공명과 자연 래맨 Microspectroscopy에 형광 배경 거부

이 절차의 목적은 형광 신호는 차단하고 라만 산란광만 통과시키는 전광학 게이트를 구축하는 것입니다. 이는 먼저 라만 산란을 여기시키고 편광시킴으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 게이트를 작동시키기 위해 펌프 빔을 준비하는 것입니다.

셋째, 펌프, 램 및 펄스가 서로 겹치도록 조정해야 합니다. 절차의 마지막 단계는 시간 게이트 스펙트럼을 획득하는 것입니다. 결과적으로, 높은 신호 대 잡음비를 갖는 라만 신호 분석을 통해 생화학적 정량화 및 분류 결과를 얻을 수 있습니다.

형광 배경을 소프트웨어로 제거하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 형광으로 인해 발생하는 샷 노이즈(shot noise)가 현저히 감소한다는 점입니다. 이 방법은 박테리아 세포 및 조직 내 내인성 형광체의 화학적 조성에 대한 비침습적 특성 분석, 고유 마커를 이용한 세포 프로세스 및 암, 혈관 질환 또는 신경퇴행성 질환과 같은 질병의 이해 등 생물학 및 의생명 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 형광 및 RAM 라벨로 모두 사용할 수 있는 새로운 프로브의 개발뿐만 아니라 혈액 분석을 위한 비침습적 의료 센서 개발에도 기여할 수 있습니다.

이 방법은 생명공학을 위한 생물학적 시스템에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 바이오 연료 연구나 통신 산업과 같은 다른 분야에도 적용될 수 있습니다. 생물학적 시료는 일반적으로 ATO Fluor 셀 챔버에 장착된 1번 두께의 커버 슬립 위에 배치합니다.

액체 샘플, 특히 인체에 독성이 있는 샘플은 소형 유리 병에 넣고 개구부를 실리콘 에폭시로 밀봉한 커버 슬립으로 덮은 뒤, 측정을 위해 이를 뒤집어 놓습니다. 샘플을 현미경 스테이지 상단에 장착된 보조 스테이지에 배치하는데, 이 스테이지는 시간 분해 라만 스펙트럼(time gated ramen spectra)을 얻기 위해 독립적인 초점 제어 기능을 갖추고 있습니다. 우선, 여기 빔(excitation beam)을 적절히 준비해야 합니다. 2.4 W 가변 파장 펄스 Ti:sapphire 레이저에서 나오는 빛으로 시작합니다. 80 MHz 펄스 열의 각 펄스는 30 nJ의 에너지와 140 fs의 시간 폭을 가져야 하며, 스펙트럼은 약 6 nm의 대역폭을 가지고 808 nm에 중심을 두어야 합니다. 후방 반사광이 레이저 공동으로 다시 들어가는 것을 방지하기 위해, 빛은 패러데이 격리기를 통과해야 합니다. 시스템으로 전달되는 총 전력을 연속적으로 조정할 수 있도록 패러데이 격리기 앞에 반파장판을 배치하십시오.

6 nm는 대부분의 라만 모드를 분해하기에는 대역폭이 너무 넓기 때문에, 빔을 매우 좁은 대역 통과 필터에 통과시킵니다. 808 nm로 설정하십시오. 다음으로, 아크로매틱 더블렛을 사용하여 빛을 5 mm 베타 바륨 보레이트(BBO) 결정에 집중시킵니다.

808 nm의 파장을 404 nm로 절반까지 줄이기 위해 8개의 결정을 사용합니다. 팁-틸트(tip and tilt) 제어 장치가 있는 마운트에 베타 바륨 보레이트(beta barium borate) 결정을 장착하여 이동 스테이지 위에 설치합니다. 파장 변환 효율을 극대화하려면 결정을 더블릿(doublet) 초점에 대해 정확히 대칭이 되도록 배치하고, 결정축을 입사빔의 편광 방향과 일치시켜야 합니다.

파장 변환 효율은 편광에 따라 달라지므로, 패러데이 아이솔레이터 뒤에 두 번째 반파장판을 배치하여 시료로 보내는 빛의 양을 조절할 수 있습니다. 이 파장판을 회전시키면 펌프 빔으로 보내는 강도와는 독립적으로 시료에 도달하는 빛의 강도를 조정할 수 있습니다. 이후 파장 변환된 빛은 두 번째 아크로매틱 더블릿을 통해 다시 콜리메이션되는데, 이때 아크로매틱 더블릿은 여기 빔이 현미경 대물렌즈의 후면 개구부를 충분히 채울 수 있는 크기가 되도록 선택하며, 두 개의 스티어링 미러를 통해 도립 현미경으로 유도됩니다.

현미경 대물렌즈는 광축을 정의하며, 이에 따라 여기 빔을 해당 축에 정렬합니다. 현미경의 시료 평면에 거울을 배치합니다. 그 후, 현미경의 이미징 포트에 부착된 CCD 카메라로 후방 반사된 레이저 빔을 관찰하면서 두 개의 조향 거울을 반복적으로 조정합니다.

카메라의 이미지가 현미경 시야의 중심에 있다고 가정하면, 빔은 광축 상에 있는 것입니다. 초점 스팟이 현미경 칩의 중심에 위치하고 대물렌즈를 Z축 방향으로 이동시켜도 변화가 없을 때입니다. 디포커스된 빔의 라만 산란 중심점은 시료가 시료 평면에 놓이고 레이저 광으로 조사될 때 발생합니다.

현미경 대물렌즈 아래에 배치된 이색성 필터(dichroic filter)는 파장이 이동된 라만 산란광을 여기 빔으로부터 분리하여 라만 산란광을 현미경의 측면 포트로 유도합니다. 현미경은 이 경로 내의 모든 렌즈를 제거하도록 수정되었으며, 이는 현미경에서 나오는 신호 빔이 글랜드(gland)의 유효 구경보다 크기 때문에 신호광이 현미경에서 그대로 나오게 하기 위함입니다.

빔의 크기를 줄이기 위해 두 개의 방향족 더블렛(aromatic doublets)으로 구성된 0.47배 망원경인 Thompson 편광자를 사용합니다. 그 후 신호광은 실험실 좌표계의 수직 방향을 기준으로 0도로 정렬된 글랜드 Thompson 편광자(gland Thompson polarizer)에 의해 편광되며, 다이크로익 거울(dichroic mirror)로 유도되어 펌프 빔과 재결합됩니다. 펌프 빔은 서로 직각으로 배치된 두 개의 거울로 구성된 지연선(delay line)으로 보내지며, 두 거울은 펌프 펄스와 신호 펄스의 시간적 중첩을 보장하도록 조정 가능한 선형 이동 스테이지(linear translation stage) 위에 배치됩니다.

지연선(delay line)을 거친 빔은 실험실 좌표계의 수직 방향을 기준으로 45도 각도로 배치된 반파장판(half-way plate)과 편광자를 통과합니다. 이는 펌프 빔이 비선형 매질에 도달했을 때 적절한 편광 상태를 유지하도록 하기 위함입니다. 그 후 빛은 두 개의 스티어링 미러에 의해 반사되는데, 그 중 압전 제어 장치가 부착된 미러를 사용하여 펌프 빔의 위치를 최종 조정함으로써 신호 빔과 공간적으로 중첩되도록 합니다.

이러한 중첩을 얻으려면, 펌프 빔과 신호 빔을 다이크로익 거울(dichroic mirror)에서 가깝고 먼 두 지점에서 관찰하십시오. 첫 번째 스티어링 거울을 사용하여 가까운 지점에서 두 빔을 중첩시키고, 피조 거울(pizo mirror)을 사용하여 먼 지점에서 빔을 중첩시킴으로써 펌프 빔을 신호 빔과 정확히 일직선이 되게 할 수 있습니다. 다음으로, 수집된 시간 게이트 신호를 최대화하도록 코러게이트 및 수집 시스템을 설정해야 합니다. 이를 위해, 펌프 빔과 신호 빔을 먼저 404 nanometers에서 OD 6인 다이크로익 필터에 통과시켜 잔류 여기광이 비선형 매질 내에서 여기 및 산란되는 것을 방지합니다.

그 후 펌프 빔과 신호 빔은 아크로매틱 더블렛(achromatic doublet)에 의해 비선형 물질이 포함된 경로 길이 1 cm의 석영 큐벳으로 집속되며, 적절하게 높은 비선형 굴절률과 충분히 짧은 시간 응답성을 가진 비선형 물질이라면 무엇이든 사용할 수 있습니다. 본 실험에서는 이황화탄소(carbon disulfide)를 사용합니다. 이후 빛은 첫 번째 더블렛과 초점 거리가 동일한 두 번째 더블렛에 의해 다시 콜리메이션(re-collimated)됩니다.

그 다음 빔들을 회전 마운트에 설치된 Glan-Thompson 분석기에 통과시킨 후, 808 nanometers에서 합계 OD가 10인 일련의 흡수 및 간섭 필터에 통과시킵니다. 마지막으로, 신호광을 apochromatic doublet 렌즈로 집속시켜 50 micron 멀티모드 광섬유에 입사시키며, 이때 광섬유는 X, Y, Z축 이동이 가능한 스테이지에 장착됩니다. 그 후 광섬유를 CCD 카메라가 부착된 상용 이미징 분광계에 연결하여 수집 시스템을 정렬함으로써 수집되는 신호를 최대화하고, 분석기를 0도로 설정하며, 샘플 평면에 toluene 테스트 샘플을 배치합니다. 광섬유 마운트의 X, Y, Z 제어 장치를 조정하여 펌프 빔과 신호 빔의 공간적 및 시간적 중첩이 적절히 이루어지도록 하여 수집된 Raman 신호를 최적화합니다. 현미경의 샘플 평면에 거울을 배치합니다.

그 다음 시스템에서 404 nanometer 필터를 제거합니다. 분석기를 90도로 회전시켜 역반사된 404 nanometer 빔이 분광계로 전달되도록 하고, 카메라가 포화되지 않도록 강도를 조절합니다. 이제 펌프 빔을 끈 상태에서 분석기를 회전시켜 투과되는 404 nanometer 신호를 최소화합니다.

그런 다음 펌프 빔을 다시 켜고 404 nanometer 빛의 투과율이 증가하기 시작할 때까지 지연 스테이지를 천천히 조정하십시오. 다음으로, 역반사된 404 nanometer 빔과 라만 산란광이 시스템 내에서 약간 다른 경로를 거칠 수 있으므로, 신호를 최대화하기 위해 지연 스테이지, 압전 거울 및 파이버의 X, Y, Z 컨트롤을 반복적으로 조정하십시오. 톨루엔과 같은 강한 라만 산란체를 샘플 스테이지에 배치하고, 라만 필터를 교체한 뒤, 지연 스테이지, 압전 거울 및 파이버의 X, Y, Z 컨트롤을 변경하여 정렬을 미세 조정함으로써 라만 신호를 최적화하여 최종 조정을 수행하십시오.

이제 시스템이 스펙트럼을 수집할 준비가 되었습니다. 우선 시스템 아티팩트를 보정하기 위해 여러 개의 배경 곡선을 획득해야 합니다. 먼저, 분석기를 0도로 설정하고 들뜸 빔(excitation beam)은 켜고 펌프 빔(pump beam)은 끕니다.

게이트를 설정하지 않은 스펙트럼을 얻은 다음, 분석기(analyzer)를 90도로 설정하고 편광자를 통해 누설되는 미산란광을 나타내는 배경 스펙트럼을 수집합니다. 다음으로, 분석기를 90도로 유지한 상태에서 라만 빔을 끄고 펌프 빔을 켭니다. 다이크로익 필터를 통해 누설되는 펌프광의 양을 나타내는 두 번째 배경 스펙트럼을 수집합니다.

마지막으로, 모든 레이저를 끈 상태에서 카메라와 전자 회로의 암전류 수준을 나타내는 기준 암스펙트럼(dark spectrum)을 수집합니다. 그 다음 모든 빔을 켜고 게이트 스펙트럼(gated spectrum)을 수집합니다. 게이트를 통과한 빛만의 실제 스펙트럼을 얻으려면, 이 게이트 스펙트럼에서 두 개의 배경 스펙트럼과 암스펙트럼을 차감해야 합니다.

여기 주름 형성 시스템의 모식도가 나와 있습니다. 펌프 빔 경로는 빨간색 실선으로, SHG 경로는 남색 실선으로 표시되어 있습니다. 라만과 형광이 중첩되는 경로는 녹색으로 표시되어 있습니다.

형광이 일시적으로 필터링된 경로는 노란색으로 표시됩니다. 여기에서는 침전액(immersion oil)에 용해된 coumarin의 원시 스펙트럼을 볼 수 있습니다. 빨간색 곡선은 게이트를 열어둔 상태에서 측정된 스펙트럼을 나타내며, 검은색 곡선은 분석기를 최소 투과율로 맞추고 펌프 빔을 조사하여 측정된 스펙트럼을 나타냅니다.

파란색 곡선은 분석기가 최소 투과율로 정렬되고 펌프 빔이 인가되지 않은 상태에서 측정된 스펙트럼을 나타내며, 녹색 곡선은 펌프 빔만 인가된 상태에서 측정된 스펙트럼을 나타냅니다. 모든 스펙트럼은 11포인트 3차 KY gole 필터로 평활화되었습니다. 점선으로 표시된 마젠타색 선은 다음 그래프에 나타낸 스펙트럼 영역을 나타냅니다.

여기 형광 배경 제거 후 침전유(immersion oil)에 용해된 쿠마린의 스펙트럼이 나타나 있습니다. 빨간색 곡선은 게이트를 열어둔 상태의 스펙트럼이며, 파란색 곡선은 게이트를 적용한 스펙트럼입니다. 게이트를 적용한 스펙트럼에서는 오일의 특징인 고파수 영역의 합성 피크가 명확하게 관찰됩니다.

이 절차를 시도할 때, 레이저는 먼저 가스(ga)를 구동하기에 충분한 펄스 에너지를 가져야 하며, 시스템은 두 펄스의 정밀한 공간적 및 시간적 중첩이 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 첨부된 프로토콜을 읽은 후에는, 레이저 빔을 들뜸 빔(excitation beam)과 곡선 빔(curve beam)으로 분리하는 방법과 이 두 빔을 공간적 및 시간적으로 중첩시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

분광계와 C, c, D를 사용하여 라만 신호를 기록하는 방법과 라만 신호를 시각화 및 분석하는 방법을 알아봅니다. 레이저 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 레이저 고글 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 비선형 물질 사용 및 특정 시료 사용 시에는 추가적인 안전 규칙이 적용됩니다.