질소를 주입할 것입니다.

이제 이곳의 메인 챔버는 이미 질소로 채워져 있습니다. 따라서 우리는 질소로 채워지지 않는 한 이 챔버를 열고 싶지 않습니다. 두 챔버가 모두 질소가 되면 피펫과 함께 모든 샘플을 옮길 것입니다.

우리는 나중에 샘플을 옮기는 데 사용할 페그와 핀셋을 가질 것입니다. 그래서 우리는 장갑을 끼고, 여기 챔버를 열고, 천천히 그리고 조심스럽게 에어록에 있는 모든 것을 꺼내 메인 챔버에 놓을 것입니다. 이것은 우리의 기질이 있는 페트리 접시이고 우리가 세척에 사용할 톨루엔이 있는 페트리 접시입니다.

존재하는 pxi는 질소로 포장되었으며 질소 환경에 있지 않는 한 이 병을 열지 마십시오. 그러므로, 당신이 표본을 밖으로 가지고 가고 싶을 때, 당신은 부대에서 그것을 다시 뒀습니다. 그래서 당신은 실린을 꺼내고 우리가 사용할 농도는 톨루엔에서 2%입니다.

그래서 꺼내서 키가 큰 곳에 넣고 섞습니다. 또한 잘 챔버에 넣고 잘 혼합되었는지 확인한 다음 샘플을 Toin에서 2 시간 동안 배양합니다. 이제 두 시간이 지났고, 샘플이 Pxi에 도착했으니, 샘플을 꺼내서 새로운 토인 용액으로 옮겨서 간단히 씻어내고, 방향을 틀고, 에어록 챔버로 옮길 것입니다.

일단 에어록 챔버에 들어가면, 챔버를 열고 개조된 표면을 꺼내면 질소 건을 사용하여 운전할 수 있습니다. 우리는 그것을 깨끗하고 마른 페트리 접시에 다시 넣고 100°C의 오븐에 두 시간 더 넣습니다. 이제 샘플을 섭씨 100도의 오븐에서 2시간 동안 구웠으므로 준비한 전극에 전선을 연결하여 연결할 것입니다.

우리는 은 에폭시와 경화제의 일대일 혼합물을 만들어 그렇게 합니다. 이것이 은 에폭시이고 이제 우리는 같은 양의 경화를 추가합니다. 우리는 그것을 잘 섞고 싶고, 이것을 가지고 전선을 연결하는 데 사용할 것입니다.

그래서 우리는 우리가 사용하고자 하는 전극에 전선을 놓고 코드를 만듭니다. 납땜은 ITO에서 작동하지 않으므로 은 에폭시와 경화제를 사용해야 합니다. 그런 다음 이전에 사용했던 모든 경화제를 제거하고 굳어서 전극으로 사용할 수 있도록 굽습니다.

이제 두 단계를 마쳤으니 전기화학 부분을 수행하는 실험의 세 번째 단계를 시작하겠습니다. 이를 위해 샘플을 채취하여 전기화학 셀에 넣을 것입니다. 전기화학 셀에 넣은 후 그 위에 O-링을 놓기만 하면 됩니다.

그것은 전기화학이 일어날 영역을 분리할 것이고, 그런 다음 우리는 세포를 밀봉할 것입니다. 그래서 저는 와이어가 연결된 샘플을 전기화학 셀에 넣었습니다. 이제 전위 stat를 사용하여 전압을 적용할 준비가 되었습니다.

그래서 흰색 와이어는 바로 여기 참조 전극에 연결하고, 빨간색 전극, 상대 전극, 그리고 마지막으로 녹색 전극을 작업 전극에 연결할 것입니다. 이 모든 전극이 연결되면 인산염 인산염 완충액 식염수 또는 PBS의 한 x 용액을 전기화학 물질 자체에 추가하기만 하면 됩니다. 이제 이것을 명확히하기 위해, 그것이 작동하는 방식은 현재로서는 전체 표면이 pxi로 수정되는 것입니다.

따라서 주변 유리 영역을 포함한 모든 전극은 pxi로 수정됩니다. 우리가 만든 전극 설계인 ITO가 있는 모든 곳에 전압을 적용하면 페그 아일랜드는 해당 표면에서만 떨어져 나올 것이고 주변 영역에는 아무 영향도 미치지 않을 것입니다. 따라서 우리는 기판에서 페그 아일랜드를 선택적으로 제거합니다.

이제 재생을 누르면 시작되고 작업 전극에 음의 1.4 볼트의 전압이 적용됩니다. 전압이 가해지면 전극에서 볼 수 있는 색상 변화가 있습니다. 우리가 갈색으로 만들어야 했던 투명한 녹색을 띤 파란색 팅에서 바뀝니다.

우리는 전극을 갈색으로 변하게 하는 전극에서 발생할 수 있는 산화 반응이 있을 수 있다고 의심합니다. 이것은 또한 표면의 pxi가 실제로 표면에서 벗겨졌다는 지표 중 하나입니다. 그리고 다시 한 번, 갈색이 보이는 곳마다 페그 아일랜드가 제거된 곳입니다.

그리고 주변의 유리 영역에는 여전히 PXI가 조립되어 있습니다. 그래서 우리는 60 초 동안 음의 1.4 와트의 전압을 적용합니다. 이렇게 하면 전극에 존재하는 모든 pxi를 제거할 수 있는 충분한 시간이 제공됩니다.

이 방법을 사용하여 개별적으로 처리된 전극을 벗겨낼 수도 있습니다. 이 경우 제거될 세 줄의 원이 있습니다. 우리는 세 가지 다른 전극을 모두 사용하여 스트립하려는 것을 선택할 수 있습니다.

이제 우리는 ITO 전극에서 PG 실링을 선택적으로 제거하는 전기화학의 세 번째 부분을 성공적으로 마쳤습니다. 나는 PBS와 DI 물로 간단히 씻고 와이어를 제거하고 샘플을 일반 6 개의 우물 플레이트에 넣었습니다. 이제 우리는 이 전극에서 세포를 배양할 것입니다.

자, 이제 우리는 조직 배양실에 있습니다. 실험의 마지막 단계에서는 섬유아세포, 즉 3개의 T, 3개의 세포를 사용할 것입니다. 우리가 세포를 파종하는 데 사용하는 농도는 mil당 0.5에서 150만 개 사이입니다.

세포를 파종한 후 약 20분 동안 세포를 샘플에 주입했습니다. 그러면 벗겨진 영역에 부착할 수 있는 충분한 시간을 가질 수 있습니다. 그래서 우리는 그것을 인큐베이터에 넣을 것입니다.

이제 20분이 지났고 우리는 ITO의 벗겨진 영역, 즉 앞서 보았던 갈색 영역에 패턴화된 세포를 볼 준비가 되었으며, 이 세포는 해당 영역에만 특이적으로만 결합하고 해당 영역 밖의 어느 곳에도 부착되지 않습니다. 여기서 갈색 영역이 pxi가 제거된 ITO 영역임을 볼 수 있습니다. 전기화학을 사용함으로써, 세포는 주변의 유리 영역이 아닌 이러한 갈색 영역에만 부착되었습니다.

이 다른 프레임에서 다시 한 번 벗겨진 영역에 셀츠가 부착되는 것을 볼 수 있습니다. 그것들은 갈색 영역이지만 그 갈색 영역 위에서는 거의 볼 수 없으며 ITO 디자인 PEG는 이 ITO 디자인에서 제거되지 않았으므로 세포가 부착되지 않았습니다. 자, 그게 다입니다.

우리는 프로토콜로 끝났고 셀에는 ITO 전극에 패턴이 있으며 그것이 바로 우리가 원했던 것입니다. 방금 마이크로 제작된 광학적으로 투명한 인듐 10 산화물 전극의 세포 접착 제어를 보여드렸습니다. 오늘은 이 전극에 THREET 3개의 섬유아세포를 패턴화하는 방법을 보여드렸습니다.

우리는 또한 동일한 절차를 사용하여 G 간염 2 세포, 위성 세포 및 쥐 1 차 세포를 패턴화했습니다. 현재의 셀 패터닝 기술은 표면에서 두 가지 세포 유형만 조립할 수 있습니다. 이 기술의 유연성으로 인해 미래에 공간적으로 격리된 표면에 여러 세포 유형을 조립

우리는 이 기술을 사용하여 생체 내 미세환경을 모방하기 위해 ITO 기질에서 세 가지 다른 간 세포 유형을 공간적으로 분리할 계획입니다. 이를 통해 미성숙 세포 또는 줄기 세포를 성숙한 세포 및 지원 세포와 함께 공간적으로 분리할 수 있습니다. 이것은 미성숙 세포가 성장하고 분화할 수 있는 유익한 환경을 조성할 것입니다.