Name: 배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 마우스 배아 사지 피부 혈관 형성을 위한 전체 마운트 면역조직화학 분석법을 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 함께 사용하는 방법입니다. 이 기술은 혈관 네트워크의 고해상도 영상화와 발달 과정 연구에 필수적입니다.

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우리는 마우스 사육 및 관리와 지원 및 실험실 관리 K. 길 주셔서 감사합니다. 또한 기술적인 도움을 무코 야마 연구실 회원에게 감사드립니다. 자금은 보건 Naitonal 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 제공되었다.

1. 수집 마우스 배아 림브 스킨 (E13.5 ~ E17.5) <ol><li> 안락사는 승인 절차에 의해 암컷을 연결. 우리의 승인된 동물 프로토콜에 따르면, 여자는 CO 2 노출에 의해 euthanized하고 다음 경추 전위에 의해 안심하시기 바랍니다. 의 흡수 종이 타월에 동물을 배치하고 스퀴즈 병에서 70% EtOH / H 2 O에서 철저하게 그것을 만끽해보세요. </li><li> 자궁은 그대로 해부하다 피로를 씻어 차가운 행크스 '밸런스드 소금 솔루션 (HBSS)이있는 100 X 15mm 페트리 접시에 놓으십시오. </li><li> 배아를 분리하고 해부하다. 배아에서 매우 얇은 양막을 제거합니다. </li><li> 각각의 배아는 genotyped해야하는 경우 (옵션) 35 X 10mm 페트리 접시에서 단일 배아를 해부하다. 해부 꼬리는 genotyping의 0.2 ML PCR 튜브로 전송됩니다. </li><li> 배아의 앞발로를 차단하고 전송 인산 버퍼 살린 (PBS)에 얼음처럼 차가운 신선한 4 % Paraformaldehyde (PFA) 2 ML을 포함한 24 잘 접시에 고리 집게로 앞발. </li><li> 4 ° C 하룻밤에 Nutator 믹서에 부드러운 믹싱으로 앞발을 고정. </li><li> 다음날, PFA를 제거하고 실온에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합과 PBS 2 ML 5 분 세 번 씻으십시오. </li><li> 100 % 메탄올 (MeOH)에 앞발을 전송하고 -20 ° C의 효소 냉동고 (임계 온도 제어와 자동 서리를 없애다 기능없이 냉동실)에 그들을 저장할 수 있습니다. 차 항체는 100 % MeOH 치료 후 표 1에 나열된 작업. </li><li> 고급 핀셋을 사용하여 forelimb에서 출발 피부 껍질. 림브 피부, 탈수, 갈기갈기 쉽게 분리해야합니다. 우선 직면 복부 측면 (손바닥 쪽)와 다리를 놓으십시오. 동영상과 같이 다음 고급 핀셋을 사용하여 피부를 잘라. 다음 손상없이 부드럽게 피부를 벗겨내는, 전체를 사지 주변 해부하다. </li></ol> 2. 림브 스킨 전체 - 마운트 Immunohistochemical 스테 이닝 <ol><li> MeOH / PBT (PBS + 0.2 % 트리톤 X - 100) (75 %, 50 %, 25 %) 5 분 각각의 등급 시리즈를 통해 잠복기에 의해 5ml 폴리 프로필렌 왕복 아래 튜브의 사지 스킨을 Rehydrate. 솔루션을 교환하면 사지 스킨 손상을 방지하기 위해주의를 기울여야합니다. </li><li> 상온에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합과 PBT에서 5 분 두 번 씻으십시오. </li><li> Nutator 믹서에서 부드러운 혼합 2 시간 동안 당나귀 차 항체에 대한 10 %의 염소 차 항체에 대한 혈청 / PBS 0.2 % TX100 차단 버퍼 염소 또는 10% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100 차단 버퍼에서 하나와 사지 스킨 블럭 상온. </li><li> 차단 버퍼의 기본 항체의 800μl (테이블에 나열된 적절한 희석) (와 2ml - microcentrifuge 관에 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 플레이스 중 10 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 10% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100). 4 ° C 하룻밤에 Nutator 믹서에 부드러운 믹싱으로 사지 스킨을 품어. 종 (예를 들어, 쥐의 단클론 항체 polyclonal 항체 + 토끼)에서 파생된 여러 기본 항체를 동시에 사용할 수 있습니다. </li><li> 다음날, 세척 버퍼의 4ml (중 2 %의 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 2 왕복 하단 튜브 5ml 폴리 프로필렌으로 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 장소 % 동키 혈청 / PBS 0.2 % TX100). </li><li> 부드러운 실온에서 Nutator 믹서에서 혼합과 함께 15 분 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 차단 버퍼 이차 항체의 800μl (중 10 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100하거나 10% 돈키 혈청 /를 함께 2ml - microcentrifuge 관에 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 플레이스 PBS 0.2 % TX100). 일반적으로 우리는 잭슨 ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 dilutions) 또는 Invitrogen (알렉사 플루어 488, 알렉사 플루어 568, 알렉사 플루어 633, 1:250 희석)에서 보조 항체를 사용합니다. 보조 항체의 집계 입자를 제거하는 0.22μm PVDF 막 주사기 필터를 사용하여 보조 항체 솔루션을 필터링합니다. 상온에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합 1 시간 동안 어둠이나 알루미늄 호일로 싼에서 사지 스킨을 품어. 종에서 파생된 다른 형광 복합 이차 항체를 동시에 사용할 수 있습니다. </li><li> 세척 버퍼의 4ml (2 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % 중 TX100 또는 2% 돈키 혈청 / PBS로 5ml 폴리 프로필렌 왕복 하단 튜브에 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 플레이스 0.2 % TX100). 어둠이나 부드러운 실온에서 Nutator 믹서에서 혼합과 알루미늄 호일로 싸서 15 분 다섯 번 씻으십시오. </li><li> (핵에 대한 counterstaining에 대한 옵션)는 세척 버퍼의 4ml (중 2 %의 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 2% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100)에 - PRO - 3 (Invitrogen T3605과 함께 사지 스킨을 품어 , 어둠 또는 객실 temperatu에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합 10 분 알루미늄 호일로 싼에서 1:3000 희석)다시. 그런 다음에 부드러운 혼합과 알루미늄 호일로 어둡거나 포장의 세척 버퍼의 4ml (2 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 2% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100을)를 5 분 세 번 씻어 상온에서 Nutator 믹서. 핵에 대한 강력하고 구체적인 얼룩이 특정 방출 (HeNe 633 나노미터 여기)에서하려면 - PRO - 3에 대한 관찰됩니다. </li></ol> 3. 슬라이드에 림브 스킨 장착 <ol><li> 35 X 10mm 페트리 접시에 사지 스킨을 놓습니다. 표백 광범위한 사진을 피하기 위해 낮은 조명과 stereomicroscope 이하 벌금 핀셋을 사용하여 스킨의 내부 계층에서 먼지, 크리스탈, 섬유를 제거합니다. </li><li> 고리 집게에 의해 접착제 현미경 슬라이드 사지 스킨을 전송합니다. 슬라이드 (coverslip으로 IE)에서 위쪽으로 누워 내부 레이어로 피부를 놓습니다. 신중하게 잘 핀셋을 사용하여 스킨을 평평하게하고 Kimwipe하여 버퍼를 세척 - 이월 제거하십시오. </li><li> 기포없이 안티 - 페이드 장착 매체 마운트합니다. 우리는 25 "x25"coverslip을 사용합니다. 어둠의 평평한 표면에 치료 (예 : 샘플보기 전에 실온에서 어둠 속에서 야간 배치 골드 시약을 연장 사용하여 마운트). 장기 저장을 위해, 4 슬라이드에 coverslip하고 저장을 날인 ° C. </li></ol> 4. 공촛점 현미경 <ol><li> fluorophores에 적합한 레이저를 설정합니다. 우리는 아르곤 488nm (알렉사 플루어 488와 GFP)을, DPSS 561nm (알렉사 플루어 568와 Cy3) 및 HeNe 633nm (알렉사 플루어 633, Cy5 및 - PRO - 3)을 포함하여 세 레이저 소스 Leica TCS SP5 공촛점 현미경을 사용하여 . </li><li> 더블 또는 트리플 묻은 샘플의 모든 염료가 동시에 흥분됩니다되는 누화를 방지하거나 줄이기 위해 순차적 스캔 도구를 사용하십시오. 순차 스캔 모드에서는, 이미지가 순차적으로 기록됩니다. </li><li> 여기에 대한 형광 염료와 레이저에 대한 더 일반적인 정보는 힙스 (2004)에 의해 "생물학에 대한 공촛점 현미경"의 설립 수 있습니다 </li></ol> 5. 대표 결과 팬 - 내피 세포 마커에 항체와 E15.5에서 마우스 forelimb의 피부에 전체 마운트 트리플 라벨 공촛점 immnofluorescence 현미경 PECAM - 1 (그림 1A - C, D 블루), neurofilament 마커 2H3 (그림 1A 녹색), 그리고 평활근 세포 마커 αSMA (그림 1A, B 적색)는 사지 피부에 2H3 + 주변 신경에 부합 αSMA + 동맥의 특성 분기 패턴을 공개했다. 분기 혈관뿐만 아니라,이 사지 피부 vasculature 모델은 림프 내피 세포 마커 LYVE - 1 (그림 1D, E 적색)와 Neuropilin2 (NRP2​​) (그림 1D, F 녹색으로 항체를 사용하여 분기 림프 혈관의 patterning을 연구하는 데 사용됩니다 ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. (AC) 동맥은 태아의 사지 피부에 말초 신경로 맞춥니다. 팬 - 내피 세포 마커 PECAM - 1 (AC, 파랑), neurofilament 마커 2H3 (A, 녹색), 그리고 평활근 세포 마커 αSMA (A와 B, 빨간색으로 항체와 함께 전체 마운트 트리플 라벨 공촛점 immnofluorescence 현미경 )이 표시됩니다. E15.5, 2H3 +에서 말초 신경 (오픈 화살표) αSMA에 의해 덮여 동맥 (화살촉) + 평활근 세포와 연결합니다. 배아 사지 피부에 (DF) 림프 vasculature. 팬 - 내피 세포 마커에 항체 PECAM - 1 (D, 파랑), 림프 내피 세포 마커 LYVE - 1 (D와 E, 빨간색)와 Neuropilin2 (NRP2​​) (D와 F, 녹색과 함께 트리플 라벨 공촛점 immnofluorescence 현미경 )이 표시됩니다. LYVE - 1도 macrophages (오픈 화살촉)의 하위 집합에 의해 표현된다 반면에 림프 혈관은 LYVE - 1 NRP2 모두에 의해 시각입니다. 스케일 바 : 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

그것이 충분한 산소와 장기에 영양분을 공급하기 때문에 혈관 시스템은 embryogenesis 동안뿐만 아니라 성인의 장기 유지 보수 및 생식 기능에 대한 장기 개발을 위해 매우 중요합니다. 적절한 혈관 네트워크는 기존의 모세관이 높은 분기와 계층 구조를 개편하고있는 angiogenesis에 의해 복잡하고 여러 단계의 프로세스를 잘 설정됩니다. 다수의 작품이 분자의 다양한 이러한 과정에 관여하는 것으로 나타났습되어 있지만, 그것은 장기 또는 구성 요소가 혈관 분기의 내피 분화 및 patterning을 포함한 혈관 개발의 stepwise 과정을 촉진하는 신호를 제공하는 방법을 명확되지 않았습니다. 이 질문을 해결하기 위해, 우리는 혈관 개발의 과정에 따라 수 있습니다 적절한 vascularized 기관이 필요합니다. 이득의 기능과 손실의 기능을 유전자 조작과 사지 피부 vasculature 모델은 혈관 개발의 고해상도 분석이 가능합니다. 우리는 여기서 배아 마우스 앞발의 해부 전...

항체 판 - 내피 세포 마커 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> PECAM - 1 </td><td> 아르메니아어 햄스터 (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100 희석 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM - 1 </td><td> 랫 (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 희석 </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> 랫 (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200 희석 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> 랫 (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 희석 </td></tr><tr><td> 콜라겐 IV </td><td> 래빗 (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150년부터 1470년까지 </td><td> 1:300 희석 # 2 </td></tr></tbody></table> 아티 내피 세포 마커 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> 래빗 (P) </td><td> 알렉스 Kolodkin의 실험실 # 3 </td><td></td><td> 1:3000 희석 </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> 염소 (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> 1:200 희석 </td></tr></tbody></table> 정맥 내피 세포 마커 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> 염소 (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> 1:100 희석 </td></tr></tbody></table> 림프 내피 세포 마커 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> LYVE - 1 # 4 </td><td> 래빗 (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> 1:200 희석 </td></tr><tr><td> LYVE - 1 # 4 </td><td> 랫 (M) </td><td> MBL </td><td> D225 - 3 </td><td> 1:200 희석 </td></tr><tr><td> Prox - 1 </td><td> 래빗 (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 희석 </td></tr><tr><td> Prox - 1 </td><td> 염소 (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 1시 50분 희석 </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> 래빗 (P) </td><td> 세포 신호 </td><td> 3366 </td><td> 1, 100 희석 </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> 시리아 햄스터 (M) </td><td> 하이 브리 도마 뱅크 </td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200 희석 </td></tr></tbody></table> 평활근 세포 / pericyte 마커 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> αSMA - CY3 </td><td> 마우스 (M) # 5 </td><td> 시그마 </td><td> C - 6198 </td><td> 1:500 희석 # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> 래빗 (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> 1:200 희석 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> 래빗 (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> 1:200 희석 </td></tr></tbody></table> GFP 기자에 대한 항체 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> 래빗 (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 희석 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> 랫 (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 희석 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> 칙 (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 희석 </td></tr></tbody></table> LacZ 기자에 대한 항체 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> β - 여자 </td><td> 래빗 (P) </td><td> MP 바이오 메디컬 </td><td> 55,976 </td><td> 1:5000 희석 </td></tr><tr><td> β - 여자 </td><td> 염소 (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 희석 </td></tr><tr><td> β - 여자 </td><td> 칙 (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> 1:200 희석 </td></tr></tbody></table> 주변 축삭에 대한 항체 <table border="1"><tbody><tr><td> 항독소 </td><td> 종 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 근무 조건 </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> 마우스 (M) # 7 </td><td> 하이 브리 도마 뱅크 </td><td> 2H3 </td><td> 1:200 희석 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> 마우스 (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS - 435P </td><td> 1:500 희석 </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> 래빗 (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 희석 </td></tr></tbody></table> 마이 그 레이션 Schwann 세포에 대한 항체 <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> 래빗 (P) </td><td> 토마스 뮐러의 실험실 # 9 </td><td></td><td> 1:3000 희석 </td></tr></tbody></table> (P) : polyclonal 항체 (M) : 단클론 항체 # 1 : 염소 방지 아르메니아어 햄스터 - Cy3 (잭슨 ImmunoResearch 127-165-160) 항체가 보조 항체로 사용해야합니다. # 2 : 콜라겐 IV 항체가 원위치 하이브리드화 이후 혈관을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. # 3 : Neuropilin1 항체가 친절하게 존스 홉킨스 대학의 알렉스 Kolodkin의 실험실에 의해 제공됩니다. 우리는 아직 테스트하지 않았습니다 있지만, 양 안티 인간 Neuropilin1 항체는 R &amp; D (AF3870)에서 사용할 수 있습니다. # 4 : LYVE - 1 항체는 또한 배아 피부에 macrophages의 하위 집합을 감지합니다. # 5 : 안티 αSMA 항체 마우스 IgG2a 단클론 항체이다. # 6 : Cy3 - 복합 αSMA 항체는 초와 함께 실온에서 1 시간 incubated입니다다른 일차 항체에 대한 항체 ondary. # 7 : 2H3 항체가 neurofilament에 대한 마우스 IgG1 단클론 항체이다. # 8 : Tuj1 항체가 신경 세포 특정 클래스 III 베타 tubulin에 대한 마우스 IgG2a 단클론 항체이다. # 9 : BFABP (두뇌 특정 지방산 결합 단백질) 항체가 친절 분자 의학에 대한 최대 - Delbrück - 센터의 토마스 뮐러의 실험실에 의해 제공됩니다.

배아 림브 스킨 vasculature에 대한 전체 마운트 immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

이미지에 대한 전체 마운트 immunohistochemical 분석은 전체 vasculature는 morphogenesis을 분기의 세포 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 우리는 기존의 원시 모세관 신경 얼기가 계층 브랜츠드 혈관 네트워크에 개편되는 혈관 개발을 연구하기 위해 사지 피부 vasculature 모델을 개발했습니다. 여러 개의 라벨과 함께 전체 - 마운트 공촛점 현미경 특정 형광 마커를 사용하여 내피 세포, pericytes 및 평활근 세포를 포함하여 그대로 혈관뿐만 아니라 자신의 세포 구성 요소의 강력한 이미징을 허용합니다. 유전자 연구와 함께 사지 피부 vasculature 모델의 발전은 혈관 개발 및 patterning의 분자 메커니즘을 이해하고 개선합니다. 사지 피부 vasculature 모델은 말초 신경이 동맥의 차별과 patterning을위한 공간 템플릿을 제공하는 방법을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 동영상이 문서에서는 우리가 혈관 개발의 과정에 따라 수 있습니다 vascularized 배아 기관에 대한 적용 혈관 특정 항체 및 형광 항체 보조와 완전한 혈관을 얼룩이 간단하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.

우리는 전체 마운트 immunohistochemistry를 소개하고 레이저 마우스 배아 사지 피부에 복잡한 혈관 네트워크 형성을 분석하는 데 여러 상표와 공촛점 현미경을 검사합니다.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

전체 혈관계를 영상화하기 위한 홀마운트 면역조직화학 분석은 분지 형태 형성의 세포적 기전을 이해하는 데 중추적인 역할을 합니다. 본 연구진은 기존의 원시 모세혈관 망이 계층적 분지 혈관 네트워크로 재구성되는 혈관 발달을 연구하기 위해 사지 피부 혈관 모델을 개발하였습니다. 다중 표지가 가능한 홀마운트 공초점 현미경 분석을 통해, 특정 형광 마커를 사용하여 내피세포, 혈관주위세포 및 평활근세포를 포함한 세포 구성 요소뿐만 아니라 온전한 혈관을 정밀하게 영상화할 수 있습니다. 유전자 연구를 통한 이 사지 피부 혈관 모델의 발전은 혈관 발달 및 패턴 형성의 분자적 기전에 대한 이해를 높였습니다. 사지 피부 혈관 모델은 말초 신경이 동맥의 분화와 패턴 형성을 위한 공간적 템플릿을 어떻게 제공하는지 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 본 비디오 논문은 혈관 특이적 항체와 형광 2차 항체를 사용하여 온전한 혈관을 염색하는 간단하고 정밀한 프로토콜을 설명하며, 이는 혈관 발달 과정을 추적할 수 있는 혈관화된 배아 기관에 적용 가능합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 사지 피부의 전체 혈관계를 이미징하기 위해 전체 마운트 면역조직화학 분석을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 배아에서 네 개의 사지를 절단하고, PBS 내의 4% paraformaldehyde로 네 개의 사지를 고정한 후, 100% methanol로 탈수시켜 달성합니다. 두 번째 단계는 미세 핀셋을 사용하여 사지 기저부의 피부를 벗겨내는 것입니다.파란색 점선을 따라 100% methanol이 담긴 접시에서 피부를 벗겨냅니다. 사지에서 피부를 제거하십시오. 다음으로, 혈관 특이적 1차 항체와 형광 2차 항체를 사용하여 사지 피부에 면역조직화학 염색을 수행합니다.마지막으로, 다중 표지를 이용한 홀마운트 공초점 현미경 관찰을 통해 사지 피부 혈관 전체를 정밀하게 이미징할 수 있습니다. 이는 횡단면 조직학적 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기법이 가지는 장점일 수 있습니다. 배아 절편법과 달리, 사지 피부 혈관의 홀마운트 면역조직화학 분석을 이용하면 세포 구성 성분을 포함한 전체 혈관을 이미징할 수 있을 뿐만 아니라, 혈관 세포의 분화 및 패턴 형성 과정과 림프관의 분지 과정을 연구할 수 있습니다. 저희 연구실의 박사후 연구원인 Winding DA와 함께 실험 절차를 시연하겠습니다. 우선 임신한 암컷 생쥐로부터 배아의 사지 피부를 수집합니다.자궁을 적출하고 세척한 후, 해부 현미경 하에서 배아를 분리하고 해부합니다. 배아 해부가 완료되면, 다음 단계로 미세 핀셋을 사용하여 배아에서 4개의 사지(LIMS)를 제거합니다. 어깨 부위에서 4개의 사지를 절단한 다음, 링 포셉(ring forceps)을 사용하여 얼음이 담긴 24웰 플레이트로 4개의 사지를 옮깁니다.차가운 신선한 PBS 내의 4% Paraformaldehyde를 준비하고, 웰당 4개의 사지(limb)를 2mL의 4% PFA에 넣습니다. 4°C에서 쉐이커 믹서로 부드럽게 혼합하며 밤새 사지를 고정합니다. 다음 날, 각 웰에서 PFA를 제거하고 2mL의 PBS를 첨가합니다.상온에서 뮤테이터 믹서(mutator mixer)를 이용하여 부드럽게 혼합하며 5분 동안 검체를 세척합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다. 다음으로, 4개의 사지를 100% methanol이 들어 있는 5 mL 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브로 옮겨, 자동 성에 제거 기능이 없고 임계 온도 제어가 가능한 효소 냉동고의 -20 °C에서 보관합니다. 하룻밤 동안 -20 °C에서 보관한 후, 사지에서 피부를 벗겨낼 수 있습니다.이 과정은 이후의 염색 및 이미징의 성공 여부가 피부 손상 방지에 달려 있기 때문에 이 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 이와 같은 방식으로 탈수시키면 사지에서 피부를 쉽게 박리할 수 있습니다. 먼저 사지의 복측이 위를 향하도록 놓으십시오.그 다음, 미세 핀셋을 사용하여 사지 기저부 근처의 피부부터 발 쪽으로 직선 방향으로 절개합니다. 이어서 사지 전체를 돌려가며 피부를 벗겨내어 절개합니다. 피부가 모두 제거되면.네 개의 사지 피부에 대한 전체 마운트 면역조직화학 염색을 시작합니다. 재수화(rehydrating)를 위해 PBT에 75%, 50%, 25% 메탄올이 포함된 50 mL stock 튜브 3개를 미리 준비합니다. 사지 피부는 메탄올 농도가 가장 높은 것부터 낮은 순서로, 각 단계당 5분씩 일련의 농도 구배를 통해 배양하여 재수화합니다.먼저 사지 피부를 PBT 내 75% methanol이 담긴 5 mL 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다. 무타터 믹서(mutator mixer)에서 5분간 처리한 후, 75% methanol을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 50% methanol과 PBT로 다시 채웁니다. 5분 후.50% methanol을 25% methanol 및 PBT로 교체하십시오. 마지막 배양 단계가 끝나면, 25% methanol PBT를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 PBT로 다시 채우십시오.실온에서 mutator mixer를 이용해 부드럽게 혼합하며 사지 피부를 5분 동안 세척합니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 이때 용액을 교체하는 동안 사지 피부가 손상되지 않도록 주의하십시오.사지 피부의 재수화가 완료되면, 적절한 블로킹 완충액으로 블로킹을 수행합니다. 실온에서 너트 믹서(nut mixer)를 사용하여 부드럽게 혼합하며 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 사지 피부를 35 by 10 millimeter 페트리 접시에 놓습니다. 그런 다음 링 포셉을 사용하여 피부를 적절한 블로킹 완충액에 희석된 800 microliters의 1차 항체가 들어 있는 2 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.여기에서는 서로 다른 종에서 유래한 여러 가지 일차 항체를 동시에 사용할 수 있습니다. 4°C의 mutator mixer에서 부드럽게 혼합하며 사지 피부를 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 사지 피부를 35 x 10 mm 페트리 접시에 놓습니다. 피부를 적절한 세척 완충액 4 L가 들어 있는 5 mL 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다.실온에서 mutator mixer를 사용하여 부드럽게 섞으며 15분씩 5회 세척합니다. 세척 시마다 사용한 버퍼를 새 버퍼로 조심스럽게 교체하십시오. 2차 항체에서 응집된 입자를 제거하기 위해 2차 항체를 준비합니다.0.22 micron PVDF membrane 시린지 필터를 사용하여 2차 항체 용액을 1.5 milliliter 원심분리 튜브에 필터링합니다. 그 다음, 입자와 기포를 제거하기 위해 필터링된 샘플을 4 °C에서 15,000 RPM으로 10분 동안 원심분리합니다. 필터링된 항체 용액을 2 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.5회 세척을 마친 후, 사지 피부를 35 by 10 millimeter 페트리 접시에 놓고, 블로킹 버퍼에 희석된 800 microliters의 2차 항체가 들어 있는 2 liter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 단계에서는 서로 다른 종에서 유래한 다양한 형광 결합 2차 항체를 동시에 사용할 수 있습니다. 사지 피부를 실온에서 무타토믹 믹서(mutator mixer)를 이용해 부드럽게 혼합하며 암소에서 1시간 동안 배양합니다.1시간의 배양 후, 사지 피부를 35 by 10 millimeter 페트리 접시에 놓고 이를 적절한 세척 완충액 4 milliliter가 들어 있는 5 milliliter 폴리프로필렌 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다. 공초점 현미경 이미징을 위해 상온에서 Tator 믹서를 이용해 부드럽게 혼합하며 암실에서 15분씩 5회 세척합니다. 면역 조직 화학 염색 후 사지 피부를 슬라이드에 마운팅해야 합니다.이 절차를 시작하려면, 낮은 조도의 실체 현미경 하에서 염색된 사지 피부를 35 by 10 millimeter 페트리 접시에 놓으십시오. 광퇴색이 심하게 일어나는 것을 방지하기 위해, 미세 핀셋을 사용하여 피부 내층의 먼지 결정과 섬유를 제거하십시오. 그 다음 사지 피부를 접착식 현미경 슬라이드로 옮기십시오.내층이 위로 향하게 하여 커버 슬립과 마주 보도록 슬라이드 위에 피부 조직을 놓습니다. 그다음 미세 핀셋을 사용하여 피부 조직을 조심스럽게 폅니다. 남아 있는 세척 버퍼는 Kim wipe로 제거합니다.피부에 Antifa mounting media를 추가하고 시편 위에 25 by 25 커버슬립을 덮습니다. 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하며, 시편의 장기 보관을 위해 실온의 어두운 평평한 표면에서 경화시킵니다. 매니큐어로 커버슬립을 슬라이드에 밀봉한 후 4 °C에서 보관합니다.E 15.5 마우스 사지 피부의 신경 및 혈관 패턴이 전체 마운트 삼중 표지 공초점 면역형광 현미경의 대표적인 결과로 나타나 있습니다. 범내피세포 마커 pcam one은 파란색으로, 신경필라멘트 마커 two H three는 녹색으로, 그리고 평활근세포 마커 alpha SMA는 빨간색으로 표시되었습니다. 이러한 이미지들은 혈관 분지 외에도, 빈 화살표로 표시된 two H three 말초 신경과 나란히 배열된 흰색 화살촉으로 표시된 alpha SMA 양성 동맥의 특징적인 분지 패턴을 보여주었습니다.이 사지 피부 혈관 모델은 붉은색으로 표시된 림프 내피 세포 마커 LYVE-1과 녹색으로 표시된 neuropilin-2를 사용하여 림프관 분지의 패턴을 밝힐 수 있습니다. 림프관은 LYVE-1과 NRP2 모두에 의해 시각화되는 반면, LYVE-1은 빈 화살표 머리로 표시된 일부 대식세포에서도 발현됩니다. 이 기술은 혈관 생물학 분야의 연구자들이 조직 발달, 조직 복구 및 질환 상태에서 혈관의 복잡한 패턴 형성과 분화 과정을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

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연구

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생물학

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

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의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

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여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

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정량적 연구를 위한 소동물 혈관 구조의 신속한 전체 마운트 고해상도 이미징

배우세요 마우스 배아 사지 피부 혈관 형성을 위한 전체 마운트 면역조직화학 분석법을 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 함께 사용하는 방법입니다. 이 기술은 혈관 네트워크의 고해상도 영상화와 발달 과정 연구에 필수적입니다.

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