장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

다음 실험의 전반적인 목적은 원거리에서 연관된 DNA 파트너를 발견하고 식별하는 것입니다. 이는 고정, 세포 용해 및 첫 번째 제한 효소에 의한 DNA 소화를 거친 후, 두 연관 유전자의 세그먼트로 구성된 키메라 DNA를 생성하기 위한 결합 단계를 통해 이루어집니다. 다음으로, 두 번째 제한 효소 소화 후 키메라 DNA에 링커를 추가합니다. 증폭을 용이하게 하기 위해, 링커 및 베이트 DNA 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행함으로써 연관된 DNA 단편을 충분한 양으로 확보합니다. 증폭된 DNA 단편의 서열 분석을 통해 베이트 DNA와 원거리에서 연관된 DNA 파트너를 보여주는 결과를 얻습니다.

염색체 확인 캡처(chromosome confirmation capture) 또는 3C와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 A-C-T-S-A를 사용하여 알려지지 않은 장거리 연관 DNA 파트너를 효과적으로 식별할 수 있다는 점입니다. 반면 3C는 이전에 의심되었던 상호작용만을 확인하기 위해 고안되었습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 세포가 80~90% confluence 상태가 될 때까지 37 °C, 5% CO2가 공급되는 인큐베이터에서 인간 세포를 배양하십시오.

본 시연에서는 인간 급성 전골수성 백혈병 세포를 사용합니다. 세포를 50 milliliter NOC 튜브에 붓고 1200 RPM에서 15분 동안 원심 분리하여 수집합니다. 원심 분리 후, 흡입법으로 배지를 제거합니다.

세포 펠렛을 재현탁시키기 위해 5 mL의 배지를 추가합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 약 1×10⁷개의 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 40 mL 부피로 맞춥니다. 그런 다음 37% formaldehyde 1.7 mL를 첨가하여 희석된 크로마틴을 고정합니다.

시료를 상온에서 부드럽게 흔들어주며 10분 동안 배양합니다. 배양 후, 2 M 글리신 2.4 milliliters를 넣어 반응을 정지시킵니다. 다음으로, 시료를 4 °C에서 1200 RPM으로 15분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거한 후, 40 milliliters의 얼음처럼 차가운 PBS로 펠렛을 한 번 세척하고 샘플을 원심분리하여 세척된 세포 펠렛을 회수합니다. 결과물인 펠렛을 신선하게 첨가된 프로테아제 억제제와 0.1 millimolar PMSF가 포함된 40 milliliters의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)에 재부유시키고, 냉장실에서 회전시키며 90분 동안 배양합니다. 마지막으로, 샘플을 2, 500 RPM에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하여 분리된 핵을 얻습니다. 분리된 핵을 0.5 milliliters의 1 XNEB buffer 3에 재부유시키고 15 microliters의 10% SDS를 첨가합니다.

시료를 37 °C에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 그 다음 SDS를 격리하기 위해 20% Triton X 100 45 µL를 첨가하고 37 °C에서 다시 1시간 동안 흔들어주며 배양한 후 1 × 10⁶의 분주량을 취합니다. 제한 효소 절단을 위해 약 15 µg의 핵을 핵 용액 55 µL에 사용합니다.

1X NEB buffer 3 433 µL와 BGL 2 12 µL를 첨가합니다. 총 소화 반응 부피를 50 µL로 맞춘 후, 37 °C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 다음 날 10% SDS 95 µL를 첨가하여 제한 효소를 불활성화하고, 65 °C에서 20분 동안 가열하여 효소를 변성시킵니다.

항온수조에서 1x ligation buffer 7 mL와 20% Triton X 100 360 µL를 첨가합니다. 시료를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 온도를 16 °C로 낮춘 후, 400 units/µL의 용액 50 µL를 첨가합니다.

T4 DNA Ligase를 첨가합니다. 결찰 반응물을 16 °C에서 4시간 동안, 그 후 실온에서 30분 동안 배양합니다. 결찰이 완료되면 300 µg의 proteinase K를 첨가하고 65 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그 다음 5 µg의 RNAA를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 페놀-클로로포름 추출법으로 DNA를 정제하고, 이소프로판올로 DNA를 침전시킨 후 침전된 DNA를 150 µL의 멸균 증류수에 녹입니다. 키메라 DNA에 링커를 추가하려면, 먼저 2 µg의 정제된 DNA를 5 units의 MspI과 함께 37 °C에서 4~6시간 동안 배양하여 DNA를 절단합니다. 절단 후, 65 °C에서 10분 동안 MspI을 불활성화합니다.

그 다음 5 mg/mL 글리코겐 1 µL를 사용하여 에탄올에서 DNA를 침전시킵니다. 생성된 DNA 펠릿을 멸균 증류수 50 µL에 녹입니다. 이어서 MSP1 처리된 DNA 50 µL에 20 µM 링커 올리고뉴클레오타이드 L 2 µL와 20 µM 올리고뉴클레오타이드 S 1 µL를 혼합한 후, 멸균 증류수 1 µL와 10X T4 DNA Ligase 버퍼 6 µL를 첨가합니다.

혼합물을 액상 왁스로 덮습니다. 올리고뉴클레오타이드를 50 °C에서 1분 동안 변성시킨 후, 분당 0.5 °C의 기울기로 10 °C까지 서서히 냉각합니다. 써멀 사이클러를 사용하여 400 units/µL T4 DNA ligase 1 µL를 첨가하고, 반응물을 15 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, kaya quick PCR 정제 키트를 사용하여 링커가 결합된 DNA를 정제하고 50 µL의 멸균 증류수로 용출합니다. 장거리 상호작용을 조사할 DNA의 특정 영역에 맞는 프라이머를 선택합니다. 본 예시에서는 Abel을 프라이머 또는 베이트(bait)로 사용합니다.

정제된 DNA 1 µL를 20 µM 농도의 able 1 특이적 프라이머 46 56 1 µL, 그리고 20 µM 농도의 링커 특이적 프라이머 29 63 1 µL와 혼합하여 1차 PCR용 정제 DNA를 준비합니다. 그다음, 서면 프로토콜에 따라 32 P-D-C-T-P가 미리 혼합된 3 x ClinTech DNA polymerase 1 칵테일 3 µL를 첨가하고, 멸균 증류수 3 µL를 추가합니다. PCR 사이클이 완료되면 서면 프로토콜에 기술된 hot start PCR 열 순환 조건을 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다.

kaya quick PCR 정제 키트를 사용하여 1차 PCR 생성물을 정제하십시오. 30 µL의 멸균 증류수에 용출합니다. 100배 희석한 1차 PCR 생성물 1 µL를 사용하고, 20 µM의 able 1 특이적 프라이머 46 26 1 µL와 20 µM의 링커 특이적 프라이머 29 61 1 µL를 첨가하여 네스티드 프라이머(nested primers)를 이용한 2차 PCR을 수행하십시오.

다시 3 µL의 3 x ClinTech, DNA polymerase, one cocktail과 3 µL의 멸균 증류수를 첨가합니다. 95 °C에서 20초, 67 °C에서 40초, 72 °C에서 1분 동안 25회 반복하는 열 주기 일정으로 2차 PCR을 수행한 후, 72 °C에서 5분 동안 신장 과정을 거칩니다.

5% urea page 겔을 전기영동하여 PCR 산물을 시각화한 후, 노출된 스크린을 phospho imager로 스캔합니다. 각 PCR 밴드는 60 µL의 멸균 증류수가 담긴 einor 튜브에 겔 스트립을 넣고 95 °C에서 5분 동안 배양하여 겔을 녹임으로써 회수할 수 있습니다. 용해된 겔 산물을 10,000 RPM에서 10초 동안 짧게 원심분리합니다.

모든 샘플을 수집하십시오. Prime repair를 사용하여 PCR을 수행하기 위한 DNA 템플릿으로 사용할 1 µL를 분취하십시오. 29 61 46 26.

위에서 설명한 것과 동일한 조건을 사용하여, 정제 및 시퀀싱 후 온라인 도구를 이용해 염색체 위치를 결정하는 분석을 수행할 수 있습니다. 게놈 생물정보학 사이트에 접속하여 blatt를 클릭해 새 창을 띄운 다음 DNA 서열을 붙여넣으십시오. DNA 서열을 제출하면 BLATT 검색 결과가 나타납니다.

100% 일치하는 검색 결과에서 브라우저를 클릭하여 DNA 서열의 위치를 확인합니다. able one 영역은 장거리 DNA 상호작용을 결정하기 위한 미끼(bait)로 사용되었습니다. 두 개의 BglII 사이트와 한 개의 BamHI 사이트가 3C(chromosome conformation capture) 분석을 위해 선택되었습니다. 2차 PCR 프라이머 세트로 able M1을 증폭하기 위해 46 26 29 61이 사용되었으며, able M2를 위해 46 30 29 61이, 그리고 able M3를 위해 46 36 29 61이 사용되었습니다.

전형적인 젤 패턴은 able M1, able M2, able M3에서 보는 바와 같이 하나 또는 여러 개의 밴드를 나타냅니다. 클론 able M1의 DNA 서열을 통해 A CT 분석의 각 단편이 두 개의 결합된 DNA 세그먼트로 구성되어 있음을 알 수 있습니다. 한 세그먼트는 베이트(bait) DNA 영역에서 유래하며, 두 번째 세그먼트는 연관 파트너에서 유래합니다.

세그먼트들은 첫 번째 제한 효소 인식 서열에 의해 서로 연결됩니다. 두 번째 효소 인식 서열은 연관 파트너 서열의 끝부분에 나타납니다. 클로닝된 M1 단편은 염색체 9q32.4에 위치한 ABLE one 영역의 DNA를 포함하며, 연관 파트너는 염색체 3p3에 위치하며 proc two로 확인되었습니다.

마찬가지로, able M two 관련 파트너는 5번 염색체 Q 21.1에 위치한 것으로 나타났으며, clone able M three는 three C 분석과 대조적으로 ABLE one 로커스 근처의 염색체 내 연관으로 확인되었습니다. 이 비디오에서 설명하는 방법론은 가장 일반적인 장거리 상호작용을 선택합니다. 그러나 PCR 사이클 횟수를 늘리면 덜 빈번한 추가 연관성 또한 식별할 수 있으며, 생쥐 섬유아세포에서 IGF two H 19 로커스의 각인 및 제어 영역(ICR)을 미끼 DNA로 사용하여 A CT 분석의 1차 및 2차 PCR에 서로 다른 사이클 프로그램을 적용하였습니다.

A CT 분석은 정상 세포와 암 세포 간의 핵 구조 및 원거리 상호작용의 차이를 식별하는 데에도 활용될 수 있습니다. 정상 결장 조직과 결장암 조직을 균질화한 후, 본 문서에 설명된 절차에 따라 A CT 분석을 수행하였습니다. 여기에서는 IGF2 H19 유전자 좌위의 ICR 영역과 IGF2 유전자 dpn의 DNA 구조를 보여줍니다.

A CT 분석을 위한 두 곳의 부위에서, 2차 PCR에 사용된 표지 프라이머는 서로 다른 색상의 화살표와 숫자로 표시되어 있습니다. A CT 분석의 겔 패턴은 프라이머 29 61과 프라이머 쌍 41, 61, 41 63, 51 45 및 51 51을 사용하여 얻은 PCR 결과를 나타냅니다. 정상 결장 조직에서만 나타나는 고유한 밴드는 노란색 화살표로 표시되었으며, 개발 후 결장암 조직에서만 나타난 밴드는 빨간색 화살표로 표시되었습니다.

이 기술은 시장 생물학 분야의 연구자들이 3차원 방식으로 핵 구조와 유전자 조절을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.