장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

다음 실험의 전반적인 목표는 장거리 관련 DNA 파트너를 발견하고 식별하는 것입니다. 이것은 첫 번째 제한 효소에 의한 DNA의 고정, 세포 용해 및 소화에 의해 달성된 다음 결찰을 통해 두 관련 유전자의 분절로 구성된 키메라 DNA를 생성함으로써 달성됩니다. 다음 링커를 제2 제한 분해 후 키메라 DNA에 첨가하고, 이의 증폭을 용이하게 하기 위해, 관련 DNA 단편의 충분한 양을 수득하기 위해 링커 및 미끼 DNA 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 이어서 수행하고, 증폭된 DNA 단편의 서열 분석을 기초로 미끼 DNA와 장거리 관련 DNA 파트너를 보여주는 결과를 얻는다.

염색체 확인 캡처 또는 3 C와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 A-C-T-S-A를 사용하여 알려지지 않은 장거리 관련 DNA 파트너를 효과적으로 식별할 수 있다는 것입니다. 반면 3C는 이전에 의심되는 상호 작용만을 검증하기 위해 발생했습니다. 이 프로토콜 배양을 시작하기 위해 인큐베이터의 인간 세포는 섭씨 37도에서 80-90%가 될 때까지 5%의 이산화탄소를 공급합니다.

이 시연에는 인간 무도회 산성 백혈병 세포가 사용됩니다. 세포를 50ml NOC 튜브에 붓고 1200RPM에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 원심분리 후 흡인으로 배지를 제거합니다.

세포 펠릿을 재현탁시키기 위해 5ml의 배양 배지를 첨가합니다. 혈류 세포 분석기로 세포를 계수 한 후, 10 % FBS를 함유 한 배지 인 RPMI 1640을 사용하여 40 밀리리터의 부피로 7 번째 세포를 약 1 배 1 회 복용합니다. 그런 다음 1.7ml의 37% 포름알데히드를 첨가하여 묽은 염색질을 고정합니다.

실온에서 10분 동안 부드럽게 흔들어 샘플을 배양합니다. 배양 후, 2.4 밀리리터의 2 몰 글리신으로 반응을 냉각시킵니다. 다음으로, 1200RPM과 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다.

슈퍼 나틴을 제거한 후, 40ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 펠릿을 한 번 세척한 다음 샘플을 원심분리하여 세척된 세포 펠릿을 회수하고, 생성된 펠릿을 새로 첨가된 프로테아제 억제제가 있는 40ml의 얼음 저온 용해 완충액에 재현탁시키고, 0.1밀리몰 PMSF는 90분 동안 회전하면서 차가운 방에서 샘플을 배양합니다. 마지막으로 2, 500 RPM에서 15분 동안 샘플을 원심분리하고 슈퍼 나틴을 제거하고 분리된 핵을 얻습니다. 0.5 밀리리터의 XNEB 버퍼 3 개에 핵을 다시 현탁시키고 15 마이크로리터의 10% SDS를 추가합니다.

섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 45 마이크로 리터의 20 % Triton X 100을 첨가하여 SDS를 격리하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 1 회 10에서 6 배의 진탕 및 분취로 다시 배양합니다. 핵 또는 약 15마이크로그램은 55마이크로리터의 핵 용액으로 제한 효소 분해에 사용됩니다.

433 마이크로 리터의 XNEB 버퍼 3과 12 마이크로 리터의 BGL 2를 추가합니다. 총 소화 반응 부피를 500 리터로 만들려면 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양하십시오. 다음날은 10%SDS의 95 마이크로리터를 추가해서 금지 효소를 비활성화하고 20 분 동안 65 섭씨 온도에 가열해서 효소를 변성시킵니다.

수조에 7ml의 1 x ligation 버퍼와 360 마이크로리터의 20% Triton X 100을 추가합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 온도를 섭씨 16도로 낮추고 마이크로리터당 400단위씩 50마이크로리터를 추가합니다.

T 4 DNA 리가제. 결찰 반응을 섭씨 16도에서 4시간 동안 배양한 다음 실온에서 30분 동안 배양합니다. 결찰이 완료된 후 300마이크로그램의 proteinase K를 추가하고 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 RNAA 5마이크로그램을 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 페놀 클로로포름 추출로 DNA를 정제하고 이소프로판올에 침전된 DNA를 150마이크로리터의 멸균 증류수에 용해시킵니다. 키메라 DNA에 링커를 추가하려면 먼저 정제된 DNA 2마이크로그램을 5단위의 msp로 배양하여 DNA를 소화하고, 하나는 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 배양한 다음 MSP 1을 섭씨 65도에서 10분 동안 비활성화합니다.

그런 다음 DNA를 에탄올에 1 밀리리터 당 5 밀리그램으로 침전시킵니다. 글리코겐은 생성된 DNA 구개를 50마이크로리터의 멸균 증류수에 용해시킵니다. 다음으로, 50마이크로리터의 MSP 1 처리된 DNA를 2마이크로리터의 20마이크로몰 링커 올리고뉴클레오티드 L 및 1마이크로리터의 20마이크로몰 올리고뉴클레오티드 S와 혼합한 다음 1마이크로리터의 멸균 증류수와 6마이크로리터의 10XT 4DNA 리가아제 완충액을 추가합니다.

혼합물을 액체 왁스로 덮으십시오. 올리고뉴클레오티드를 섭씨 50도에서 1분 동안 변성시키고 분당 섭씨 0.5도의 구배로 섭씨 10도까지 서서히 냉각시킵니다. 열 순환기를 사용하여 마이크로리터 T 4 DNA 리가아제당 400 단위의 1마이크로리터를 첨가하고 하룻밤 동안 섭씨 15도에서 반응을 배양합니다.

다음 날, kaya quick PCR 정제 키트를 사용하여 링커 결찰 DNA를 정제하고 50마이크로리터의 멸균 증류수로 용출합니다. 장거리 상호 작용에 대해 조사할 DNA의 특정 영역에 대한 프라이머를 선택합니다. 이 예에서는 Abel이 프라이머 또는 미끼로 사용됩니다.

정제된 DNA 1마이크로리터를 20마이크로몰 1마이크로리터 특이적 프라이머 1개, 46 56 및 20마이크로몰 링커 특이적 프라이머 1마이크로리터 29 63과 결합하여 1차 PCR을 위해 정제된 DNA를 준비합니다. 그런 다음 서면 프로토콜에 따라 이전에 32 P-D-C-T-P와 혼합된 칵테일 3마이크로리터, 3마이크로리터의 ClinTech, DNA 중합효소, 칵테일 1개를 추가한 다음 3마이크로리터의 멸균 증류수를 추가합니다. PCR 주기가 완료된 후 서면 프로토콜에 설명된 핫 스타트 PCR 열 주기를 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다.

kaya quick PCR 정제 키트를 사용하여 1차 PCR 산물을 정제하고 30마이크로리터의 멸균 증류수로 용리합니다. 100배 희석된 첫 번째 PCR 생성물 1마이크로리터를 사용하여 20마이크로몰 1개 특이적 프라이머, 46 26 및 20마이크로몰 링커 특이적 프라이머 1마이크로리터를 첨가하여 중첩된 프라이머를 사용하여 PCR의 2차 라운드를 수행합니다. 29 61.

다시 3마이크로리터의 ClinTech 3개, DNA 중합효소, 칵테일 1개, 3마이크로리터의 멸균 증류수를 추가합니다. 20초 동안 섭씨 95도씩 25주기의 열 순환 일정을 사용하여 PCR의 두 번째 라운드를 실행합니다. 섭씨 67도에서 40초, 섭씨 72도에서 1분간 기온을 유지한 후 72도에서 5분 동안 섭씨 72도를 연장합니다.

5%urea page gel을 실행한 다음 phospho imager에서 노출된 화면을 스캔하여 PCR 산물을 시각화합니다. 각 PCR 밴드는 60마이크로리터의 멸균 증류수가 들어 있는 einor 튜브에 겔 스트립을 용해하고 섭씨 95도에서 5분 동안 배양하여 겔에서 재활용할 수 있습니다. 원심 분리기. 녹은 젤 제품은 10, 10 초 동안 000 분당 회전수에 짧게 생성한다.

모든 샘플을 수집합니다. 프라임 복구와 함께 PCR을 수행하기 위한 DNA 템플릿으로 사용하기 위해 1마이크로리터를 제거합니다. 29 61 46 26.

위에서 설명한 것과 동일한 조건을 사용하여 정제 및 염기서열분석 후 온라인 도구를 사용하여 염색체 위치를 결정하기 위한 분석을 수행할 수 있습니다. 게놈 생물정보학 사이트에서 blatt를 클릭하여 새 창을 생성하고 DNA 염기서열을 붙여넣습니다. DNA 염기서열을 제출하면 BLATT 검색 결과가 나타납니다.

100% 신원이 있는 히트의 브라우저를 클릭하여 DNA 염기서열의 위치를 표시합니다. 유능한 한 영역은 장거리 DNA 상호 작용을 결정하기 위한 미끼로 사용되었습니다. PCR 프라이머 세트의 2차 라운드에서 A CT 분석을 위해 2개의 BGL, 2개 사이트 및 1개의 BAM H 1개 사이트를 선택하고, 46, 26, 29, 61을 사용하여 able M1을 증폭하고, 46.30, 29, 61은 able M 2에 사용하였고, 46, 36, 29, 61은 able M three에 대해 사용하였다.

전형적인 겔 패턴은 여기에 표시된 것처럼 하나 내지 여러 개의 띠를 나타냅니다. 클론 가능 M1의 DNA 염기서열은 A CT 분석법의 각 단편이 두 개의 결합된 DNA 세그먼트로 구성되어 있음을 입증하는 것으로 나타났습니다. 한 세그먼트는 미끼 DNA 영역에서 파생되고 두 번째 세그먼트는 관련 파트너에서 파생됩니다.

상기 분절들은 제1 제한 효소 인식 서열에 의해 서로 결합된다. 두 번째 효소 인식 서열은 관련 파트너 서열의 끝에 나타납니다. 복제된 능력 있는 M1 단편은 염색체 9 Q 32.4에 위치한 ABLE 1의 영역에서 DNA를 포함하고, 관련 파트너는 proc 2로 확인된 염색체 3 P 3에 위치합니다.

유사하게, 유능한 M2 관련 파트너는 염색체 5번 Q 21.1에 국한된 반면, 클론 유능한 M 3은 3개의 C 분석과 대조적으로 ABLE 1 유전자좌 근처에서 염색체 내 결합으로 확인되었습니다. 이 비디오에 설명된 방법론은 가장 일반적인 장거리 상호 작용에 대해 선택합니다. 그러나, PCR R 주기의 수를 증가시켜서, 쥐 fiberblast 세포에 있는 미끼 DNA로 IGF 2 H 19 궤위에 각인과 통제 지구 또는 ICR를 사용하여 추가 보다 적게 빈번한 협회를 확인하는 것이 가능합니다, 다른 순환 프로그램은 A CT 분석실험에 있는 PCR의 첫번째 그리고 두번째 라운드에서 적용되었습니다.

A CT 분석은 정상 세포와 암세포 간의 핵 구조 및 장거리 상호 작용의 차이를 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 정상 결장 조직 및 대장암 조직을 균질화하고, 본 명세서에 기술된 절차에 따라 A CT 분석을 수행하였다. 여기에 보이는 것은 IGF 2 H 19 유전자 자리와 IGF 2 유전자 dpn에서 ICR 영역의 DNA 구조입니다.

A CT 분석을 위한 두 부위는 라벨링되어 있고, 두 번째 라운드에서 사용되는 프라이머는 서로 다른 색상으로 화살표와 숫자로 라벨링됩니다. A CT 분석의 겔 패턴은 프라이머 쌍 41, 61, 41, 63, 51, 45 및 51 51 중 하나와 함께 프라이머 29 61을 사용한 PCR 결과를 나타냅니다. 정상적인 결장 조직에서만 나타나는 독특한 띠는 노란색 화살표로 표시되고, 대장암 조직에서만 나타나는 띠는 발달 후 빨간색 화살표로 표시됩니다.

이 기술은 시장 생물학 분야의 연구자들이 핵 구조와 유전자 조절을 3차원적으로 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.