Name: 굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 학습하세요 경쟁적 호박 분석법을 이용하여 장 특이적 T 세포와 대조군 T 세포의 조직별 이동 능력을 비교하는 방법을 배우세요. 이 기술은 면역학 연구에서 세포 이동 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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EJV는 미국의 Crohn S &amp; 대장염 재단 (CCFA)의 화목에 의해 지원됩니다. JRM은 CCFA, 암 연구소 (크리), 하워드 H. 굿맨 (MGH), 매사 추세츠 생명 과학 센터 (MLSC)와 NIH 원장의 새로운 이노 수상의 기금에 의해 지원됩니다.

인내심을 추적 및 제어 T 세포 1. 전의 생체내 생성 (그림 1 참조) <ol><li> 야생 타입 마우스로부터 비장을 mashing하여 splenocytes를 분리. 5 '400 X G.에 대한 세포의 PBS의 서스펜션과 원심 분리기를 Resuspend 뜨는을 제거 후 2-3 분 동안 ACK 용해 완충액 4 ML에있는 세포 펠렛을 resuspending하여 적혈구를 lyse. 그 후, PBS 5 ML를 추가합니다. 5 '400 XG에 대한 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 1 총 splenocytes을 Resuspend X 10 6 IMDM의 / ML + 10% FBS + 50 MM 2 - 메르 캅 토 에탄올 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (완료 IMDM). 100-200 NM 3 최종 농도 RA (또는 Am80 또는 Am580 같은 합성 RAR - agonists)와 보충 하나 중 두 그룹에서 세포를 분리. RA 또는 RAR - agonists의 면전에서 활성화된 T 세포가 a4b7and CCR9을 upregulate하고 RA 않고 활성화된 T 세포가 조절 T 세포가 될 반면, 인내심을 트로픽 T 세포가 될 것입니다. </li><li> 이전에 반대 인 경우에는 3 번 CD (10 MG / ML) 및 안티 CD28 (10 MG / ML)로 코팅 24 잘 접시의 각각 잘 수있는 세포 현탁액의 1.5-2.0 ML을 추가하고 37 품어 ° C를 5 % CO에 2 (코팅 접시 500 ML / 음의 안티 인 경우에는 3 번 CD 플러스 37에서 2 시간 동안 PBS과 부화에 안티 CD28을 추가 ˚ C 후 2 ML PBS로 두 번 세척). </li><li> T 세포 overstimulation을 방지하기 위해, 2-3 일 후에 새로운 uncoated 24 잘 접시에 세포 suspensions를 전송할 수 있습니다. 추가 2-3 일동안은 알을 품다. 세포 밀도와 확산에 따라 미디어는 신선한 완료 IMDM으로 미디어의 절반을 교체해야 할 수도있는 경우에 산성 (노란색)이 될 수도 있습니다. 4~5일 (일 0부터 계산) 후 세포를 수확. </li><li> 일반적인 최종 수확량은 X 10 6 효과기 T 세포 / 잘 1-2아르. 따라서, 각각의 인내심을 트로픽 T 세포 및 제어 T 세포의 9-12 웰스의 최소 조건 10-20 X 10 6 T 세포와 최종하기 위해 도금한다. </li></ol> 2. 활성화된 T 세포에 대한 인내심을 유도 수용체 분석 문화 4~5일 후 우리는 통제 T 세포가 이러한 수용체 4 매우 낮은 수준을 표현한다 반면, RA 또는 RAR agonists의 면전에서 활성화된 T 세포에 대한 인내심을 유도 수용체 a4b7and CCR9 높은 표현을 준수해야합니다. 유동세포계측법 (외과) 분석. <ol><li> 4 300g에서 5 분 0.2-0.5 X10 6 셀 및 원심 분리기 사이의 수집 ° C. </li><li> 4 15 분 ° 어둠 속에 C에 대한 안티 - CD4 - FITC, 안티 - a4b7 - PE (BD Biosciences), 안티 - CCR9 - APC (eBiosciences) 및 안티 - CD8 - PercP와 부화. </li><li> 부화 후, g 4 ° C. 300에서 5 분 원심 분리기 세척 및 resuspend 세포를 버퍼를 얼룩과 외과에 의해 분석할 수 있습니다. </li></ol> 3. CFSE 및 CMTMR 세포 추적기와 T 세포 라벨 <ol><li> 37 모든 솔루션을 보관 ° C를 시작하기 전에. 와시 직감을 트로픽 T 세포 (a4b7 높은 CCR9 하이) 및 제어 T 세포는 (a4b7 낮은 / Neg CCR9 낮은 / Neg) 두 번 PBS로 혈청을 제거합니다. 10-15 × 10 6 / PBS에 ML하는 T 세포의 농도를 조정합니다. </li><li> 에서 부드럽게 와동 20 분 품어 각각 5 밀리미터 및 10 mm의 최종 농도 인내심 트로픽 T 및 제어 T 세포 중 하나에 CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르) 또는 CMTMR (chloromethyl - 벤조일 - 아미노 tetramethylrhodamine) fluorophores 추가 37 ° C. 이것은 T 세포 이주에 fluorophores의 잠재적인 본질적인 영향을 제외하기 위해 동일 또는 별도의 실험에서 labelings를 교환하는 것이 좋습니다. </li><li> 부화 후, 상온에서 1-5 분 FBS와 부화 1 볼륨 끄다. 따뜻한 PBS로 10 배 희석 300 G.에서 5 분 원심 분리기 전체 IMDM의 PBS와 resuspend로 두 번 씻으십시오. </li><li> 이상적으로, 각 T 인구의 10-20 X 10 6 세포는 1:1 비율로 혼합 후 5 분 300 XG에 centrifuged해야합니다. 마지막으로, 따뜻한 PBS의 200-250 ML에있는 세포를 resuspend와 꼬리 정맥을 통해 주입. </li><li> 정확한 입력 비율 (1 이상을 닫습니다)를 계산하기 위해서는 주입 세포 현탁액의 50-10 ML을 저장하고 희석 PBS 300 ML과 외과하여 분석할 수 있습니다. </li></ol> 4. 유도 T 세포 분석 마우스가 다양한 시간 포인트 (1 H와 며칠 게시물 T 세포 주입 사이)에서 분석할 수 있지만, 인내심을 트로픽 T 세포의 유도는 최고의 12-24 H 포스트 분사 사이에 문서화되어있다. 긴 시간 포인트는 T 세포 apoptosis와 조직에서 T 세포 출구로 최종 휴대 전화 번호 / 비율을 영향을 미치는 다른 변수의 잠재 효과를 향상시킬 수 있습니다. 생쥐가 여러 조직에서 euthanized, 휴대 suspensions는 세포 죽음을 감소하기 위해 지체없이 격리되어야 후, 이것은 최종 산출 및 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 관심 조직은 소장, 대장, 비장, 림프절, Peyer의 패치, 간, 폐, 혈액 있습니다. 면주입 T 세포가 타고난 인내심 트로픽 T 세포 있으며, 그들은 T 세포를 제어에 비해 작은 창자의 점막에 평균 5-10 배 더 나은 (또는 이상)에서 가정해야합니다. 그러나, 혈액 및 비장 등의 조직은, 우선 T 세포의 마이 그 레이션을 전시 안됩니다. 창자 라미나의 propria 및 intraepithelial 구획에서 lymphocytes의 분리는 이전에 다음 ID로 5 설명했습니다. <ol><li> 외과의 얼룩 : 샘플 3.0 X 10 6 세포 / ML 이상의 밀도에서 수집된 세포의 숫자에 따라 resuspended 있습니다. 경우 congenic CD45.1 + 또는 Thy1.1 + 마우스가받는 사람으로 사용되었다, 세포 일부 혈통 표시 (예, TCRbchain, CD4, CD8와 함께 해당 congenic 마커 (예 : CD45.2 또는 Thy1.2)에 묻은 게있다 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> 외과 분석하는 동안, 세포는 congenic 마커 (예 : CD45.1)에 다음 특정 혈통 표시 (예 : CD4/CD8)에 문이 및 CMTMR 및 CFSE 긍정적인 세포 사이의 비율에 대한 분석입니다. </li><li> 데이터는 일반적으로 해당 입력 비율 (아래 참조)으로 나눈 각 조직의 비율 CFSE / CMTMR (또는 CMTMR / CFSE)로 계산됩니다 호밍 지수 (HI)으로 표시됩니다. 입력 비율이 1 아주 가까이있다면, 조직 비율은 HI에 상응하는 것입니다. </li></ol> HI = CFSE 조직 / CMTMR 조직 : CFSE 입력 / CMTMR 입력 혈액은 또한 모두 T 세포 인구가 균일하게 순환으로 표시됩니다 또는 한 T 세포 인구가 다른 경의를 (예, 폐 / 간에 우선 트래핑하거나 감소 생존 능력에 의해) 감소하는 경우 여부를 확인하기 위해 분석해야합니다. 후자가 폐에 더 큰 정도 갇혀있을 때문에, 순진하거나 쉬고​​있는 메모리 T 세포 대 최근 활성화 효과기 T 세포를 비교하면 이러한 문제가 발생할 수 있습니다. 혈액의 HI는 1보다 크게 다른 경우, 하나는 혈액에서 HI에 의해 조직에서 인사 정상화 수 있습니다. 혈액은 anesthetized 생쥐에서 심장 펑크 (avertin 또는 isofluorane 사전 안락사)를 통해 얻을 수 있으며, 외과의 얼룩을 위해 사용하기 전에 ACK 버퍼 번 lysed해야합니다. 혈액 정규화는 = HI 조직 / HI 블러드 5. 대표 결과 받는 마우스 (Thy1.1 +)는 euthanized18h 게시물 세포 주입했다. 셀 suspensions은 비장, 주변 림프절 (PLN), mesenteric 림프절 (MLN)과 소장의 라미나의 가끔하는 (LP)에서 생성되었습니다. 세포는 Thy1.2와 CD8을위한 스테인드 그리고 마지막 CMTMR + 세포 (인내심을 트로픽 T 세포)와 CFSE 사이의 비율에 대한 분석했다 가능한 Thy1.2 + CD8 + 세포에 게이팅로 외과에 의해 분석되었다 그 후 + 입력 비율로 나눈 전지 (제어 T 세포). 결과는 같은가 인내심을 트로픽 및 제어 T 세포가 균일하게 비장 (HI 빨간색 라인 표시, to1를 닫습니다)로 이동된 것을 감상할 수있는 그림 2와 같이 표시할 수 있습니다. T 세포를 제어에 비해 대조적으로, 인내심을 트로픽 T 세포는 LP에보다 효율적으로 10 번 주위를 마이 그 레이션. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> Figure1 :. 창자 - 트로픽 및 비 직감 트로픽 T 세포의 생성 및 라벨을 보여주는 T 세포가 다이어그램은 야생 타입 마우스으로부터 격리 및 anti-CD3/anti-CD28과 100-200 nm의 존재 또는 부재 모두 활성화됩니다 - 트랜스 retinoic 산 (RA). 4~5일 후 RA - 취급 T 세포 수용체 용기를 유도 CCR9 및 a4b7의 표현을 획득. 그렇다면, 인내심을 트로픽 및 제어 T 세포는 differentially 1:1 비율로 혼합하여 꼬리 정맥을 통해받는 마우스에 주입, 씻어, CFSE 또는 CMTMR으로 표시됩니다. 일부 레이블이 세포는 CFSE / CMTMR 입력 비율 (종료 1한다)를 결정하는 데 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> Figure2 :. 돌입 분석의 예 마우스가 12-18 H 게시 T 세포 주입 및 단일 세포 suspensions가 관심의 기관에서 얻을 수있다 분석했다. 세포는 다음 방지 Thy1.2 (congenic 마커) 플러스 안티 - CD8 및 Thy1.2 물들일 아르 + CD8 + T 세포가 CMTMR의 비율에 대한 분석 아르 +와 CFSE + 외과 각 조직의 세포. 조직 CMTMR / CFSE 비율은 다음 위치 추적 색인 (HI)을 구하는 입력 CMTMR / CFSE 비율로 정상화됩니다. 이 예제 CMTMR의 +와 CFSE에 + 세포는 각각 직감 - 트로픽 및 제어 효과기 T 세포입니다.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

유도 실험 특정 조직에서 전체 세포 인구의 마이 그 레이션하는 것에 대한 매우 귀중한 정보를 제공하더라도, 그것은 이러한 assays 직접 내피 접착력을 분석하지 않으며 따라서 차별하지 않는 마음에 보관되어야하는 다단계 부착의 어느 단계 (S)에 캐스케이드 (tethering / 인증 또는 고집 롤링) 지정된 추적 수용체는 행동이다. 유착 층계에 들어가고 수용체의 특정 역할을 정의하는 황금 표준은 개별 찬란 표시된 T 세포 (또는 다른 셀 또는 찬란 표시 구슬) 직접 실시간으로 내피 세포와 상호 작용 관찰하는 intravital 현미경 (IVM)입니다. 그러나, IVM은 시간이 소요됩니다 마우스 마취가 필요합니다, 힘드는 수술 절차를 의미하고 라벨 및 사출에 대한 순수하고 균질 세포 인구의 다수의 사전 고립이 필요합니다. 또한, 같은 중추 신경계 (CNS)와 thymus 같은 일부 조직은 IVM에 대한 액세스하기 어렵습니다. 마지막으로, IVM 준비는 간, 폐, 대장 같은 일부 기관 / 조직 (IVM에 대한 자세한 논의에 대한...

동물 : C57BL / 6 마우스는 일반적으로 T 세포 절연을 위해 사용됩니다. 또한, CD45.1 및 Thy1.1 congenic 계통 잭슨 연구소 (바 하버, ME)를 통해 사용할 수 있습니다. 문화 미디어 : IMDM (Iscove의 수정 Dulbecco의 중간 + L - 글루타민 + Hepes) 플러스 10% 열 inactivated 100 U / ML 페니실린과 보충 FBS (태아 소 혈청, 낮은 내독소, Gibco ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA), 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (항생제의 HyClone, 월섬, MA), 0.5은 MG / ML fungizone / amphotericin B (Gibco), 50 MM B - 메르 캅 토 에탄올. ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 (RBC, 10 MM KHCO 3, 150 MM NH 4 Club 호텔, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)) 산도 7.2-7.4와 실온에서 저장을 조절할 수 있습니다. PBS (인산이 살린, Hyclone, 월섬, MA를 버퍼). 유동세포계측법 (외과) 미디어 (PBS 또는 IMDM + 2퍼센트 FBS + 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 이 MM CA와 Selectin - FC chimeras, 미디어를 사용하면 얼룩 + + 모든 단계 (외과 인수 포함)에 사용해야합니다. IMDM이 경우에 권장합니다. T 세포 라벨링 및 입양 전송 : CFSE (carboxyfluorescein 디아 세 테이트, succinimidyl 에스테르), CMTMR - 분자 프로브에서 ((5 (그리고 - 6 )-((( 4 - chloromethyl) 벤조일) 아미노) tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, 칼스 배드, CA ). 1000 X 주식은 DMSO로 작성 (5 MM의 CFSE, 20 MM CMTMR)와 -20 ° C.에 보관해야 Polyclonal T 세포 활성화 : 24 - 글쎄 또는 96 - 웰 플레이트는 (조직 문화 처리, 뚜껑이있는 평면 바닥 폴리스티렌, BD 팔콘, 프랭클린 레이크스, NJ)는 ° C와 50 ML PBS, 각각 37에서 2 시간 동안 incubated 아르 , 안티 인 경우에는 3 번 CD 플러스 안티 CD28 항체 (10 MG / ML 각)이있는. 그런 다음, 문화 플레이트는 PBS로 두 번 씻어하고 T 세포 문화의 즉시 사용됩니다. 또는 anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, 칼스 배드, CA)로 코팅 Dynabeads 대신 판 - 바운드 항체의 T 세포 활성화에 사용할 수 있습니다. 유동세포계측법 (외과) 얼룩 : Polyclonal 인증 : 인 경우에는 3 번 CD (1452C11), CD28 (37.51). 리니지 mAb : CD4 (L3T4), CD8a (LY - 2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). 인내심을 유도 수용체 : 정화 CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, 샌디에고, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype 제어 (IgG2a, K). 피부 유도 수용체 : P - selectin - FC (정화 마우스 P - Selectin - IgG의 융합 단백질, BD Pharmingen, 산호세, CA), E - selectin - FC (재조합 마우스 E-Selectin/Fc 치메라, ​​R &amp; D 시스템, 미네 아 폴리스, MN) 플러스 해당 보조 시약의 염소 F (AB &#39;) 2 안티 인간 IgG R - PE (Invitrogen, 칼스 배드, CA). 모든 트랜스 retinoic 산이 (시그마, 세인트 루이스, MO) 준비 중에 노란색 전구 또는 조명의 간접 소스를 사용하여 절대 에탄올 또는 DMSO에 resuspended 있습니다. -80에서 유리 튜브 안에 저장 aliquots ° C와 항상 빛으로부터 보호. 합성 RAR - agonists : Am80 (와코 화학 물질, 리치몬드, VA).

굿 - 트로픽 t 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 assays

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

발휘하기 위해서는 자신의 기능 lymphocytes은 혈액을두고 신체의 다른 조직으로 마이 그 레이션해야합니다. 내피 세포 및 조직 넘쳐 흐름에 림프구 접착력이 lymphocytes과 내피 세포 1 2에 표시된 각각의 리간드 (addressins)에 표시 다른 접착 분자에 의해 통제 다단계 프로세스 (유도 수용체)입니다. 이러한 유착 수용체의 기능이 부분적으로 공부를 할 수 있지만 전 생체내 자신의 생리 관련에 대한 궁극적인 시험은 생체내 림프구 접착 및 마이 그 레이션에 동안 자신의 역할을 평가하는 것입니다. intravital 현미경 (IVM)과 유도 실험 : 두 개의 상호 보완적인 전략이 목적을 위해 사용되었습니다. IVM은 실시간으로 가능하고 다른 조직에 유착 폭포 중 특정 유착 수용체의 정확한 기여를 정의하는 필수되어 있지만, IVM은 집중 시간이 소요과 노동, 그것은 종종 정교한 수술 기법의 개발이 필요, 그것은 단일의 사전 격리 필요 세포 인구와 어떤 주어진 시간에 하나의 조직 / 기관의 분석을 수 있습니다. 반대로, 경쟁 유도 실험 같은 마우스의 두 마이 그 레이션 (혹은 이상) 셀 집합에 직접적이고 동시 비교를 허용하지 않으며 그들은 또한 많은 조직과 같은 실험에서 세포의 높은 숫자의 분석을 허용합니다. 여기서 우리는 제어 셀 인구에 비해 같은 특정 조직에 집으로 주어진 세포 유형의 장점 / 단점을 확인하는 데 사용되는 전통적인 경쟁 유도 프로토콜을 설명합니다. 창자 점막이 외부 환경과의 접촉에서 가장 큰 몸 표면이기 때문에 우리는 인내심을 트로픽 대 인내심 트로픽 비 T 세포의 철새 속성을 설명하기 위해 선택하고 또한 최고의 정의 철새 요구 사항을 추가 - 림프 조직이다 . 또한, 최근의 작품은 비타민이 신진 대사 모든 트랜스 retinoic 산 (RA)는 lymphocytes에 창자가 특정 유착 수용체 (인테 a4b7and의 케모카인 수용체 CCR9)를 유도에 대한 책임의 기본 분자 메커니즘 것을 확인했습니다. 따라서, 우리는 쉽게 드디어 여기에서 설명한 경쟁 유도 실험에서 사용할 수있는 각각 RA의 존재 또는 부재의 T 세포를 활성화하여 인내심을 트로픽 및 lymphocytes 인내심 트로픽 비 예 생체내 다수를 생성할 수 있습니다.

경쟁 유도 실험 직접 하나의 마우스로 두 개의 서로 다른 세포 인구의 철새 속성을 평가하실 수 있습니다. 여기 우리는 전 생체내 생성 인내심 트로픽 대 비 직감 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 비교하여이 절차를 설명합니다.

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

림프구는 기능을 수행하기 위해 혈액을 떠나 신체 내의 다양한 조직으로 이동해야 합니다. 혈관 내피세포에 대한 림프구의 부착은...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 동일한 마우스 수용체 내에서 두 가지 이상의 세포 하위 집단이 가진 조직 특이적 이동 능력을 비교하여, 한 번의 실험으로 여러 조직과 세포를 분석하는 것입니다. 본 과정에서는 야생형 수용체 마우스에서 인비트로(in vitro)로 생성된 장 친화적(gut tropic) T 세포와 대조군 T 세포의 이동 능력을 비교하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 예를 들어, 장 친화적 T 세포가 장 간막 림프절, 말초 림프절 및 비장으로 이동하는 능력을 결정하는 데 사용될 수 있습니다.대조군 T 세포와 비교하기 위해, 먼저 장으로 향하는 gut tropic T 세포와 대조군 effector T 세포를 in vitro에서 생성해야 합니다. 다음으로, 실험군 및 대조군 T 세포를 서로 다른 염색약으로 표지하고 1:1 비율로 혼합합니다. 그런 다음, 투입 비율 확인을 위해 사용되는 소량의 aliquot을 제외한 세포 혼합물을 수 recipient 마우스에 주입합니다.마지막으로, 입양 전이 18시간 후에 마우스를 희생시키고, 관심 장기를 회수하여 유세포 분석법으로 장 친화성 T 세포 및 대조군 T 세포의 존재 여부를 분석합니다. 단일 세포 집단을 입양 전이하는 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 하위 유형의 조합을 동일한 수혜 마우스에 주입함으로써 정맥 주사나 서로 다른 수혜 마우스 사용으로 인해 발생하는 가변성을 크게 줄일 수 있다는 점입니다. 이 기술의 응용 범위는 염증성 장질환과 같이 대량의 백혈구 침윤과 관련된 질환의 치료까지 확장될 수 있습니다.예를 들어, 이 방법은 정상 상태 및 lymphocyte가 장으로 이동하는 과정에서 얼마나 많은 분자가 필요한지 결정할 수 있게 해줍니다. 또한, 이 절차를 통해 백혈구 이동을 차단하도록 설계된 약물의 효능을 평가할 수 있습니다. 10 mg/mL의 anti CD3 및 anti CD28 항체가 포함된 PBS 500 µL를 24-well plate의 각 well에 코팅합니다. well이 코팅되는 동안 plate를 37 °C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양합니다.야생형 마우스를 희생시키고 비장을 적출하여 배지가 들어 있는 50 milliliter 튜브에 넣습니다. 비장을 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 놓고 페트리 접시 위에서 으깨어 PLE 세포를 분리합니다. 세포를 PBS에 재현탁하고, 세포 현탁액을 새로운 50 milliliter 원심분리 튜브에 옮겨 5분 동안 원심분리합니다.상온에서 400 Gs로 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 4 mL의 용혈 버퍼에 2~3분 동안 현탁하여 적혈구를 용해합니다. 5 mL의 PBS를 넣어 용혈을 중단시킨 후, 세포 현탁액을 상온에서 400 Gs로 5분 동안 다시 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 결과물인 펠렛을 1 × 10⁶ cells/mL 농도로 완전 배지에 현탁하여 얼음에 보관합니다.Coves modified delcos 배지 또는 IMDM으로 동일하게 분할하여 결과물인 세포 현탁액을 두 개의 별도 튜브에 나누어 담고, 그중 한 튜브에 all trans retinoic acid 또는 RA를 최종 농도 100 to 200 nanomolar cubed가 되도록 첨가합니다. all trans retinoic acid의 분해를 막기 위해 해당 튜브를 직사광선으로부터 보호하십시오. 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 꺼내 각 웰을 2 mL의 PBS로 두 번 세척합니다.RA가 보충된 세포 현탁액 1.5에서 2 mL를 24웰 플레이트의 절반에 분주합니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 나머지 절반의 각 웰에 동일한 양의 대조군 세포를 넣고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 2~3일 후, 세포 현탁액을 코팅되지 않은 새로운 24웰 플레이트로 옮깁니다.T 세포의 과도한 자극을 피하기 위해, 세포를 2~3일 더 배양합니다. 세포 밀도 또는 증식으로 인해 배지가 노란색으로 변하면, 각 웰에 신선한 IMDM 500 µL를 추가하여 웰당 최종 부피를 1 mL로 맞춥니다. 세포를 회수하려면, 세포를 분주한 날을 0일로 하여 4일 또는 5일째에 상층액을 수집합니다.전형적인 최종 수득량은 웰당 1~2 × 10⁶개의 이펙터 T 세포입니다. 따라서 그룹당 10~20 × 10⁶개의 T 세포를 생성하려면 장(gut) 친화성 T 세포와 대조군 T 세포를 각각 최소 9~12개의 웰에 분주해야 합니다. ra에서 α4, β7 및 CCR9 발현 수준을 확인하려면활성화 및 대조군 T 세포를 0.2~0.5 x 10⁶개씩 4 mL 팩스 튜브(fax tube)에 수집한 후, 4 °C에서 300 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 100 µL의 염색 버퍼에 재현탁한 뒤, anti CD4 FITC, anti α4β7 PE, anti CCR9 APC 및 anti CD8 PerCP와 함께 4 °C의 암소에서 15분 동안 배양합니다.배양 후, 4°C에서 300 ×g로 5분 동안 PBS로 세포를 세척하고, 상층액을 제거한 뒤 염색 버퍼에 세포를 다시 부유시켜 유세포 분석기로 분석합니다. 이 단계의 시작 단계에서, 이후 염색 프로토콜에 사용할 IMDM 한 병과 PBS 한 병을 37°C에서 미리 데워둡니다.이전 단계에서 설명한 대로 유세포 분석법을 통해 두 세포 배양물의 T세포 호밍 표현형을 확인한 후, 갓 수확한 $\alpha_4\beta_7^{high}$ CCR9$^{high}$ 장 친화성(gut tropic) T세포 집단과 $\alpha_4\beta_7^{low/neg}$ CCR9$^{low/neg}$ 대조군 T세포 집단을 상온에서 300 x g로 5분간 원심 분리합니다. 다음으로, PBS로 세포를 두 번 더 세척하여 혈청을 제거한 후, 각 그룹의 T세포 농도를 $10$~$15 \times 10^6$ cells/mL로 조정합니다. PBS에 CFSE 또는 CMTMR 염색약을 첨가하여 장 친화성 T세포 또는 대조군 T세포를 염색합니다.여기서는 대조군 세포군에 CFSE를 추가하고 장 조직에 C-M-T-M-R을 추가합니다. 각각 최종 농도가 5 mM 및 10 mM이 되도록 Tropic T 세포에 첨가한 후, 세포를 5초 동안 부드럽게 볼텍싱하고 37 °C 항온수조에서 20분 동안 튜브를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 5 mL의 PBS를 추가하여 염색을 중단시키고 실온에서 1~5분 동안 배양합니다.따뜻한 PBS로 10배 희석하고 실온에서 300 Gs로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 PBS로 2회 더 세척한 후, 세포를 완전 IMDM에 재현탁합니다. 이상적으로는 각 T-세포 집단에서 6개 세포의 10분의 1에서 20분의 1 정도를 4 mL 팍스 튜브(fax tube)에 1:1 비율로 혼합해야 합니다.정확한 투입 비율을 계산하기 위해, 'input'이라 불리는 튜브 주입 세포 현탁액 5~10 µL를 따로 보관하고 4 °C에서 유지합니다. 주입할 세포 혼합물을 실온에서 300 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 주입할 세포를 250~300 µL의 가온된 PBS에 다시 현탁하고, 28 gauge 바늘이 장착된 1 CC 인슐린 주사기에 주입용 세포를 채웁니다.세포 혼합물 250 µL를 꼬리 정맥을 통해 주입하십시오. 마지막으로, 유세포 분석법으로 입력 세포를 분석하여 이전에 주입된 CFSE 및 C-M-T-M-R 양성 세포의 백분율을 구하십시오. 이 값이 사용될 입력 비율이 됩니다.호밍 지수의 최종 계산 단계입니다. T세포 호밍 분석을 위해 조직에서 분리한 세포 샘플을 mL당 3 × 10⁶ 개 이하의 밀도로 부유시킵니다. 본 영상에서는 동계생식(congenic) 마우스를 수용체로 사용하였으므로, 유세포 분석 시 적절한 동계생식 마커와 계통 마커를 함께 사용하여 CD45.1 양성 세포를 염색했습니다. 선택한 동계생식 마커로 세포를 게이팅한 후, 특정 계통 마커인 CD8로 다시 게이팅하여 CMTMR 양성 세포와 CFSE 양성 세포 간의 비율을 분석합니다.그다음 데이터를 호밍 지수(homing index) 또는 hi로 표시하며, 이는 각 조직 내 두 가지 서로 다른 염료의 비율을 해당 입력 비율(input ratio)로 나누어 계산합니다. 입력 비율은 주사 전 주사기 내의 CFSE 양성 세포와 CMTM TMR 양성 세포의 비율로, 이를 위해 별도로 보관하여 유세포 분석기로 분석한 5~10 µL의 세포 현탁액 분취물로부터 계산합니다. 입력 비율이 1에 매우 가까우면 조직 비율은 hi와 동일하게 됩니다.HI와 혈액의 수치가 1과 상당히 다를 경우, 분석 중인 조직의 HI를 혈액의 HI로 정규화할 수 있습니다. 이는 주입 18시간 후 비장, 말초 림프절(PLN), 장간막 림프절(MLN) 또는 소장 고유판(LP)에서 생성된 세포 현탁액의 HI로 조직의 HI를 나눈 비율을 계산하여 수행합니다. 게이트된 CD8 양성 CD45.1 양성 세포에서 CMTMR 및 CFSE 발현을 분석하였습니다. $\alpha 4$, $\beta 7$ 및 CCR9을 발현하는 활성화된 CMTMR 양성 T-세포는 대조군인 CFSE 양성 세포와 동일한 수로 비장에 귀환(homing)하였으나, 장 및 장관 관련 림프 조직으로의 귀환은 현저히 증가하였습니다. 각 조직에 대한 HI 계산을 통해, 장 친화성 T-세포와 대조군 T-세포가 비장으로는 동일하게 귀환함을 재확인하였으며, 반면 장 친화성 T-세포는 대조군 T-세포에 비해 LP로 약 10배 더 효율적으로 이동하였습니다. 절차 숙달 후 분석을 완료하였습니다.수지상 세포나 대식세포와 같은 추가적인 세포 유형의 이동 능력을 평가하기 위해 염료 표지 대신 동계 마우스를 사용할 수 있습니다. 이러한 세포 유형은 수용 마우스에 주입된 후 염료를 소실하는 경향이 있으므로, 동계 동물을 사용하면 세포를 더 효과적으로 추적할 수 있으며 입양 전이 후 훨씬 더 오랜 기간 동안 관찰이 가능합니다.

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을...

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우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

여기에서 우리는 창자 호밍 조절 T 세포 유도의 생체 내 확대를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 수지상 세포는 활성 비타민 D (1,25-디하이드록시 비타민 D 또는 1,25 [OH]2D) 및 활성 비타민 A (레티노산 또는 RA) 드 노보의 고농도를 국부적으로 생산하도록 설계되었습니다.

내장 호밍 규제 T 세포 유도의 생체 내 확대

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

우리는 수용체 매개 장기 및 미세환경 특이적 림프구 위치를 연구하기 위해 트래픽 수용체의 레트로바이러스 전달과 경쟁적 귀환을 위한 개선된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 면역 세포 이동 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 향후 기초 및 치료 연구에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

다양한 조직 미세환경에서 GPCR 매개 T 세포 국소화 연구를 위한 효율적인 레트로바이러스 형질도입 및 경쟁력 있는 호밍(Competitive Homing)

학습하세요 경쟁적 호박 분석법을 이용하여 장 특이적 T 세포와 대조군 T 세포의 조직별 이동 능력을 비교하는 방법을 배우세요. 이 기술은 면역학 연구에서 세포 이동 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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