Name: 공명과 자연 래맨 Microspectroscopy에 형광 배경 거부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: 학습하세요 초고속 전광학 스위칭을 이용한 형광 배경 거부 기술로 라만 산란광을 선택적으로 통과시키는 방법을. 생물학적으로 안전한 조건에서 높은 신호 대 잡음비로 생화학적 정량 분석이 가능합니다.

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이 작품은 NSF 상을 DB​​I 0,852,891에 의해 투자되었다. 이 작품의 일부는 공동 계약 번호 PHY0120999 아래 캘리포니아 데이비스 대학에 의해 운영 Biophotonics 과학 기술, 지정된 NSF 과학 기술 센터 센터 투자했다.

1. 일부 보험이 시스템 내의 래맨 샘플을 준비하고 배치에서 찍은해야합니다. <ol><li> 시스템이 일반적으로 매우 짧은 작업 거리와 함께 매우 높은 수치 조리개 목표를 이용하게하기 때문에 샘플은 coverslip에 표시됩니다. 생물 학적 시료는 일반적으로 Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)에 탑재된 제 1 두께 coverslip에 표시됩니다. </li><li> 특히 액체 샘플, 인간에게 유독 사람은 실리콘 에폭시를 통해 개방에 초경 coverslip있는 작은 유리병에 배치됩니다. 병 그 다음 측정을 위해 거꾸로 수 있습니다. </li><li> Google 시스템은 펌프 및 신호 펄스의 정확한 타이밍에 의존하기 때문에, 우리는 목표를 위아래로 번역 우리 현미경의 종래의 초점 조정을 사용하지 않기로 제약합니다. 이것은 추가 및 시스템에서 광 경로를 차감됩니다. 대신, 우리는 자체의 독립적인 포커스를 제어 현미경 스테이지 위에 장착 보조 무대에서 우리의 샘플을 넣으십시오. </li></ol> 2. 시간 문이 래맨 스펙트럼을 이용하려면, 여기 빔 제대로 준비를해야합니다. <ol><li> Sapph 레이저 (카멜레온, 일관된 시스템, 산타 클라라, CA) : 우리는 빛이 2.4 W 조정할 펄스 티의 새로운 시작. 80 MHz의 펄스 열차의 각 펄스 에너지의 30 NJ가 140 FS의 시간적 너비를 가지고 있으며, ~ 6 NM의 스펙트럼 대역폭과 808 nm의 중심 스펙트럼 있습니다. </li><li> 레이저 캐비티를 다시 입력으로부터 - 반사를 방지하기 위해 조명은 패러데이 아이 솔 레이터를 통해 전달됩니다. 패러데이 아이 솔 레이터 앞에 배치 반 파장 판은 시스템에 보낸 총 전력의 지속적인 튜닝을 수 있습니다. </li><li> 6 NM 가장 래맨 모드를 해결하기 위해 너무 광범위 대역폭이기 때문에, 빔은 808 nm의 중심은 매우 좁은 (0.8 nm의 FWHM, 앤도버 공사, 살렘, NH) 대역 통과 필터를 통해 전송됩니다. </li><li> 빛이 후 결정이 (CASIX, 복주, 복건, PR 중국) 808의 nm의 404 nm의로의 파장을 절반으로 5mm β - 바리움 Borate (BBO)에 비염 색 성의 이중어 (F = 100mm)에 의해 초점을 맞추고 있습니다. BBO 크리스탈은 팁 및 틸트 컨트롤 마운트에 배치하고, 또한 번역 무대에서 마운트됩니다. 파장 변환의 효율성을 최대화하기 위해, 결정은 이중어의 초점에 대해 정확하게 대칭 배치하고, 그 결정 축은 들어오는 광선의 편광에 정렬과 함께해야합니다. </li><li> 파장 변환 효율은 편광에 의존하기 때문에, 샘플로 보내 빛의 양을 제어할는 패러데이 아이 솔 레이터 후 하반기 - 웨이브 플레이트를 삽입하여 얻을 수 있습니다. 이 waveplate 회전하여 샘플로 보내 빛의 강도는 독립적으로 펌프 빔 (아래에 설명되어 수)에 보낸 강도 조정할 수 있습니다. </li><li> 파장 - 변환 빛이 종료 광선이 현미경의 목표의 뒤에 조리개를 채울 정도로 크고, 그리고 거꾸로 현미경 (IX - 71, 올림푸스로 이동합니다 그러한 선택한 두 번째 비염 색 성의 이중어 (F = 500mm)에 의해 recollimated입니다 이 스티어링 거울을 통해 센터 밸리, PA). </li><li> 시스템의 가장 단일 구성 요소 내에 위치해 광학 요소되고있는 현미경의 목표는, 광학 축을 정의합니다. 이 축에 여기 빔을 정렬하려면 미러는 현미경의 샘플 비행기에 배치됩니다. CCD 카메라 시대 (μEye, IDS, Obersulm, 독일) 현미경의 영상 포트에 연결된에서 백 반영 레이저 광선을 관찰하면서 두 조향 미러는 다음 반복 조정됩니다. 카메라에있는 이미지가 현미경의 필드의 전망을 중심으로 중이라고 가정할 때, 광선의 초점 자리가 Z - 축을 따라 목표의 현미경 칩 및 번역 중심에서 축 중심 지점을 변경하지 않는 것입니다 defocused 빔니다. </li><li> 샘플은 샘플 비행기에 배치하고 함께 조사하면 레이저 광 래맨 산란이 발생합니다. 현미경 목표 아래 배치 이색성 필터는 현미경의 측면 포트에 래맨 흩어져 빛을 연출, 여기 빔의 파장 - 이동 래맨 흩어져 빛을 (및 형광) 분리. 현미경은 신호 빛이 collimated 현미경에서 나온다 그러한이 경로 내의 모든 렌즈를 제거 바뀌었습니다. </li><li> 현미경에서 새로운 신호 빔은 글랜 - 톰슨 polarizers의 명확한 구경보다 큰이기 때문에, 0.47x 망원경은 광선을 축소하는 데 사용되는 두 비염 색 성의 doublets (F1 = 75mm, F2 = 35mm)의 건설. </li><li> 신호 표시등은 다음 실험실 프레임에 수직과 관련하여 0 °에서 지향 글랜 - 톰슨 편광으로 편광, 그리고 그것이 펌프 빔과 recombined하는 이색성 거울로 이동합니다. </li></ol> 3. 피크 효율에서 작동하는 광 게이트 위해서,주의뿐만 아니라 펌프 빔 (커 빔)의 준비에 촬영해야합니다. <ol> 펌프 펄스 먼저 신호 빔의 최종 크기를 일치 두 비염 색 성의 doublets (F1 = 35mm, F2 = 100 ㎜)과 건설 망원경으로 0.35x로 확대됩니다. <li> 펌프 빔은 다음 펌프 및 신호 펄스 (아래에 설명되어 수 조정)의 시간적 중복을 보장하기 위해 조정할 수 있습니다 선형 변환 스테이지에 배치 직각 프리즘으로 구성된 지연 라인으로 전송됩니다. </li><li> 지연 선 후, 빔은 실험실 프레임에 수직에 대하여 45 °의 지향 반 파장 판과 편광을 통해 전송됩니다. 그것은 비선형 매체에 도달하면 이것은 펌프 빔의 적절한 편광 상태를 보장합니다. </li><li> 빛이 후 잘게 펌프 빔의 위치를​​ 조정하는 데 사용되는 두 스티어링 거울, 압전 컨트롤과 함께 하나의에서 반영 같은 신호 빔과 공간이 중복되는. 중복은 두 위치 한 닫고 ​​대들보가 결합되어 이색성 거울에서 멀리 떨어진 하나 펌프 및 신호 광선을 관찰함으로써 얻어진다. 가까운 지점과 멀리 지점에서 빔을 오버랩하는 압전 미러에 두 개의 대들보를 중복을 가장 먼저 조향 미러를 사용하여 펌프 빔은 신호 빔을 정확히 collinear을 만들 수 있습니다. </li><li> 두 대들보가 결합으로 커 게이트 및 수집 시스템은 수집된 시간 문이 신호를 최대화하기 위해 설정됩니다. </li></ol> 4. 두 대들보가 결합으로 커 게이트 및 수집 시스템은 수집된 시간 문이 신호를 최대화하기 위해 설정됩니다. <ol><li> 펌프 및 신호 빔을 먼저 비선형 매체 내의 흥미로운 래맨 산란에서 잔여 여기 조명을 방지하기 위해 404 nm의 6의 OD를 가진 이색성 필터를 통해 전달됩니다. </li><li> 펌프 및 신호 들보는 모두 비선형 물질을 포함하는 1cm의 pathlength 석영 쿠베트에 비염 색 성의 이중어 (F = 35mm)의 초점을 다음 있습니다. 적당히 높은 비선형 인덱스 (CS 2보다 높은), 그리고 적당히 짧은 시간적 응답 (&lt;2 PS)하는 데 모든 비선형 자료는 여기를 이용하실 수 있습니다. 이 실험을 위해, 우리는 비선형 인덱스 N 2 = 3.1 × 10 -18 m 2 / W.을 가지고 이황화 탄소, CS 2 사용 빛이 그런 다음 첫 번째와 동일 초점 거리와 두 번째 쌍으로 된 것으로 recollimated 있습니다. </li><li> 광선은 다음 808 nm의 10의 OD를 결합하여 그 흡수와 간섭 필터의 집합을 통해 다음 통과 및 회전 마운트에 글랜 - 톰슨 분석기, 그리고 수 있습니다. </li><li> 마지막으로, 신호 조명은 섬유가 X, Y, 그리고 Z '의 번역을 허용하는 단계에 마운트되어 50 μm의 다중 모드 광섬유로 비염 색 성의 이중어 (F = 35mm)의 초점을 맞추고 있습니다 섬유는 다음 첨부 CCD 카메라 (SP2300i 각각 Pixis 100B, 프린스턴 인 스트 루먼트, 트렌 튼에서 제조한 모두, NJ)과 상업 영상 분광기로 결합됩니다. </li><li> 수집된 신호를 최대화하기 위해 수집 시스템을 정렬하려면 분석기은 0으로 설정됩니다 °과 톨루엔의 테스트 샘플은 샘플 비행기에 배치됩니다. X, Y, 그리고 섬유 마운트의 Z 컨트롤을 조정하여, 수집된 래맨 신호가 최적화되어 있습니다. </li><li> 펌프 및 신호 빔의 적절한 공간과 시간적 중복을 보장하기 위해, 거울은 현미경의 샘플 비행기에 배치됩니다. 404 NM 필터는 시스템에서 제거됩니다. 분석기는 90 ° 회전 retroreflected 404 NM 빔 그것은 카메라를 포​​화하지 않는 등 조정 강도와 분광기로 전송됩니다. 에서 펌프 빔과 함께, 분석기는 전송된 404 nm의 신호를 최소화하기 위해 회전합니다. 펌프 빔 다시 켜져있는 404 나노미터 빛의 전송이 증가하기 시작 때까지 지연 단계는 천천히 조정합니다. 그런 다음, 반복하여 지연 무대, 압전 미러를 조정하고, X, Y, 그리고 Z 섬유의 컨트롤은, 하나는 신호를 극대화할 수 있습니다. </li><li> 404 NM 빔과 래맨 흩어져 빛을 시스템을 통해 약간 다른 경로를 걸릴 수 있습니다 역전사이 반영되기 때문에 최종 조정은을 변경하여 샘플 단계와 약간 조정 정렬에 강한 래맨 scatterer (예 : 톨루엔 등) 배치에 의해 만들어진 지연 무대, piezeo - 전기 거울, 그리고 섬유의 X, Y, 그리고 Z 컨트롤은 래맨 신호를 최적화할 수 있습니다. </li></ol> 5. 한 시간 문이 래맨 스펙트럼의 컬렉션은 몇 가지 스펙트럼의 취득 시스템 아티팩트에 대한 해결하기 위해 필요합니다. <ol><li> 분석기가 0 °에 여기 빔과 해제 펌프 빔 설정을 통해 "ungated"스펙트럼은 시간 게이팅 시스템의 혜택없이 취득 될 스펙트럼을 나타내는, 촬영입니다. </li><li> 분석기는 90 °, 여기 빔과 펌프 빔 아직 해제로 설정으로 다시 지상 스펙트럼은 시스템에서 polarizers 및 기타 요소를 통해 유출 길잃은 빛의 양을 나타내는, 촬영입니다. </li><li> 와 함께 90에서 남은 분석기 °그리고 모든 광선, "문이"스펙트럼이 펌프 빔의 존재에 의해 넘어 polarizers을 통해 허용 래맨 흩어져 빛을 대표, 촬영입니다. </li><li> 마지막으로, 아직 90 °에서 분석기로, 여기 빔 해제 및 펌프 빔은 두 번째 백그라운드 스펙트럼은 분광기를 입력 808의 NM 라이트의 잔여 금액의 "문이"스펙트럼에 기여 대표, 촬영입니다. </li><li> 또한, 스펙트럼은 카메라와 전자 제품의 기준 "어둠"의 신호 레벨을 특성화,에서 모든 레이저와 함께 이루어집니다. </li><li> 일반적인 문제를 몇 분 걸쳐 통해 데이터를 수집하면 - 스펙트럼 종종 긴 통합 시간을 필요로하기 때문에, 그것은 우주 광선의 적절한 교정 수 있도록 여러 조각 (프레임)에 해당 통합 시간을 깰 필수적입니다. </li></ol> 6. 일단 인수, 여러 처리 단계는 데이터의 품질과 외관을 개선하기 위해 도움이됩니다. <ol><li> 첫째, 모든 스펙트럼은 어둡 "어둠"의 스펙트럼을 빼서에 의해 수정됩니다. </li><li> 우주 광선에 대한 해결하려면 하나의 인수를 구성 여러 개의 프레임은 픽셀별로 픽셀 단위로 서로 비교됩니다. 모든 프레임에 걸쳐 해당 픽셀에 대한 평균 값에서 2 중간 편차 이외의 떨어지는 모든 프레임의 모든 픽셀에 대한, 그 픽셀의 가치는 모든 프레임에 걸쳐 평균 값으로 대체됩니다. </li><li> 우주 레이 수정된 프레임은 다음 평균 및 Savitzky - 골레이 필터 1 smoothed 있습니다. </li><li> "진정한"문이 스펙트럼을 추출하려면, 우리는 측정 문이 스펙트럼에서 "펌프 전용"스펙트럼 "여기 전용"을 빼야합니다. </li><li> 마지막으로, 문이 및 ungated 스펙트럼 다음 리버와 Mahadevan - 얀센 2의 방법을 사용하여 결정 5 일 주문 다항식을 빼서하여 정정 배경입니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 커 게이팅 시스템의 개략도 다이어그램. SHG 경로가 파란색으로 표시되는 동안 펌프 빔 경로가 빨간색으로 표시됩니다. 형광이 temporally 필터링되었습니다 경로가 노란색으로 표시되는 동안 래맨와 형광이 overlapped되는 경로는 녹색으로 표시됩니다. 다음과 같은 약어 : BPF, 밴드 패스 필터, CCD, 전하 결합 소자, DCM, 이색성 거울, FI, 패러데이 아이 솔 레이터, λ / 2, 반 파 판, LPF, 긴 패스 필터, NLM, 비선형 매체, P, 편광 ; SHG 두번째 고조파 세대 크리스탈. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 위로 :. 침지 기름에 용해 coumarin의 원시 스펙트럼. 빨간색 곡선 (분석기는 최대 전송 설정) 오픈 개최되는 게이트와 함께 찍은 스펙트럼을 보여줍니다. 블랙 곡선 최소 전송 및 펌프 빔 적용 (문이 스펙트럼)에 대한 정렬 분석기와 함께 찍은 스펙트럼을 보여줍니다. 블루 곡선 최소 전송없이 펌프 빔 적용에 대한 정렬 분석기와 함께 찍은 spectum (게이트 폐쇄 개최)를 보여줍니다. 그린 곡선은 펌프 빔이 적용된 취한 스펙트럼을 보여줍니다. 점선 마젠타 라인은 아래 패널에 표시되는 스펙트럼 영역을 나타냅니다. 모든 검사 결과는 11 점, 3 순서대로 Savitzky - 골레이 필터 smoothed되었습니다. 하단 : 형광 배경 제거 후 침지 기름에 용해 coumarin의 스펙트럼. 레드 곡선은 게이트와 스펙트럼이 열려 개최하고, 파란색 곡선은 문이 스펙트럼이다. 문이 스펙트럼은 명확 오일의 뒤얽힌 높은 wavenumber 피크 특성을 보여줍니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

의생명 래맨 ​​분광법의 분야는 생물 학적 진단에 몇 가지 어려운 문제를 해결에 대한 입증 가능성의 결과로 지난 몇 년간 증가하고 관심을 보여줬습니다. 예를 들어, 래맨 스펙트럼은 암 탐지 3, 4, 5, 6에서 진단 가치를 가지고 표시되었습니다. 래맨 분광법은 세균 quantitation 7, 8 및 세균성 약물 반응 9도 사용되고 있습니다. 그것은 또한 뼈 건강에서 10 biofluid 분석 11, 12에 이르기까지 다른 생명 의학 어플 리케이션의 광범위한 응용 프로그램을 발견했습니다. 는 매우 약한 단면 같은 잠재력에도 불구하고, 그러나, 래맨 분광법은 대부분의 생물 학적 시스템에서여 - 이리에 큰 장벽을하고 있습니다. 따라서, 래맨 신호를 쉽게도 매우 겸손한 형광 배경에 압도 수 있습니다. 많은 기술은 형광 lineshape 2, 13, 14 제거 존재...

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 렌즈 </td><td> ThorLabs </td><td> 여러 </td><td> 1퍼센트 각각의 최대 전송 손실을 가지고 올 코팅 렌즈 </td></tr><tr><td> 조정할 수있는 티 : Sapph 레이저 </td><td> 응집 성의 </td><td> 카멜레온 </td><td> 30 NJ, 200 FS, 80 MHz의 </td></tr><tr><td> 40X 기름 침지 목표 </td><td> 올림푸스 </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1.35 </td></tr><tr><td> 거꾸로 현미경 </td><td> 올림푸스 </td><td> IX - 71 </td><td> 측면 포트의 모든 렌즈를 제거하기 위해 수정 </td></tr><tr><td> 하프 웨이브 플레이트 </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M - 600 </td><td></td></tr><tr><td> 글랜 - 톰슨 편광자 </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ 10 %의 전송 손실 </td></tr><tr><td> 분광계 </td><td> PI 액튼 </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI 액튼 </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Mathmatical 소프트웨어 </td><td> MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> 버전 2008a </td></tr><tr><td> 패러데이 아이 솔 레이터 </td><td> EOT </td><td> BB8 - 5I </td><td></td></tr><tr><td> 압전 거울 </td><td> 뉴 포트 </td><td> AG - M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO 결정 </td><td> CASIX </td><td> 사용자 정의 </td><td> 1mm 두께 </td></tr><tr><td> 대역 통과 필터 1 </td><td> 앤도버 </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0.4 nm의 </td></tr><tr><td> 이색성 거울 </td><td> Semrock </td><td> FF662 - FDI01 </td><td> 662 NM에서 대역 에지 </td></tr><tr><td> 롱 - 패스 필터 </td><td> Semrock </td><td> BLP01 - 405R </td><td> 417 NM에서 대역 에지 </td></tr><tr><td> 대역 통과 필터 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 NM </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 335266 </td><td> 99 % 순도 </td></tr><tr><td> Coumarin 30 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 546127 </td><td> 99 % 순도 </td></tr><tr><td> 집중 오일 </td><td> Cargille </td><td> 16,242 </td><td> 유형 DF </td></tr></tbody></table>

공명과 자연 래맨 microspectroscopy에 형광 배경 거부

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

래맨 분광법은 종종 특히 생물 학적 샘플, 강한 형광 배경에 의해 퍼진. 샘플이 ultrafast 펄스, temporally timescale은 분리 수 picosecond에 신호를 중복 spectrally 분리 수있는 시스템의 기차와 흥분되면 즉시 늦게 도착 형광 빛으로부터 래맨 흩어져 빛을 도착. 여기 래맨과 형광 신호를 분리하기 위해 저전력 광 커 게이트의 형태로 모든 광학 스위​​칭을 사용하는 복잡한 비선형 광학 시스템의 건설과 운영을 논의. 평균 전력 80 MHz의 반복 속도의 2.4 W와 함께 하나의 808 nm의 레이저는 래맨 비산들을 흥분시키기 위해 샘플로 전송 404 nm의 라이트의 &lt;5 MW로 변환되는 808의 NM 라이트의 약 200 MW로, 분할이다. 나머지 변하지 않은 80​​8의 NM 라이트는 다음의 모든 광학 셔터를위한 펌프 역할을 비선형 매체로 전송됩니다. 셔터가 약 5 %의 피크 효율 800 FS의를 열고 닫습니다. 이 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 펄스 에너지와 생물학적으로 안전하게 유지 평균 파워를 사용하여 80 MHz의 반복 속도 래맨 및 형광 신호를 분리 수 있습니다. 시스템이 광학 전력 측면에 여분의 용량이 없기 때문에, 우리는 몇 가지 세부 설계 및 정렬 고려하는 시스템의 처리량을 극대화에 도움. 우리는 또한 커 매체 내의 신호 및 펌프 빔의 공간적 시간적 및 중복뿐만 아니라 스펙트럼 획득을위한 상세한 프로토콜을 얻기위한 프로토콜을 논의합니다. 마지막으로, 우리는 시간 게이팅 시스템을 사용 강한 형광의 존재에서 얻은 래맨 스펙트럼의 몇 가지 대표적인 결과를보고합니다.

우리는 형광 신호에서 래맨 격리 ultrafast 모든 광학 스위​​칭을 사용하는 복잡한 비선형 광학 시스템의 건설과 운영을 논의. 이 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 펄스 에너지와 생물학적으로 안전 유지에 관한 능력을 활용 래맨 및 형광 신호를 분리 수 있습니다.

공명과 자연 래맨 Microspectroscopy에 형광 배경 거부

라만 분광법은 특히 생물학적 시료의 경우 강한 형광 배경 잡음으로 인해 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 만약 시료가 ...의 펄스 열로 여기되면

이 절차의 목적은 형광 신호는 차단하고 라만 산란광만 통과시키는 전광학 게이트를 구축하는 것입니다. 이는 먼저 라만 산란을 여기시키고 편광시킴으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 게이트를 작동시키기 위해 펌프 빔을 준비하는 것입니다.셋째, 펌프, 램 및 펄스가 서로 겹치도록 조정해야 합니다. 절차의 마지막 단계는 시간 게이트 스펙트럼을 획득하는 것입니다. 결과적으로, 높은 신호 대 잡음비를 갖는 라만 신호 분석을 통해 생화학적 정량화 및 분류 결과를 얻을 수 있습니다.형광 배경을 소프트웨어로 제거하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 형광으로 인해 발생하는 샷 노이즈(shot noise)가 현저히 감소한다는 점입니다. 이 방법은 박테리아 세포 및 조직 내 내인성 형광체의 화학적 조성에 대한 비침습적 특성 분석, 고유 마커를 이용한 세포 프로세스 및 암, 혈관 질환 또는 신경퇴행성 질환과 같은 질병의 이해 등 생물학 및 의생명 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 형광 및 RAM 라벨로 모두 사용할 수 있는 새로운 프로브의 개발뿐만 아니라 혈액 분석을 위한 비침습적 의료 센서 개발에도 기여할 수 있습니다.이 방법은 생명공학을 위한 생물학적 시스템에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 바이오 연료 연구나 통신 산업과 같은 다른 분야에도 적용될 수 있습니다. 생물학적 시료는 일반적으로 ATO Fluor 셀 챔버에 장착된 1번 두께의 커버 슬립 위에 배치합니다.액체 샘플, 특히 인체에 독성이 있는 샘플은 소형 유리 병에 넣고 개구부를 실리콘 에폭시로 밀봉한 커버 슬립으로 덮은 뒤, 측정을 위해 이를 뒤집어 놓습니다. 샘플을 현미경 스테이지 상단에 장착된 보조 스테이지에 배치하는데, 이 스테이지는 시간 분해 라만 스펙트럼(time gated ramen spectra)을 얻기 위해 독립적인 초점 제어 기능을 갖추고 있습니다. 우선, 여기 빔(excitation beam)을 적절히 준비해야 합니다. 2.4 W 가변 파장 펄스 Ti:sapphire 레이저에서 나오는 빛으로 시작합니다. 80 MHz 펄스 열의 각 펄스는 30 nJ의 에너지와 140 fs의 시간 폭을 가져야 하며, 스펙트럼은 약 6 nm의 대역폭을 가지고 808 nm에 중심을 두어야 합니다. 후방 반사광이 레이저 공동으로 다시 들어가는 것을 방지하기 위해, 빛은 패러데이 격리기를 통과해야 합니다. 시스템으로 전달되는 총 전력을 연속적으로 조정할 수 있도록 패러데이 격리기 앞에 반파장판을 배치하십시오.6 nm는 대부분의 라만 모드를 분해하기에는 대역폭이 너무 넓기 때문에, 빔을 매우 좁은 대역 통과 필터에 통과시킵니다. 808 nm로 설정하십시오. 다음으로, 아크로매틱 더블렛을 사용하여 빛을 5 mm 베타 바륨 보레이트(BBO) 결정에 집중시킵니다.808 nm의 파장을 404 nm로 절반까지 줄이기 위해 8개의 결정을 사용합니다. 팁-틸트(tip and tilt) 제어 장치가 있는 마운트에 베타 바륨 보레이트(beta barium borate) 결정을 장착하여 이동 스테이지 위에 설치합니다. 파장 변환 효율을 극대화하려면 결정을 더블릿(doublet) 초점에 대해 정확히 대칭이 되도록 배치하고, 결정축을 입사빔의 편광 방향과 일치시켜야 합니다.파장 변환 효율은 편광에 따라 달라지므로, 패러데이 아이솔레이터 뒤에 두 번째 반파장판을 배치하여 시료로 보내는 빛의 양을 조절할 수 있습니다. 이 파장판을 회전시키면 펌프 빔으로 보내는 강도와는 독립적으로 시료에 도달하는 빛의 강도를 조정할 수 있습니다. 이후 파장 변환된 빛은 두 번째 아크로매틱 더블릿을 통해 다시 콜리메이션되는데, 이때 아크로매틱 더블릿은 여기 빔이 현미경 대물렌즈의 후면 개구부를 충분히 채울 수 있는 크기가 되도록 선택하며, 두 개의 스티어링 미러를 통해 도립 현미경으로 유도됩니다.현미경 대물렌즈는 광축을 정의하며, 이에 따라 여기 빔을 해당 축에 정렬합니다. 현미경의 시료 평면에 거울을 배치합니다. 그 후, 현미경의 이미징 포트에 부착된 CCD 카메라로 후방 반사된 레이저 빔을 관찰하면서 두 개의 조향 거울을 반복적으로 조정합니다.카메라의 이미지가 현미경 시야의 중심에 있다고 가정하면, 빔은 광축 상에 있는 것입니다. 초점 스팟이 현미경 칩의 중심에 위치하고 대물렌즈를 Z축 방향으로 이동시켜도 변화가 없을 때입니다. 디포커스된 빔의 라만 산란 중심점은 시료가 시료 평면에 놓이고 레이저 광으로 조사될 때 발생합니다.현미경 대물렌즈 아래에 배치된 이색성 필터(dichroic filter)는 파장이 이동된 라만 산란광을 여기 빔으로부터 분리하여 라만 산란광을 현미경의 측면 포트로 유도합니다. 현미경은 이 경로 내의 모든 렌즈를 제거하도록 수정되었으며, 이는 현미경에서 나오는 신호 빔이 글랜드(gland)의 유효 구경보다 크기 때문에 신호광이 현미경에서 그대로 나오게 하기 위함입니다.빔의 크기를 줄이기 위해 두 개의 방향족 더블렛(aromatic doublets)으로 구성된 0.47배 망원경인 Thompson 편광자를 사용합니다. 그 후 신호광은 실험실 좌표계의 수직 방향을 기준으로 0도로 정렬된 글랜드 Thompson 편광자(gland Thompson polarizer)에 의해 편광되며, 다이크로익 거울(dichroic mirror)로 유도되어 펌프 빔과 재결합됩니다. 펌프 빔은 서로 직각으로 배치된 두 개의 거울로 구성된 지연선(delay line)으로 보내지며, 두 거울은 펌프 펄스와 신호 펄스의 시간적 중첩을 보장하도록 조정 가능한 선형 이동 스테이지(linear translation stage) 위에 배치됩니다.지연선(delay line)을 거친 빔은 실험실 좌표계의 수직 방향을 기준으로 45도 각도로 배치된 반파장판(half-way plate)과 편광자를 통과합니다. 이는 펌프 빔이 비선형 매질에 도달했을 때 적절한 편광 상태를 유지하도록 하기 위함입니다. 그 후 빛은 두 개의 스티어링 미러에 의해 반사되는데, 그 중 압전 제어 장치가 부착된 미러를 사용하여 펌프 빔의 위치를 최종 조정함으로써 신호 빔과 공간적으로 중첩되도록 합니다.이러한 중첩을 얻으려면, 펌프 빔과 신호 빔을 다이크로익 거울(dichroic mirror)에서 가깝고 먼 두 지점에서 관찰하십시오. 첫 번째 스티어링 거울을 사용하여 가까운 지점에서 두 빔을 중첩시키고, 피조 거울(pizo mirror)을 사용하여 먼 지점에서 빔을 중첩시킴으로써 펌프 빔을 신호 빔과 정확히 일직선이 되게 할 수 있습니다. 다음으로, 수집된 시간 게이트 신호를 최대화하도록 코러게이트 및 수집 시스템을 설정해야 합니다. 이를 위해, 펌프 빔과 신호 빔을 먼저 404 nanometers에서 OD 6인 다이크로익 필터에 통과시켜 잔류 여기광이 비선형 매질 내에서 여기 및 산란되는 것을 방지합니다.그 후 펌프 빔과 신호 빔은 아크로매틱 더블렛(achromatic doublet)에 의해 비선형 물질이 포함된 경로 길이 1 cm의 석영 큐벳으로 집속되며, 적절하게 높은 비선형 굴절률과 충분히 짧은 시간 응답성을 가진 비선형 물질이라면 무엇이든 사용할 수 있습니다. 본 실험에서는 이황화탄소(carbon disulfide)를 사용합니다. 이후 빛은 첫 번째 더블렛과 초점 거리가 동일한 두 번째 더블렛에 의해 다시 콜리메이션(re-collimated)됩니다.그 다음 빔들을 회전 마운트에 설치된 Glan-Thompson 분석기에 통과시킨 후, 808 nanometers에서 합계 OD가 10인 일련의 흡수 및 간섭 필터에 통과시킵니다. 마지막으로, 신호광을 apochromatic doublet 렌즈로 집속시켜 50 micron 멀티모드 광섬유에 입사시키며, 이때 광섬유는 X, Y, Z축 이동이 가능한 스테이지에 장착됩니다. 그 후 광섬유를 CCD 카메라가 부착된 상용 이미징 분광계에 연결하여 수집 시스템을 정렬함으로써 수집되는 신호를 최대화하고, 분석기를 0도로 설정하며, 샘플 평면에 toluene 테스트 샘플을 배치합니다. 광섬유 마운트의 X, Y, Z 제어 장치를 조정하여 펌프 빔과 신호 빔의 공간적 및 시간적 중첩이 적절히 이루어지도록 하여 수집된 Raman 신호를 최적화합니다. 현미경의 샘플 평면에 거울을 배치합니다.그 다음 시스템에서 404 nanometer 필터를 제거합니다. 분석기를 90도로 회전시켜 역반사된 404 nanometer 빔이 분광계로 전달되도록 하고, 카메라가 포화되지 않도록 강도를 조절합니다. 이제 펌프 빔을 끈 상태에서 분석기를 회전시켜 투과되는 404 nanometer 신호를 최소화합니다.그런 다음 펌프 빔을 다시 켜고 404 nanometer 빛의 투과율이 증가하기 시작할 때까지 지연 스테이지를 천천히 조정하십시오. 다음으로, 역반사된 404 nanometer 빔과 라만 산란광이 시스템 내에서 약간 다른 경로를 거칠 수 있으므로, 신호를 최대화하기 위해 지연 스테이지, 압전 거울 및 파이버의 X, Y, Z 컨트롤을 반복적으로 조정하십시오. 톨루엔과 같은 강한 라만 산란체를 샘플 스테이지에 배치하고, 라만 필터를 교체한 뒤, 지연 스테이지, 압전 거울 및 파이버의 X, Y, Z 컨트롤을 변경하여 정렬을 미세 조정함으로써 라만 신호를 최적화하여 최종 조정을 수행하십시오.이제 시스템이 스펙트럼을 수집할 준비가 되었습니다. 우선 시스템 아티팩트를 보정하기 위해 여러 개의 배경 곡선을 획득해야 합니다. 먼저, 분석기를 0도로 설정하고 들뜸 빔(excitation beam)은 켜고 펌프 빔(pump beam)은 끕니다.게이트를 설정하지 않은 스펙트럼을 얻은 다음, 분석기(analyzer)를 90도로 설정하고 편광자를 통해 누설되는 미산란광을 나타내는 배경 스펙트럼을 수집합니다. 다음으로, 분석기를 90도로 유지한 상태에서 라만 빔을 끄고 펌프 빔을 켭니다. 다이크로익 필터를 통해 누설되는 펌프광의 양을 나타내는 두 번째 배경 스펙트럼을 수집합니다.마지막으로, 모든 레이저를 끈 상태에서 카메라와 전자 회로의 암전류 수준을 나타내는 기준 암스펙트럼(dark spectrum)을 수집합니다. 그 다음 모든 빔을 켜고 게이트 스펙트럼(gated spectrum)을 수집합니다. 게이트를 통과한 빛만의 실제 스펙트럼을 얻으려면, 이 게이트 스펙트럼에서 두 개의 배경 스펙트럼과 암스펙트럼을 차감해야 합니다.여기 주름 형성 시스템의 모식도가 나와 있습니다. 펌프 빔 경로는 빨간색 실선으로, SHG 경로는 남색 실선으로 표시되어 있습니다. 라만과 형광이 중첩되는 경로는 녹색으로 표시되어 있습니다.형광이 일시적으로 필터링된 경로는 노란색으로 표시됩니다. 여기에서는 침전액(immersion oil)에 용해된 coumarin의 원시 스펙트럼을 볼 수 있습니다. 빨간색 곡선은 게이트를 열어둔 상태에서 측정된 스펙트럼을 나타내며, 검은색 곡선은 분석기를 최소 투과율로 맞추고 펌프 빔을 조사하여 측정된 스펙트럼을 나타냅니다.파란색 곡선은 분석기가 최소 투과율로 정렬되고 펌프 빔이 인가되지 않은 상태에서 측정된 스펙트럼을 나타내며, 녹색 곡선은 펌프 빔만 인가된 상태에서 측정된 스펙트럼을 나타냅니다. 모든 스펙트럼은 11포인트 3차 KY gole 필터로 평활화되었습니다. 점선으로 표시된 마젠타색 선은 다음 그래프에 나타낸 스펙트럼 영역을 나타냅니다.여기 형광 배경 제거 후 침전유(immersion oil)에 용해된 쿠마린의 스펙트럼이 나타나 있습니다. 빨간색 곡선은 게이트를 열어둔 상태의 스펙트럼이며, 파란색 곡선은 게이트를 적용한 스펙트럼입니다. 게이트를 적용한 스펙트럼에서는 오일의 특징인 고파수 영역의 합성 피크가 명확하게 관찰됩니다.이 절차를 시도할 때, 레이저는 먼저 가스(ga)를 구동하기에 충분한 펄스 에너지를 가져야 하며, 시스템은 두 펄스의 정밀한 공간적 및 시간적 중첩이 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 첨부된 프로토콜을 읽은 후에는, 레이저 빔을 들뜸 빔(excitation beam)과 곡선 빔(curve beam)으로 분리하는 방법과 이 두 빔을 공간적 및 시간적으로 중첩시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.분광계와 C, c, D를 사용하여 라만 신호를 기록하는 방법과 라만 신호를 시각화 및 분석하는 방법을 알아봅니다. 레이저 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 레이저 고글 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 비선형 물질 사용 및 특정 시료 사용 시에는 추가적인 안전 규칙이 적용됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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공명과 자연 래맨 Microspectroscopy에 형광 배경 거부

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