이미징 C. 엘레간스 태아

본 프로토콜은 널리 보급된 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 활용하여 Norky DIC 광학계 또는 형광 이미징을 통해 초기 C. elegans 배아의 동적 이벤트를 이미징하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 먼저 C. elegans 배아를 해부하고 이미징을 위해 마운팅하는 방법부터 설명합니다. 이어서, 가장 세밀한 최적의 이미지를 얻기 위한 DIC Norky 광학계의 적절한 설정 방법을 살펴봅니다.

오픈 소스 소프트웨어와 병행하여 양질의 형광 이미지 데이터를 수집하기 위한 광시야 에피 형광 및 조명 보정 방법 또한 검토합니다. 우수한 현미경 기술을 통해 발달 중인 배아의 세포 역학을 시각화할 수 있습니다. 용어가 혼란스러울 수 있고 적절한 기술을 글로 설명하기 어렵기 때문에, D iic Optics를 올바르게 설정하는 방법에 대한 시각적 설명이 매우 중요합니다.

또한, 연구자는 형광 이미징을 수행할 때 빛 노출을 최소화하도록 주의해야 합니다. 광독성과 광퇴색을 제한하기 위해, 이미징용 배아를 준비하려면 먼저 두 가지 고정 용액을 만듭니다. 하나는 녹인 Vaseline이고, 다른 하나는 버퍼에 2~3% agarose를 섞은 용액입니다.

이미징하려는 구조물이 매우 취약한 경우, 끓지 않도록 주의하면서 더 고농도의 agarose를 만들 수 있습니다. 두 가지 스톡 용액 모두 전자레인지에서 녹인 후 4~5 mL씩 분주하여 보관합니다. 이미징 당일, Vaseline 용액 한 알리콧을 65~70 °C 히팅 블록에서 녹이고, agarose 용액 한 알리콧을 전자레인지에서 녹입니다.

마찬가지로, 끓지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 이러한 용액들이 용융 상태를 유지하도록 히트 블록에 보관하십시오. 다음으로, 두 개의 슬라이드 상단과 하단을 실험실용 테이프로 덮고, 테이프를 붙인 두 슬라이드 사이에 깨끗한 슬라이드를 배치하십시오.

이제 깨끗한 슬라이드 위에 녹은 aros를 몇 방울 떨어뜨리고 그 위에 다른 깨끗한 슬라이드로 덮습니다. Aros는 얇은 정사각형 패드 형태로 퍼지며 웜 패드가 준비됩니다. 해부 현미경과 백금 선 픽을 사용하여 성체 웜 두 마리를 18 by 18 millimeter 커버 슬립 위의 9 to 12 µL 버퍼 방울로 옮깁니다.

그런 다음 절단합니다. 바늘이나 메스를 사용하여 벌레를 절개하여 배아를 방출시키며, 이때 한천 쪽이 아래로 향하게 합니다. 벌레 패드를 18 by 18 millimeter 커버슬립 위에 배치하고, 돌출된 한천은 면도날로 제거합니다.

마지막으로, 커버슬립을 밀봉하기 위해 페인트 붓이나 이쑤시개를 사용하여 가장자리를 따라 녹인 바셀린 용액을 도포합니다. 이제 세포를 이미징할 준비가 되었습니다. 슬라이드를 현미경에 올릴 때, 두 편광판이 서로 수직으로 정렬되었는지 확인하십시오.

월러(waller)와 프리즘이 모두 광경로에서 벗어나 있는지 확인하십시오. 시야가 어둡지 않다면, 어두워질 때까지 콘덴서 아래의 편광판을 회전시키십시오. 10배 대물렌즈를 사용하여 배아를 찾으십시오.

촬영 시야 내에 여러 개의 배아를 확보하기 위해 벌레 몸체 근처에서 어린 배아 집단을 찾으십시오. 최상의 이미지를 얻으려면 벌레 내부에 있는 배아는 피하십시오. 최적의 배아 위치를 잡았다면, 더 높은 배율의 대물렌즈로 교체하십시오.

이제 필터 큐브를 DIC로 전환하십시오. 그다음, 상부 대물렌즈 월스톤 프리즘을 광로에 삽입하고 콘덴서의 터렛을 회전시켜 대물렌즈와 일치하는 하부 월스톤 프리즘을 선택하십시오. 프리즘이 배치되면, 이 터렛 아래의 슬라이더를 조절하여 렌즈의 수치구경에 맞춥니다.

최적의 쾰러 조명(Kohler illumination)을 얻으려면 콘덴서 다이아프램의 가장자리가 가장 선명하게 보일 때까지 콘덴서의 초점을 맞추십시오. 가장 선명하다는 것은 밝은 부분과 어두운 부분의 경계가 가장 뚜렷하거나 초점이 정확히 맞은 상태를 의미합니다. 최적의 대비를 얻으려면 슬라이더의 노브를 돌려 개구부 벽과 프리즘을 조정하십시오.

이제 현미경을 사용할 준비가 거의 완료되었습니다. 이제 micromanager 및 오픈 소스 소프트웨어를 통해 컴퓨터에서 추가적인 이미징 파라미터를 제어할 차례입니다. 먼저 카메라 gain을 0으로 설정하십시오.

그런 다음 파일 저장 설정을 16비트가 아닌 8비트 TIFF로 변경하십시오. TIFF 파일은 나중에 Image J와 같은 오픈 소스 소프트웨어로 분석할 수 있습니다. 다음으로, 가장 밝은 픽셀이 포화 수준 바로 아래에 오도록 광량을 조절하십시오. 모든 과정이 올바르게 수행되었다면, 빛이 비스듬히 들어오는 것처럼 보여 이미지가 3D처럼 보일 것입니다.

이미지가 선명하게 보이면, 촬영하고자 하는 배아를 선택하고 관심 영역(region of interest)을 지정합니다. 현미경에 포커스 모터가 있는 경우, 이를 사용하여 각 시간대별로 여러 초점 평면을 수집하십시오. 다차원 획득 창을 열고, 포커스 노브를 조정하여 난황 과립이 초점에 들어오는 첫 번째와 마지막 초점 평면을 찾아 Z 스택의 상단 및 하단 평면을 설정합니다.

단계 크기를 설정하십시오. 이는 수집할 초점 평면의 수를 결정합니다. 이제 모든 초점 평면을 획득할 수 있을 만큼 충분히 긴 시간 간격을 설정하십시오.

최대 시간 지점을 매우 높게 설정하면 수동으로 중지할 때까지 소프트웨어가 이미지를 캡처합니다. 프로세스를 모니터링할 수 있도록 소프트웨어에서 마지막으로 획득한 이미지만 표시하도록 설정하십시오. 이제 이미지 파일 이름을 지정하고 이미지 획득을 시작하십시오.

이미지 분석은 다음 섹션의 끝부분에서 간략하게 검토하겠습니다. GFP 동영상을 제작하는 과정은 4D 또는 Musky DIC를 제작하는 것과 매우 유사하지만, 형광 셔터의 소프트웨어 제어가 포함된 구성 파일을 사용합니다. 배아의 위치를 잡은 후, 상단 월스톤 프리즘이 광로에 있지 않은지 확인하고 필터 큐브를 F-I-T-C-G-F-P로 전환하십시오.

소프트웨어를 사용하여 시작 시 자동으로 설정되지 않은 경우, 카메라 게인이 255로 설정되었는지 확인하십시오. 이미지 파일은 16비트 tiff 형식으로 설정됩니다. 이제 투과광원을 끄고 라이브 이미징(live imaging)을 클릭하십시오.

형광 신호의 신호 대 잡음비(signal to noise ratio)를 적절하게 확보할 수 있도록 UV 광원의 강도와 노출 시간을 조정하되, 세포를 보호하기 위해 광 노출은 최소한으로 유지하십시오. 다음으로, 시간 간격을 설정하십시오. 시간 지점(time points)의 수와 초점 평면(focal planes)의 수를 설정한 후, 앞서 설명한 대로 이미지 획득을 진행합니다.

영상을 분석하려면 오픈 소스 소프트웨어를 사용하십시오. Micromanager 플러그인이 설치된 Image J를 사용합니다. 매우 큰 용량의 영상은 loci 플러그인을 사용하여 Image J로 가져올 수 있습니다. 이것은 nor masky와 DIC 광학계로 촬영한 야생형 배아입니다.

후방은 오른쪽 하단이며 복측은 왼쪽 하단입니다. 영상은 15초마다 수집한 단일 초점 평면 이미지의 시퀀스를 보여줍니다. 재생 속도는 초당 14프레임으로 설정되었습니다.

이 배아는 첫 번째 배아 분열 동안 형광을 발하며, 여기서 후측은 오른쪽 상단입니다. 이 영상은 10초 간격으로 단일 초점 평면의 변화를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 동적인 사건들을 연구하기 위해 DIC Naski 광학계와 에피 형광(epi fluorescence)을 모두 사용하여 살아있는 배아를 이미지징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

최적의 이미지를 얻기 위한 DIC Nomar 광학계 설정 방법을 더 잘 이해하셨기를 바라며, 항상 더 고급 현미경에 의존하지 않고도 epi 형광 조명을 사용하여 고품질의 형광 데이터를 얻을 수 있음을 인지하셨기를 바랍니다. 또한 이러한 이미징 기법을 특정 유전자 기능이 결핍된 배아를 관찰하는 데 적용하여, 세포 분열이나 발생 과정 중 관심 있는 현상에 필요한 유전적 요구 사항을 더욱 자세히 조사할 수 있습니다.