공명과 자연 래맨 Microspectroscopy에 형광 배경 거부

이 절차의 목적은 형광 신호를 거부하면서 라만 산란광은 통과시키는 모든 광학 보행을 구성하는 것입니다. 이것은 먼저 라만 산란을 여기시키고 편광시킴으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 게이트를 작동시키기 위해 펌프 빔을 준비하는 것입니다.

셋째, 펌프와 램 및 펄스가 겹치도록 조정해야 합니다. 절차의 마지막 단계는 시간 게이트 스펙트럼을 획득하는 것입니다. 궁극적으로 신호 대 잡음비가 높은 라면 신호의 분석을 통해 생화학적 정량화 및 분류를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

형광 배경의 소프트웨어 제거와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 형광에 의해 생성되는 샷 노이즈가 크게 감소한다는 것입니다. 이 방법은 박테리아 세포 및 조직에서 내인성 플루어의 화학적 조성에 대한 비침습적 특성화, 내인성 마커를 사용하여 암, 혈관 또는 신경퇴행성 질환과 같은 세포 과정 및 질병에 대한 이해와 같은 생물학 및 생물 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 또한 형광 및 RAM 라벨뿐만 아니라 혈액 분석을 위한 비침습적 의료 센서로 사용할 수 있는 새로운 프로브를 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 생물 의학 공학을 위한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 바이오 연료, 연구 또는 통신 산업과 같은 다른 분야에도 적용할 수 있습니다. 생물학적 샘플은 일반적으로 ATO Fluor 세포 챔버에 장착된 1번 두께의 커버 슬립에 배치됩니다.

액체 샘플, 특히 인간에게 독성이 있는 액체 샘플은 실리콘 에폭시를 사용하여 개구부에 접착된 커버 슬립이 있는 작은 유리병에 넣은 다음, 시간 게이트 라면 스펙트럼을 취하기 위해 자체 독립적인 초점 제어 기능이 있는 현미경 스테이지 상단에 장착된 보조 스테이지에 샘플을 놓고 측정합니다. 첫째, 여기 빔을 적절하게 준비해야 합니다. 2.4와트 조정 가능한 펄스 GI 사파이어 레이저에서 나오는 빛으로 시작하십시오. 80 메가헤르츠 펄스 트레인의 각 펄스는 30 나노 줄의 에너지, 140 펨토초의 시간 폭 및 808 나노미터를 중심으로 하는 스펙트럼을 가져야 하며 약 6 나노미터의 스펙트럼 대역폭을 가져야 후방 반사가 레이저 캐비티로 재진입하는 것을 방지하기 위해 빛은 패러데이 아이솔레이터 장소, 패러데이 아이솔레이터 이전의 반파 플레이트를 통과하여 로 전송되는 총 전력의 지속적인 튜닝을 허용해야 합니다. 체계.

6나노미터는 대부분의 라멘 모드를 해결하기에는 대역폭이 너무 넓기 때문에 빔은 매우 좁은 대역 통과 필터를 통해 전송됩니다. 808나노미터로 보냅니다. 다음으로, 방향족 더블릿을 사용하여 5mm 베타 바륨 보어에 빛을 집중시킵니다.

808 나노 미터에서 404 나노 미터로 파장의 절반에 8 개의 결정. 베타 바륨 베이트 크리스탈을 변환 스테이지에 장착된 팁 및 틸트 컨트롤이 있는 마운트에 놓습니다. 파장 변환의 효율성을 극대화하려면 결정이 doublet의 초점에 대해 정확하게 대칭으로 배치되고 결정 축이 들어오는 빔의 편광에 정렬되도록 배치해야 합니다.

파장 변환의 효율성은 편광에 따라 달라지기 때문에 샘플로 전송되는 빛의 양에 대한 제어는 패러데이 아이솔레이터 뒤에 두 번째 반파 플레이트를 배치하여 얻을 수 있습니다. 이 파동 판을 회전시킴으로써, 샘플로 보내지는 빛의 강도는 펌프 빔에서 보내진 강도와 독립적으로 조정될 수 있습니다. 그런 다음 파장 변환된 광은 여기 빔이 현미경 대물렌즈의 후면 조리개를 채울 수 있을 만큼 충분히 크고 두 개의 스티어링 미러를 통해 도립 현미경으로 향하도록 선택된 두 번째 방향족 이중선에 의해 다시 시준됩니다.

microscope objective는 excitation beam을 이 축에 정렬하기 위해 optic axis를 정의합니다. 현미경의 샘플 평면에 거울을 놓습니다. 그런 다음 두 개의 스티어링 미러를 반복적으로 조정하면서 현미경의 이미징 포트에 부착된 CCD 카메라에서 후면 반사 레이저 빔을 관찰합니다.

카메라의 이미지가 현미경의 시야의 중앙에 있다고 가정하면 빔은 축에 있습니다. 초점이 현미경 칩의 중앙에 있을 때 Z축을 따라 대물렌즈의 이동은 변경되지 않습니다. 초점이 벗겨진 빔 라면 산란의 중심점은 샘플이 샘플 평면에 배치되고 레이저 광이 조사될 때 발생합니다.

microscope objective 아래에 배치된 dichroic filter는 이동된 파동을 분리합니다. 라면은 여기 빔에서 빛을 산란시켜 라면을 현미경의 측면 포트로 유도합니다. 현미경은 이 경로 내에 있는 모든 렌즈를 제거하도록 수정되었으며, 현미경에서 나오는 신호 빔이 땀샘의 투명한 조리개보다 크기 때문에 코팅된 현미경에서 신호광이 나오도록 했습니다.

Thompson polarizers는 두 개의 방향족 이중선으로 구성된 0.47배 망원경으로 빔을 축소하는 데 사용됩니다. 그런 다음 신호광은 실험실 프레임에서 수직에 대해 0도 배향의 글랜드 Thompson 편광자에 의해 편광되고 이색성 거울로 향하게 되어 펌프 빔과 재결합됩니다. 펌프 빔은 서로 직각을 이루는 두 개의 미러로 구성된 지연 라인으로 보내지며, 둘 다 펌프와 신호 펄스의 시간적 중복을 보장하도록 조정할 수 있는 선형 변환 스테이지에 배치됩니다.

지연선 이후, 빔은 중간 플레이트와 편광판을 통해 실험실 프레임에서 수직을 기준으로 45도 방향으로 보내집니다. 이것은 펌프 빔이 비선형 매체에 도달할 때 적절한 분극 상태를 보장합니다. 그런 다음 빛은 압전 제어 장치가 있는 두 개의 스티어링 미러에서 반사되며, 이를 사용하여 신호 빔과 공간적으로 겹치도록 펌프 빔의 위치를 최종적으로 조정해야 합니다.

이러한 오버랩을 얻기 위해 첫 번째 스티어링 미러를 사용하여 가까운 지점에서 두 개의 빔을 겹치고 피조 미러를 사용하여 먼 지점에서 빔을 겹치게 하여 빔이 결합되는 이색성 미러에서 가까운 위치와 먼 곳의 두 위치에서 펌프 및 신호 빔을 관찰하면 펌프 빔을 신호 빔과 정확히 같은 높이로 만들 수 있습니다. 다음으로, 수집된 시간 게이트 신호를 최대화하도록 골판지 및 수집 시스템을 설정해야 합니다. 이를 위해 펌프와 신호 빔은 먼저 404나노미터에서 OD가 6인 diic 필터를 통과하여 잔류 여기광이 비선형 매체 내에서 여기되고 산란되는 것을 방지합니다.

그런 다음 펌프 및 신호 빔은 방향족 이중선에 의해 비선형 재료, 적절하게 높은 비선형 지수와 적절하게 짧은 시간적 응답을 갖는 비선형 재료를 포함하는 1cm 경로 길이의 석영 베트로 초점을 맞춥니다. 여기. 이러한 실험을 위해 우리는 황화탄소를 사용합니다. 그런 다음 빛은 첫 번째 초점거리와 동일한 초점 거리를 가진 두 번째 이중선에 의해 다시 시준됩니다.

그런 다음 빔은 회전 마운트의 글랜드 톰슨 분석기를 통과한 다음 808나노미터에서 OD가 10인 흡수 및 간섭 필터 세트를 통과합니다. 마지막으로, 신호광은 50 미크론 다중 상태 광섬유로 방향족 이중선에 의해 집중되며, 여기서 광섬유는 X, Y 및 Z.The 광섬유에 번역을 허용하는 단계에 장착 된 다음 CCD 카메라가 부착 된 상업용 이미징 분광기에 결합되어 수집 시스템을 정렬하여 수집 신호를 최대화합니다. 분석기를 0도로 설정하고 샘플 평면에 톨루엔 테스트 샘플을 배치하고, 펌프와 신호 빔의 적절한 공간 및 시간 겹침을 보장하기 위해 광섬유 마운트의 X, Y 및 Z 컨트롤을 조정하여 수집된 라만 신호를 최적화합니다. 현미경의 샘플 평면에 거울을 놓습니다.

그런 다음 시스템에서 404 나노미터 필터를 제거합니다. 분석기를 90도로 회전하여 역반사 404나노미터 빔이 카메라를 포화시키지 않도록 강도를 조정한 상태로 분광기로 보내집니다. 이제 펌프 빔을 끈 상태에서 분석기를 회전하여 전송된 404나노미터 신호를 최소화합니다.

그런 다음 펌프 빔을 다시 켜고 404나노미터 빛의 투과율이 증가하기 시작할 때까지 지연 단계를 천천히 조정합니다. 다음으로 지연 단계, 압전 미러 및 광섬유의 X, y 및 Z 컨트롤을 반복적으로 돌려 레트로 반사된 404 나노미터 빔과 라만 산란광이 시스템을 통해 약간 다른 경로를 취할 수 있기 때문에 신호를 최대화합니다. 샘플 스테이지에 톨루엔과 같은 강력한 라만 스캐터를 배치하고, 라만 필터를 교체하고, 지연 스테이지, pizo electric mirror, 광섬유의 X, Y 및 Z 컨트롤을 변경하여 정렬을 약간 조정하여 최종 조정을 수행하여 라만 신호를 최적화합니다.

이제 시스템이 스펙트럼을 수집할 준비가 되었습니다. 이를 위해서는 먼저 시스템 아티팩트를 수정하기 위해 여러 배경 곡선을 획득해야 합니다. 먼저 분석기를 0도로 설정하고 여기 빔을 켜고 펌프 빔을 끕니다.

비격자 스펙트럼을 얻은 다음 분석기를 90도로 설정하고 편광판을 통해 누출되는 미광을 나타내는 배경 스펙트럼을 수집합니다. 그런 다음 분석기를 90도로 유지한 상태에서 라면 빔을 끄고 펌프 빔을 켭니다. 이색성 필터를 통해 누출되는 펌프 광의 양을 나타내는 두 번째 배경 스펙트럼을 수집합니다.

마지막으로, 모든 레이저를 끈 상태에서 카메라와 전자 장치의 암전류 수준을 나타내는 기준선 다크 스펙트럼을 수집합니다. 마지막으로 모든 빔을 켜고 게이트 스펙트럼을 수집합니다. 게이트를 통과하는 빛의 실제 스펙트럼을 얻으려면 이 게이트 스펙트럼에서 두 개의 배경 스펙트럼과 어두운 스펙트럼을 빼야 합니다.

여기에서 골판지 시스템의 개략도를 볼 수 있습니다. 펌프 빔 경로는 빨간색 실선으로 표시되고 SHG 경로는 해군 실선으로 표시됩니다. 라면과 형광이 겹치는 경로는 녹색으로 표시됩니다.

형광이 일시적으로 필터링된 경로는 노란색으로 표시됩니다. 여기서 우리는 이멀젼 오일에 용해된 쿠마린의 원시 스펙트럼을 볼 수 있습니다. 빨간색 곡선은 게이트를 열어 둔 상태에서 촬영한 스펙트럼을 나타내고, 검은색 곡선은 최소 투과를 위해 정렬되고 펌프 빔이 적용된 분석기로 촬영한 스펙트럼을 나타냅니다.

파란색 곡선은 최소 투과율을 위해 정렬되고 펌프 빔이 적용되지 않은 상태에서 측정된 스펙트럼을 나타내고, 녹색 곡선은 펌프 빔만 적용된 상태에서 측정한 스펙트럼을 나타냅니다. 모든 스펙트럼은 11 포인트 3 차 KY 골 필터로 매끄럽습니다. 파선된 자홍색은 다음 그래프에 표시된 스펙트럼 영역을 나타냅니다.

여기서 우리는 형광 배경 빼기 후 침지 오일에 용해된 쿠마린의 스펙트럼을 볼 수 있습니다. 빨간색 곡선은 게이트가 열린 상태로 유지되는 스펙트럼이고 파란색 곡선은 게이트 스펙트럼입니다. 게이트 스펙트럼은 오일의 복잡한 높은 파수, 피크 특성을 명확하게 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 레이저는 먼저 ga를 구동하기에 충분한 펄스 에너지를 가져야 하며 시스템은 두 펄스의 절묘한 공간적 및 시간적 겹침을 필요로 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청하고 첨부된 프로토콜을 읽은 후에는 레이저 빔을 여기 빔과 곡선 빔으로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 두 빔을 공간적으로나 시간적으로 겹치는 방법.

분광기와 C, c, D를 통해 라면 신호를 기록하는 방법과 라면 신호를 시각화하고 분석하는 방법. 레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 시도하는 동안 항상 레이저 고글 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 비선형 재료의 사용 및 특정 샘플의 사용에는 추가 안전 규칙이 적용됩니다.