Name: 장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 학습하세요 관련 염색체 트랩(ACT) 분석법을 이용하여 장거리 DNA 상호작용을 확인하는 방법을. 인류 전골수성 백혈병 세포를 모델로 사용하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구합니다.

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우리가 그들의 3C 프로토콜을 공유하기위한 대단히 아델 무렐와 늑대 Reik 감사합니다. 이 작품은 국방부와 재향 군인의 담당 부서의 연구 서비스의 부서에 의해 지원되었다.

1. 장거리 염색질 상호 작용의 포름 알데히드 고정 <ol><li> 인큐베이터에서 15% FBS 및 80-90%의 합류 1 X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 문화 인간의 세포 라인 RPMI1640 매체 HL - 60, 37에서 5 % CO 2와 함께 제공된 ° C. </li><li> 15 분 동안 1,200 rpm으로 50 ML Nunc 튜브, 원심 분리기로 세포를 수집하고 열망하여 미디어를 제거 </li><li> 셀 알약을 resuspend하고 hemocytometer를 사용하여 셀을 카운트하는 문화 매체의 5 ML을 추가합니다. RPMI1640 / 10 % FBS 40 ML의 볼륨에 약 1 X 10 7 세포를 가지고, 다음 희석 염색질를 해결하기 위해 37 % 포름 알데히드의 1.7 ML를 추가합니다. </li><li> 부드러운 잡고 10 분 동안 상온에서 품어, 그리고 2M 글리신의 2.4 ML로 끄다. 4 1,200 rpm으로 15 분 동안 원심 분리기는 ° C, 그리고 표면에 뜨는를 제거합니다. 40 ML 얼음 차가운 PBS로 한번 펠렛을 세척 후 펠렛를 스핀 다운하고 PBS를 제거합니다. </li></ol> 2. 핵을 분리하기 위해 셀 용해 <ol><li> 갓 추가 테아제 억제제 (1:500 희석)와 0.1 MM PMSF 얼음 차가운 용해 완충액 (10 MM 트리스 - HCL, pH8.0, 10 MM NaCl, 0.2 % NP - 40) 40 ML에 Resuspend 세포. 90분, 15 분 동안 2,500 rpm으로 원심 분리기에 대한 회전 추운 방에 부화하고, 표면에 뜨는를 제거합니다. </li></ol> 3. Bgl II와 제한 효소 소화 <ol><li> 1 X 코 버퍼 3 0.5 ML의 핵 Resuspend, 15 μlof 10% SDS를 추가합니다. 잡고 1 시간 동안 37 ° C에서 부화 후, 트리톤은 X - 100 SDS를 격리 20 % 45 μl를 추가합니다. ° C 1 시간 잡고 37 알을 품다. </li><li> 제한 효소 분해 1 X 10 6 핵 (15 μg, 원래 셀은 10 분의 1)의 나누어지는을 사용합니다. 단계 3.1에서 핵 솔루션 55 μl를 꺼내 1 X 코 버퍼 3 Bgl II (50U/ul) 12 μl의 433 μl 500 μl까지합니다. ° C 하루 37 알을 품다. </li></ol> 4. 상호 작용하는 DNA 세그먼트의 결합 <ol><li> 65 가열하여 95 10% SDS의 μl 및 변성을 추가 ° 물을 욕조에 20 분 C.하여 제한 효소를 Inactivate </li><li> 하나의 X 내고 버퍼 (30 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 10 MM MgCl 2, 10 MM DTT, 1 MM ATP) 20 % 트리톤 X - 100 360 μl 7 ML 추가 1 시간 동안 ° C 37 알을 품다 . </li><li> 16 온도를 낮게 ° C 400 U / μl T4 DNA ligase의 50 μl를 추가합니다. 30 분 실온에서 다음 4 시간 동안 16 ° C에서 샘플을 품어합니다. </li></ol> 5. DNA의 정제 <ol><li> proteinase K 300 μg을 추가하고, ° C 야간 65 알을 품다. </li><li> 37과 부화 ° C 30 분 RNase의 5 μg 추가 </li><li> 이소프로판올에 페놀 / 클로로포름 추출 및 침전의 DNA에 의해 DNA 정화. 멸균 증류수 150 μl의 DNA를 디졸브. </li></ol> 6. MSP I과 소화와 oligonucleotide linkers과 결합 <ol><li> 4-6시간에 대한 37 MSP I 5 단위 ° C를 DNA를 정화의 2μg을 품어. 65 I를 MSP Inactivate ° 10 분 C는 다음 5 MG / ML 글리코겐 1 μl와 에탄올의 DNA를 침전. 멸균 증류수 50 μl의 DNA 펠렛을 디졸브. </li><li> 20 μm의 링커 oligonucleotide의 L 2 μl와 MSP I - 대우 DNA의 50 μl를 혼합 (5' - gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac - 3 '), 20 μm의 oligonucleotide S (5' - cggtgaatc - 3 1 μl'), 1 μl 무균 증류수 10 X T4 DNA ligase의 버퍼 6 μl. 액체 왁스와 혼합을 커버. </li><li> 50 변성 oligonucleotides ° C 1 분, 10 점차 진정 수에 대한 ° C 온도 자전거 타는 사람에서 0.5 ° C / 분 그라데이션 인치 </li><li> 400 U / μl T4 DNA ligase의 1 μl를 추가하고 15 ° C 하룻밤에 품어. 링커 - 출혈도 잡았 QIAquick PCR의 정제 키트를 사용하여 DNA와 멸균 증류수 50 μl에 elute 정화. </li></ol> 7. PCR 증폭 및 시퀀스 분석 <ol><li> 당신이 장거리 상호 작용 (즉, '미끼')에 대한 검토하고자하는 DNA의 특정 지역에 대한 입문서를 선택합니다. 이 예제에서, 우리는 ABL - 1을 사용합니다. </li><li> 20 μm의 1 μl를 사용하여 첫 라운드 PCR ABL -1 특정 프라이머 # 4656 (5' - gttcaagcgattctcctgcctcga - 3 '), 20 μm의 1 μl 링커 특정 프라이머 # 2963을 (수행할 수있는 정화 DNA 1 μl을 가지고 5' - 3 X Klen DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 나는 칵테일과 멸균 증류수 3 μl의 gctgaccctgaattcgcacgtgcct - 3 '), 3μl. 32 P - dCTP 두 μl는 PCR 증폭하기 전에 세 X Klen DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 나는 칵테일 100 μl에 추가됩니다. 95 18 사이클 ° 20 초 동안 C, 65 ° 40 초전에 C, 72 ° C 1 분,, 마지막 확장자 핫 시작 PCR에 대한 열 사이클 72 ° 2 분, 95 C ° Cfor 이분입니다 72에서 수행됩니다 ° C5 분. </li><li> 멸균 증류수 30 μl에 QIAquick PCR의 정화 키트 및 elute DNA를 사용하여 첫 라운드 PCR 제품 정화. </li><li> 20 μm의 1 μl ABL - 1 특정 프라이머 # 4626 (5' - ggagaatttttatctgcctctgtga - 3 ') (그림 1A), 1 μl를 추가하여 중첩 primers를 사용하여 PCR의 두 번째 라운드를 수행하는 첫번째 PCR 제품을 희석 100 X 1 μl을 가지고 링커 특정 프라이머 # 2961 (5' - gtcgttagcggacacagggcgattc - 3 '), 멸균 증류수의 μl 3 X Klen DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 나는 칵테일과 3 개 중 3 μl의 20 μm의 중. 온도 사이클링 일정가 95의 25주기입니다 ° 20 초 동안 C, 67 ° 40 초전에 C, 72 ° C 5 분 72 ° C에서 확장하여 다음 1 분하십시오. </li><li> 5 % 우레아 페이지 젤을 실행하고 PhosphoImager에 노출된 화면 (그림 1B)를 스캔하여 PCR 제품을 시각화. 각 PCR 밴드가 멸균 증류수 60 μl를 포함 Eppendorf 튜브에 겔 스트립을 해소하고, ° C 5 분 95시 잠복기에 의해 겔에서 재활 용할 수 있습니다. 모든 샘플을 수집하기 위해 10 초 10,000 rpm으로 간단히 원심 분리기. 위에서 설명한 것과 같은 조건을 사용하여 뇌관의 페어 4,626분의 2,961로 PCR을 수행하기 위해 DNA를 템플릿으로 사용하여 1 μl를 제거합니다. 시퀀스 분석 QIAquick PCR의 정제 키트를 사용하여 정제 후 수행할 수 있습니다. </li><li> http://genome.ucsc.edu (그림 1C) : DNA 시퀀스는 웹 사이트에서 자신의 염색체 위치를 결정하는 온라인 도구를 사용하여 분석하고 있습니다. DNA 시퀀스를 붙여넣을 수있는 새 창을을 입력하려면 'BLAT'을 클릭, 새로운 윈도우 '제출'을 클릭 후 나타나는, 그리고 'BLAT 검색 결과'를 보여줍니다. DNA 순서의 위치를​​ 보여주기 위해 다음 창문을 입력 100 % 신분으​​로 조회를 클릭한 다음 '브라우저'. </li></ol> 8. 대표 결과 1. 긴 범위의 DNA 상호 작용을 결정 미끼로 ABL - 1 영역을 사용하여 ACT 분석 그림 1A, 두 Bgl II 사이트 하나 BamH I 사이트의 그림은 ACT 분석을 위해 선택되었다. PCR의 두 번째 라운드에서, 뇌관은 2,961분의 4,626이 ABL - M1을 증폭하는 데 사용된 설정 2,961분의 4,630은 ABL - M2 사용되었고, 2,961분의 4,636은 ABL - M3를 위해 사용되었다. 전형적인 겔 패턴은 여러 밴드 (그림 1B) 하나 보여줍니다. ACT의 분석에서 각 조각은 두 결합 DNA 세그먼트로 구성되어 있습니다 : 두 번째 세그먼트가 첫 번째 제한 효소 인식 시퀀스로 미끼 지역 세그먼트에 합류했습니다 관련된 파트너에서 제공하는 동안 한 세그먼트는 미끼의 DNA 지역에서 파생됩니다. 두 번째 효소 인식 시퀀스 관련된 파트너 순서 (그림 1C)의 끝 부분에 표시됩니다. 복제된 ABL - M1 조각 +133,592,306-133,592,399에서 염색체 9q32.4에 위치한 ABL1의 지역에서 DNA를 포함하고, 관련된 파트너는 +71,869,882-71,870,107에서 염색체 3p13에 위치하고 있습니다. 관련된 파트너의 신원은 UCSC 게놈 브라우저 (월 출시 GRCh7/hg19 2009)를 사용하여 자신의 시퀀스를 분사에 의해 발견됩니다. PROK2는 chr3p13 로커스에 관련된 파트너로 확인되었다. 클론 ABL - M3가 ABL - 1 로커스 근처 내부 염색체 연관로 식별하는 동안 마찬가지로, ABL - M2 관련된 파트너는 chr5q21.1로 지역화된되었습니다. 2. ACT의 분석을 사용하여 적은 유행 원거리 상호 작용을 결정 3C에 따라 다른 assays 우리는 그림 1과 Igf2 / H19 로커스 12 보였습니다보다 많은 상호 작용하는 파트너를보고있다. 우리가 설명해야하는 방법론은 가장 널리 원거리 상호 작용을 선택합니다. 그러나, PCR 사이클의 수를 늘림으로써, 그것은 추가로, 덜 자주 연관을 식별할뿐만 아니라 (그림 2) 수 있습니다. 3. 정상 조직에 비해 암세포에 긴 범위 상호 작용의 차이. ACT의 분석도 정상 세포와 암세포 (그림 3) 사이의 핵 구조의 차이와 원거리 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 차이는 셀 변환하는 동안 발생하는 핵 구조의 변화를 반영 수 있으며, 따라서이 분석은 궁극적으로 진단 목적으로 적용할 수 있습니다. 정상 및 암 조직 모두에서 발생하는 유사한 겔 패턴 ACT 분석은 안정적이고 반복이라고 지적했다. ACT의 분석은 피시 앤 칩의 assays 같은 장거리 DNA 파트너, 자세한 분석, 멀리 loci 간의 식별 협회의 존재를 확인하는 데 필요한을 식별할 수 있지만. 유전, 생리학 및 생화학 연구는 다음이 장거리 DNA 협회의 생물 학적 의미를 명료하게하다을 수행할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> HL - 60 세포에서 DNA 미끼로 ABL - 1 영역을 사용하여 그림 1 ACT 분석. A. DNA의 구조체ABL - 1 지역에 우레. ACT 분석에 사용되는 첫 번째 제한 효소 Bgl II되었습니다. PCR의 두 번째 라운드에 대한 primers도 화살표와 해당 뇌관 번호로 표시됩니다. B. 5% 요소 페이지에서 ACT 분석의 젤 형태. 프라이머 쌍 2,961분의 4,626이 중첩된 PCR에 ABL - M1 클론을 확장에 사용 되었음 2,961분의 4,630은 클론 ABL - M2 사용되었고, 2,961분의 4,636은 복제 ABL - M3를 위해 사용되었다. C. 클론 ABL - M1의 DNA 시퀀스. ABL - 1 미끼 DNA의 DNA 단편은 빨간색으로 표시하고, 연관된 DNA 파트너는 시안에 표시됩니다. Bgl II 사이트 (AGACTC)은 녹색으로 표시되었습니다이며, MSP I 사이트 (CCGG)은 자주색으로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 PCR 사이클 행동 분석 결과에 영향을 미칩니다. 마우스 fibroblast 세포에서 미끼의 DNA로 Igf2/H19 로커스에서 각인 제어 영역 (ICR)을 사용하여 다양한 자전거 프로그램은 ACT 분석에서 PCR의 첫 번째와 두 번째 라운드에 적용되었습니다. PCR의 첫 라운드에서 18-20 사이클 시각있을 정도로 신호를 증폭하지 않았다. 분명 밴드의 두 번째 PCR 결과에서 스물 다섯 사이클, PCR의 두 번째 라운드를위한 사이클의 수를 증가하면서 더 밴드 이외에 얼룩 패턴을 유도. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 ACT 분석에서 정상적인 결장 조직 및 결장암 조직 사이의 핵 구조의 차이 3 탐지. A. IGF2/H19 로커스과 IGF2 유전자의 ICR 지역의 DNA 구조를. ACT 분석을위한 Dpn II 사이트가 표시됩니다. 두 번째 라운드에 사용되는 PCR Primers는 그림의 패널 B의 각 차선에 해당하는 다양한 색상의 화살표와 숫자로 표시됩니다. B. 5% 요소 페이지에서 ACT 분석의 젤 형태. 정상 대장 조직 MAD03 - 1423 및 결장암 조직 MAD04 - 149은 협동 조합 인체 조직 네트워크 (CHTN) 서부 본부로부터 얻은 것입니다. 각 결장 조직을 균질 후, ACT 분석은 여기에서 설명하는 절차는 다음과 같은 수행되었다. 레인 1은 프라이머 쌍에게 패널에 분홍색으로 표시 # 2961and # 4161 (5' - tctgcgccatcagggcagtgagac - 3 ')를 사용하여 PCR 결과를 나타내고, 차선 2 프라이머 쌍에게 # 2961과 # 4163 (5' - gccgcgcggccacttccgattcc - 3를 사용하여 PCR 결과를 나타냅니다 ')가 패널에 오렌지색으로 표시, 차선 3 뇌관 쌍을 # 2961과 # 5145 (5' - gccatgcaggtaggatttgagctg - 3를 사용하여 PCR 결과를 나타내는'패널에서 파란색으로 표시)을, 차선 4 뇌관 쌍을 # 2961를 사용하여 PCR 결과를 나타냅니다 와 # 5151 (5' - gtctcaaataggggccagctagcttgg - 3 ') 패널 A에서 녹색으로 표시 정상적인 결장 조직에서만 나타나는 고유 밴드는 노란색 화살표로 표시되며, 결장 암 조직에서만 나타나 그 밴드는 빨간색 화살표가 표시됩니다. ICR, 각인 통제 지역, DMR, 다른 methylated 지역.

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li>
<li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li>
<li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li>
<li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li>
<li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li>
<li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li>
<li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Berkum, N. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2%2FH19+and+Wsb1%2FNf1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%27C%27s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

데커 외가. 2 게놈 loci 1 사이의 상호 작용의 빈도를 감지하는 염색체 형태 캡처 (3C) 접근 방법을 개발하고, 3C는 포유 동물 세포이의 두 알려진 DNA 영역간에 내부 염색체 간 염색체 연관 관계를 조사하기 위해 광범위하게 사용되고 있습니다 -9. 새로 개발된 하이 - C 방법론은 게놈 전체 DNA 협회 연구를위한 적용할 수 있지만, ACT 분석은 여전히 로커스 특정 DNA 상호 작용 10-11의 연구를위한 효과적인 기술입니다. 우리는 교양 마우스와 인간의 세포 (그림 1)에서 알려진 DNA 영역과 관련된 알 수없는 DNA 영역을 식별하는 데이 방법을 수정했습니다. 그것이 우리에게 알려진 타겟 DNA 지역 12 연관 소설 알 수없는 DNA 파트너를 식별하는 신뢰성과 재현성 방법을 제공으로 우리는 관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석이 방법을 지명했다. 적절한 컨트롤과 함께 성공적인 3C 분석은 ACT 분석 13 소설 측면을 실행하기 전에 수행됩니다. 가능한 많은 관련 DNA 영역으로 tofind 위해서는 첫 번째와 두 번째 제한 효소의 다양한 조합을 사용해야합니다. 그것은 최초의 3C 내고 단계를 수행하는 CPG methylation을 구별 제한 효소를 사용하는 특히 중요합니다. 단백질 결합과 DNA의 methylation은 또한 제한 효소 소화 효율에 영향을 미칠 수 있으며 특정 제한 효소 digestions에 대한 관련 DNA 영역의 결합의 실패로 이어질 수 있습니다. 내부 또는 상호 염색체 결합의 발생은 단백질 DNA 상호 연결과 관련된 DNA 지역 모두의 적절한 물리적지도에 따라 달라집니다. 따라서, 일부 예비 실험 ACT 분석에 사용할 수있는 효과적인 포름 알데히드 농도 및 처리 시간을 설정하는 데 반드시 필요합니다. 포름 알데히드 (from1.5 % 2 %)의 최종 농도의 범위는 분석 7,9의 3C 부분 동안 여러 실험실에서 사용되었습니다. 또는, linkers으로 사용 oligonucleotides는 두 번째 제한 효소로 잘라 응집 끝에 일치하도록 설계할 수 있습니다. 우리가 PCR의 두 번째 라운드에서 PCR과 20-25 사이클의 첫 번째 라운드에서 18-20 순환 분명히 밴드를 제공할 수있는 것을 발견하지만, 각 실험 (그림 2)에 대한 최고의 PCR 조건을 확립하는 것이 필요합니다. 내부 분자 DNA의 가닥이 PCR에서 발생할 수의 5&#39; 엔드 및 3&#39; - 최종 보완 어댑터 시퀀스 사이의 어닐링, 그것은 DNA 분자와 어닐링 어댑터 특정 뇌관을 억제하고, 처음 몇주기에서 훨씬 낮은 증폭 효율의 결과. 대상 DNA가주기에 대한 증폭 이후, 그 금액이 특이 현상이 반응보다 훨씬 클 수 있으며, 프라이머가 대상 DNA 분자로 어닐링의 경쟁을 촉진 수도 있습니다. 우리가 배경 증폭을보고, 왜 첫 라운드 PCR 제품은 PCR의 두 번째 라운드에서 배경을 감소하기 위해 PCR 반응에서 초과 primers를 제거하는 것이 중요합니다 배경 amplification.It을 감소 희석되어야 할 이유가 이것도 있습니다. 모든 PCR 기반의 실험에서와 마찬가지로, 그것은 인간 및 마우스의 DNA의 대부분을 구성하고 반복 시퀀스 지역에 거주하지 primers를 설계하는 것이 매우 중요합니다. 새로 개발된 하이 - C 방법론은 게놈 전체 DNA 협회 연구를위한 적용할 수 있지만, ACT 분석은 여전히​​ 로커스 특정 DNA의 상호 작용 연구를위한 효과적인 기술입니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI1640 배지</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아마이드</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>ATP 용액, 10mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris pH8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>프로테이나제 K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>비스-아크릴아마이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>프로테이나제 억제제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alpha P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>PTC-100 써멀 사이클러</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

장거리 dna의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

DNA로 인코딩된 유전 정보는 복잡하고 고도의 규제 염색질 구조로 구성됩니다. 각각의 염색체는 개발 또는 세포주기의 단계에 따라 변경될 수 있습니다 특정 지역을 차지하고 있습니다. 유전자 발현은 전문 transcriptional 공장에서 발생할 수있는 염색질 세그먼트가 동일한 염색체에 멀리 떨어져 서로 다른 염색체 또는 존재할 수있는 DNA 세그먼트의 공동 현지에 이르는 다양한 염색체 지역에서 루프 밖으로 수 있습니다. 연결된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 염색체 형태 캡처 기술을 확장하고 수정하여 편견 방식으로 이러한 장거리 DNA 연결을 확인하는 효과적인 방법을 제공합니다. ACT의 분석은 우리가 트랜스의 transcriptional 규제의 메커니즘을 조사하는 것이 가능하게하고, 정상적인 생리학 및 질병 상태 동안 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 설명할 수 있습니다.

관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 장거리 DNA 상호 작용을 확인하는 소설 편견 방법입니다. 장거리 DNA 상호 작용의 특성은 우리가 정상적인 생리 모두와 질병 상태에서 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 확인할 수 있습니다.

장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

DNA에 의해 인코딩된 유전 정보는 복잡하고 고도로 조절되는 염색질 구조 내에 조직화되어 있습니다. 각 염색체는 특정 영역을 차지하며, ...

다음 실험의 전반적인 목적은 원거리에서 연관된 DNA 파트너를 발견하고 식별하는 것입니다. 이는 고정, 세포 용해 및 첫 번째 제한 효소에 의한 DNA 소화를 거친 후, 두 연관 유전자의 세그먼트로 구성된 키메라 DNA를 생성하기 위한 결합 단계를 통해 이루어집니다. 다음으로, 두 번째 제한 효소 소화 후 키메라 DNA에 링커를 추가합니다. 증폭을 용이하게 하기 위해, 링커 및 베이트 DNA 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행함으로써 연관된 DNA 단편을 충분한 양으로 확보합니다. 증폭된 DNA 단편의 서열 분석을 통해 베이트 DNA와 원거리에서 연관된 DNA 파트너를 보여주는 결과를 얻습니다.염색체 확인 캡처(chromosome confirmation capture) 또는 3C와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 A-C-T-S-A를 사용하여 알려지지 않은 장거리 연관 DNA 파트너를 효과적으로 식별할 수 있다는 점입니다. 반면 3C는 이전에 의심되었던 상호작용만을 확인하기 위해 고안되었습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 세포가 80~90% confluence 상태가 될 때까지 37 °C, 5% CO2가 공급되는 인큐베이터에서 인간 세포를 배양하십시오.본 시연에서는 인간 급성 전골수성 백혈병 세포를 사용합니다. 세포를 50 milliliter NOC 튜브에 붓고 1200 RPM에서 15분 동안 원심 분리하여 수집합니다. 원심 분리 후, 흡입법으로 배지를 제거합니다.세포 펠렛을 재현탁시키기 위해 5 mL의 배지를 추가합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 약 1×10⁷개의 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 40 mL 부피로 맞춥니다. 그런 다음 37% formaldehyde 1.7 mL를 첨가하여 희석된 크로마틴을 고정합니다.시료를 상온에서 부드럽게 흔들어주며 10분 동안 배양합니다. 배양 후, 2 M 글리신 2.4 milliliters를 넣어 반응을 정지시킵니다. 다음으로, 시료를 4 °C에서 1200 RPM으로 15분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거한 후, 40 milliliters의 얼음처럼 차가운 PBS로 펠렛을 한 번 세척하고 샘플을 원심분리하여 세척된 세포 펠렛을 회수합니다. 결과물인 펠렛을 신선하게 첨가된 프로테아제 억제제와 0.1 millimolar PMSF가 포함된 40 milliliters의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)에 재부유시키고, 냉장실에서 회전시키며 90분 동안 배양합니다. 마지막으로, 샘플을 2, 500 RPM에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하여 분리된 핵을 얻습니다. 분리된 핵을 0.5 milliliters의 1 XNEB buffer 3에 재부유시키고 15 microliters의 10% SDS를 첨가합니다.시료를 37 °C에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 그 다음 SDS를 격리하기 위해 20% Triton X 100 45 µL를 첨가하고 37 °C에서 다시 1시간 동안 흔들어주며 배양한 후 1 × 10⁶의 분주량을 취합니다. 제한 효소 절단을 위해 약 15 µg의 핵을 핵 용액 55 µL에 사용합니다.1X NEB buffer 3 433 µL와 BGL 2 12 µL를 첨가합니다. 총 소화 반응 부피를 50 µL로 맞춘 후, 37 °C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 다음 날 10% SDS 95 µL를 첨가하여 제한 효소를 불활성화하고, 65 °C에서 20분 동안 가열하여 효소를 변성시킵니다.항온수조에서 1x ligation buffer 7 mL와 20% Triton X 100 360 µL를 첨가합니다. 시료를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 온도를 16 °C로 낮춘 후, 400 units/µL의 용액 50 µL를 첨가합니다.T4 DNA Ligase를 첨가합니다. 결찰 반응물을 16 °C에서 4시간 동안, 그 후 실온에서 30분 동안 배양합니다. 결찰이 완료되면 300 µg의 proteinase K를 첨가하고 65 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.그 다음 5 µg의 RNAA를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 페놀-클로로포름 추출법으로 DNA를 정제하고, 이소프로판올로 DNA를 침전시킨 후 침전된 DNA를 150 µL의 멸균 증류수에 녹입니다. 키메라 DNA에 링커를 추가하려면, 먼저 2 µg의 정제된 DNA를 5 units의 MspI과 함께 37 °C에서 4~6시간 동안 배양하여 DNA를 절단합니다. 절단 후, 65 °C에서 10분 동안 MspI을 불활성화합니다.그 다음 5 mg/mL 글리코겐 1 µL를 사용하여 에탄올에서 DNA를 침전시킵니다. 생성된 DNA 펠릿을 멸균 증류수 50 µL에 녹입니다. 이어서 MSP1 처리된 DNA 50 µL에 20 µM 링커 올리고뉴클레오타이드 L 2 µL와 20 µM 올리고뉴클레오타이드 S 1 µL를 혼합한 후, 멸균 증류수 1 µL와 10X T4 DNA Ligase 버퍼 6 µL를 첨가합니다.혼합물을 액상 왁스로 덮습니다. 올리고뉴클레오타이드를 50 °C에서 1분 동안 변성시킨 후, 분당 0.5 °C의 기울기로 10 °C까지 서서히 냉각합니다. 써멀 사이클러를 사용하여 400 units/µL T4 DNA ligase 1 µL를 첨가하고, 반응물을 15 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, kaya quick PCR 정제 키트를 사용하여 링커가 결합된 DNA를 정제하고 50 µL의 멸균 증류수로 용출합니다. 장거리 상호작용을 조사할 DNA의 특정 영역에 맞는 프라이머를 선택합니다. 본 예시에서는 Abel을 프라이머 또는 베이트(bait)로 사용합니다.정제된 DNA 1 µL를 20 µM 농도의 able 1 특이적 프라이머 46 56 1 µL, 그리고 20 µM 농도의 링커 특이적 프라이머 29 63 1 µL와 혼합하여 1차 PCR용 정제 DNA를 준비합니다. 그다음, 서면 프로토콜에 따라 32 P-D-C-T-P가 미리 혼합된 3 x ClinTech DNA polymerase 1 칵테일 3 µL를 첨가하고, 멸균 증류수 3 µL를 추가합니다. PCR 사이클이 완료되면 서면 프로토콜에 기술된 hot start PCR 열 순환 조건을 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다.kaya quick PCR 정제 키트를 사용하여 1차 PCR 생성물을 정제하십시오. 30 µL의 멸균 증류수에 용출합니다. 100배 희석한 1차 PCR 생성물 1 µL를 사용하고, 20 µM의 able 1 특이적 프라이머 46 26 1 µL와 20 µM의 링커 특이적 프라이머 29 61 1 µL를 첨가하여 네스티드 프라이머(nested primers)를 이용한 2차 PCR을 수행하십시오.다시 3 µL의 3 x ClinTech, DNA polymerase, one cocktail과 3 µL의 멸균 증류수를 첨가합니다. 95 °C에서 20초, 67 °C에서 40초, 72 °C에서 1분 동안 25회 반복하는 열 주기 일정으로 2차 PCR을 수행한 후, 72 °C에서 5분 동안 신장 과정을 거칩니다.5% urea page 겔을 전기영동하여 PCR 산물을 시각화한 후, 노출된 스크린을 phospho imager로 스캔합니다. 각 PCR 밴드는 60 µL의 멸균 증류수가 담긴 einor 튜브에 겔 스트립을 넣고 95 °C에서 5분 동안 배양하여 겔을 녹임으로써 회수할 수 있습니다. 용해된 겔 산물을 10,000 RPM에서 10초 동안 짧게 원심분리합니다.모든 샘플을 수집하십시오. Prime repair를 사용하여 PCR을 수행하기 위한 DNA 템플릿으로 사용할 1 µL를 분취하십시오. 29 61 46 26.위에서 설명한 것과 동일한 조건을 사용하여, 정제 및 시퀀싱 후 온라인 도구를 이용해 염색체 위치를 결정하는 분석을 수행할 수 있습니다. 게놈 생물정보학 사이트에 접속하여 blatt를 클릭해 새 창을 띄운 다음 DNA 서열을 붙여넣으십시오. DNA 서열을 제출하면 BLATT 검색 결과가 나타납니다.100% 일치하는 검색 결과에서 브라우저를 클릭하여 DNA 서열의 위치를 확인합니다. able one 영역은 장거리 DNA 상호작용을 결정하기 위한 미끼(bait)로 사용되었습니다. 두 개의 BglII 사이트와 한 개의 BamHI 사이트가 3C(chromosome conformation capture) 분석을 위해 선택되었습니다. 2차 PCR 프라이머 세트로 able M1을 증폭하기 위해 46 26 29 61이 사용되었으며, able M2를 위해 46 30 29 61이, 그리고 able M3를 위해 46 36 29 61이 사용되었습니다.전형적인 젤 패턴은 able M1, able M2, able M3에서 보는 바와 같이 하나 또는 여러 개의 밴드를 나타냅니다. 클론 able M1의 DNA 서열을 통해 A CT 분석의 각 단편이 두 개의 결합된 DNA 세그먼트로 구성되어 있음을 알 수 있습니다. 한 세그먼트는 베이트(bait) DNA 영역에서 유래하며, 두 번째 세그먼트는 연관 파트너에서 유래합니다.세그먼트들은 첫 번째 제한 효소 인식 서열에 의해 서로 연결됩니다. 두 번째 효소 인식 서열은 연관 파트너 서열의 끝부분에 나타납니다. 클로닝된 M1 단편은 염색체 9q32.4에 위치한 ABLE one 영역의 DNA를 포함하며, 연관 파트너는 염색체 3p3에 위치하며 proc two로 확인되었습니다.마찬가지로, able M two 관련 파트너는 5번 염색체 Q 21.1에 위치한 것으로 나타났으며, clone able M three는 three C 분석과 대조적으로 ABLE one 로커스 근처의 염색체 내 연관으로 확인되었습니다. 이 비디오에서 설명하는 방법론은 가장 일반적인 장거리 상호작용을 선택합니다. 그러나 PCR 사이클 횟수를 늘리면 덜 빈번한 추가 연관성 또한 식별할 수 있으며, 생쥐 섬유아세포에서 IGF two H 19 로커스의 각인 및 제어 영역(ICR)을 미끼 DNA로 사용하여 A CT 분석의 1차 및 2차 PCR에 서로 다른 사이클 프로그램을 적용하였습니다.A CT 분석은 정상 세포와 암 세포 간의 핵 구조 및 원거리 상호작용의 차이를 식별하는 데에도 활용될 수 있습니다. 정상 결장 조직과 결장암 조직을 균질화한 후, 본 문서에 설명된 절차에 따라 A CT 분석을 수행하였습니다. 여기에서는 IGF2 H19 유전자 좌위의 ICR 영역과 IGF2 유전자 dpn의 DNA 구조를 보여줍니다.A CT 분석을 위한 두 곳의 부위에서, 2차 PCR에 사용된 표지 프라이머는 서로 다른 색상의 화살표와 숫자로 표시되어 있습니다. A CT 분석의 겔 패턴은 프라이머 29 61과 프라이머 쌍 41, 61, 41 63, 51 45 및 51 51을 사용하여 얻은 PCR 결과를 나타냅니다. 정상 결장 조직에서만 나타나는 고유한 밴드는 노란색 화살표로 표시되었으며, 개발 후 결장암 조직에서만 나타난 밴드는 빨간색 화살표로 표시되었습니다.이 기술은 시장 생물학 분야의 연구자들이 3차원 방식으로 핵 구조와 유전자 조절을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한...

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

대량 병렬 DNA 시퀀싱 기술을 기반으로 한 게놈 어셈블리는 대개 매우 단편화되어 있습니다. 물리적 염색체 지도의 개발은 게놈 어셈블리를 잠재적으로 개선할 수 있습니다. 본 연구에서는 물리적 지도 제작의 처리량을 크게 높일 수 있는 염색체 준비, 형광 in situ 하이브리드화 및 이미징에 대한 혁신적인 접근 방식을 제시합니다.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

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여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

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게놈 대상 분자의 직접적인 목표를 확인하는 것은 중요한 과제로 남아. DNA 결합 분자 게놈 참여 방법을 이해하기 위해, 우리는 염색질을 분리하는 작은 분자의 가교에 의존하는 방법 (COSMIC)을 개발.

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Chromatin 반복; 유전자 규칙에 있는 중요 한 역 그러나, chromatin 루프의 선택적이 고 가역 수정 허용 하는 아무 기술 발전 되었습니다. 여기 우리가 chromatin 루프 개편에 대 한 강력한 시스템 설명 loci를 대상으로 선택적으로 고 역에서 유전자 발현 조절에 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)을 사용 하 여.

CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

Hi-C 3.0은 포름알데히드 및 디숙신이미딜글루타레이트 가교결합제를 DpnII 및 DdeI 제한 효소의 칵테일과 결합하여 신호 대 잡음비와 염색질 상호 작용 감지의 분해능을 높이는 개선된 Hi-C 프로토콜입니다.

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

여기서는 RNA 관련 염색질-DNA 상호작용을 포착하여 RNA 관련 3차원 게놈 조직을 매핑하는 프로토콜을 제시합니다.

RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법

학습하세요 관련 염색체 트랩(ACT) 분석법을 이용하여 장거리 DNA 상호작용을 확인하는 방법을. 인류 전골수성 백혈병 세포를 모델로 사용하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구합니다.

장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

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