March 24th, 2011
C. 엘레간스 배아는 세포 생물학과 발전을 연구위한 강력한 시스템입니다. 우리는 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시 C. 엘레간스 쉽게 사용할 수 epifluorescent 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용 DIC 광학 또는 형광을 이용하여 배아.
이 프로토콜은 널리 사용 가능한 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 Norky DIC 광학 또는 형광을 사용하여 초기 CL egan의 배아에서 동적 이벤트를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 CL gans 배아를 해부하고 이미징을 위해 장착하는 방법을 설명하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 DIC 또는 마스킹 광학 장치의 적절한 설정을 검토하여 최고의 디테일에서 최적의 이미지를 보장합니다.
광시야 epi 형광등 및 조명의 보정은 오픈 소스 소프트웨어와 협력하여 우수한 형광 이미지 데이터를 수집하기 위해 검토됩니다. 좋은 현미경 검사는 발달 중인 배아의 세포 역학을 시각화할 수 있습니다. 용어가 혼란스러울 수 있고 적절한 기술을 서면 형식으로 설명하기 어렵기 때문에 D iic Optics를 올바르게 설정하는 것이 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 그림이 중요합니다.
또한 연구원은 형광 이미징을 수행할 때 빛 노출을 최소화하도록 주의해야 합니다. 광독성 및 광표백을 제한하기 위해 이미징을 위해 배아를 준비하려면 먼저 두 가지 장착 솔루션을 만듭니다. 하나는 녹은 바셀린이고 다른 하나는 완충액에 2-3%aros입니다.
더 밀도가 높은 aros는 이미지화 할 구조가 매우 취약한 경우 끓는 것을 피하도록주의하면서 만들 수 있습니다. 두 원액 모두 전자레인지에서 녹인 다음 4-5밀리리터 분취액으로 보관됩니다. 이미징 당일, 섭씨 65-70도의 열 블록에서 바셀린 용액의 분취액을 녹이고 마이크로파에서 발생 용액의 분취액 하나를 녹입니다.
다시 말하지만, 끓이는 것을 피하십시오. 그런 다음 이러한 용액을 용융된 상태로 유지하려면 열 블록에 보관하십시오. 다음으로, 두 슬라이드의 상단과 하단을 실험실 테이프 스트립으로 덮고 테이프로 감긴 두 슬라이드 사이에 깨끗한 슬라이드를 배치합니다.
이제 용융된 아로스 몇 방울을 깨끗한 슬라이드에 파이프로 연결하고 다른 깨끗한 슬라이드로 덮습니다. 아로스는 웜 패드가 준비된 얇은 사각형 패드로 퍼집니다. 해부 내시경과 백금 와이어 픽을 사용하여 두 마리의 성충을 18 x 18mm 커버 슬립에 있는 9-12마이크로리터 버퍼로 옮깁니다.
그런 다음 자릅니다. 바늘이나 메스로 벌레를 열어 한천 면이 아래로 향하게 하여 배아를 풀어줍니다. 웜 패드를 18 x 18mm 덮개에 놓고 돌출된 한천을 밀어내고 면도질로 제거합니다.
마지막으로, 커버 슬립을 밀봉하려면 페인트 브러시나 이쑤시개로 용융된 바셀린 용액을 둘레를 따라 바르십시오. 이제 세포를 이미징할 준비가 되었습니다. 슬라이드를 현미경에 놓을 때 두 개의 편광판이 서로 수직으로 정렬되어 있는지 확인하십시오.
벽면과 프리즘이 모두 빛의 경로를 벗어났는지 확인하십시오. 자기장이 어둡지 않으면 지금이 될 때까지 콘덴서 아래의 편광판을 회전합니다. 10배 목표를 사용하여 배아를 찾습니다.
이미징 필드 내에서 여러 배아를 얻기 위해 어린 배아 그룹이 있는지 벌레 몸체 근처를 살펴보십시오. 최상의 이미지를 위해 벌레 내부의 배아를 피하십시오. 최상의 배아를 찾으면 더 높은 전력의 목표로 전환합니다.
이제 필터 큐브를 DIC로 전환합니다. 다음으로, 상부 대물렌즈 월스톤 프리즘을 광 경로에 삽입하고 콘덴서의 타르트를 회전시켜 대물렌즈와 일치하는 하부 월스톤 프리즘을 선택합니다. 프리즘이 있는 상태에서 이 포탑 아래의 슬라이더를 렌즈의 개구수와 일치하도록 조정합니다.
최적의 Kohler 조명을 얻으려면 콘덴서 다이어프램의 가장자리가 가장 선명하게 나타날 때까지 콘덴서의 초점을 맞추십시오. 가장 선명하게는 밝은 검은색 사이의 경계가 가장 선명하거나 초점이 맞춰질 때입니다. 최적의 대비를 얻으려면 슬라이더의 손잡이를 돌려 사과 벽과 프리즘을 조정하십시오.
이제 현미경을 사용할 준비가 거의 완료되었습니다. 이제 마이크로 매니저와 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에서 추가 이미징 매개변수를 제어할 때입니다. 먼저 카메라 게인을 0으로 설정합니다.
그런 다음 파일을 16비트 tiff가 아닌 8비트로 저장하도록 전환합니다. TIFF 파일은 나중에 Image J.Next와 같은 오픈 소스 소프트웨어로 분석할 수 있습니다.다음으로 가장 밝은 픽셀이 채도 수준 바로 아래에 있는 위치로 조명 수준을 조정합니다. 모든 것이 올바르게 수행되면 빛이 비스듬히 비추는 것처럼 보이는 이미지가 3D로 보입니다.
이제 이미지가 선명하게 보이므로 이미지화하려는 배아를 선택하고 관심 영역을 그립니다. 현미경에 초점 모터가 있는 경우 이를 사용하여 매번 여러 초점면을 수집합니다. 다차원 획득 창을 가리키고 초점 노브를 조정하여 Z 스택 상단 및 하단 평면을 설정하여 일부 요크 과립에 초점이 맞춰진 첫 번째 및 마지막 초점면을 찾습니다.
단계 크기를 설정합니다. 이것은 수집된 초점면의 수를 정의합니다. 이제 모든 초점면을 획득할 수 있을 만큼 긴 시간 간격을 설정합니다.
최대 시점은 소프트웨어가 수동으로 중지될 때까지 이미지를 촬영하도록 매우 높게 설정할 수 있습니다. 프로세스를 모니터링할 수 있도록 마지막으로 획득한 이미지만 표시하도록 소프트웨어를 설정합니다. 이제 이미지에 파일 이름을 지정하고 이미지 획득을 시작합니다.
이미지 분석은 다음 섹션의 끝에서 간략하게 검토됩니다. GFP 영화를 구성하는 것은 4개의 D도 아닌 사향 DIC를 만드는 것과 매우 비슷하지만 형광 산산조각의 소프트웨어 제어를 포함하는 구성 파일이 사용됩니다. 대신, 배아가 있는 상태에서 상부 월스톤 프리즘이 광 경로 상에 있지 않은지 확인하고 필터 큐브를 F-I-T-C-G-F-P로 전환합니다.
소프트웨어를 사용하여 시작할 때 자동으로 설정되지 않은 경우 카메라 게인이 255로 설정되어 있는지 확인하십시오. 이미지 파일이 16비트 tiff 형식으로 설정되어 있습니다. 이제 투과된 광원을 끄고 라이브 이미징을 클릭합니다.
형광 신호에 대해 우수한 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 UV 광원의 강도와 노출 시간을 조정하되 세포를 보존하기 위해 광 노출을 최소한으로 유지하십시오. 다음으로 시간 간격을 설정합니다. 시점의 수와 초점면의 수는 이제 앞에서 설명한 대로 이미지 획득을 진행합니다.
영화를 분석하려면 오픈 소스 소프트웨어를 사용하십시오. 마이크로매니저 플러그인이 설치된 이미지 J: 매우 큰 영화도 loci 플러그인을 사용하여 이미지 J로 가져올 수 있습니다. 이것은 마스킹되지 않은 DIC 광학 장치로 포착된 야생형 배아입니다.
후방은 오른쪽 아래에 있고 복부는 왼쪽 아래에 있습니다. 영화는 15초마다 수집되는 단일 초점면 이미지의 시퀀스를 보여줍니다. 재생은 초당 14프레임으로 설정됩니다.
이 배아는 첫 번째 배아 분열 동안 형광을 표현하며, 여기서 뒤쪽은 오른쪽 상단에 있습니다. 이 동영상은 10초마다 단일 초점면의 변화를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 DIC Naski 광학 장치와 epi 형광을 모두 사용하여 동적 이벤트를 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
최적의 이미지를 얻기 위해 DIC Nomar 광학 장치를 설정하는 방법을 더 잘 이해하고, 에피 형광 조명을 사용하여 고품질 형광 데이터를 얻을 수 있으며 항상 고급 현미경에 의존하지 않는다는 점을 깨닫기를 바랍니다. 또한 이러한 이미징 기술을 적용하여 특정 유전자 기능이 결핍된 배아를 검사하여 세포 분열 또는 발달 중 가장 좋아하는 이벤트에 대한 유전적 요구 사항을 추가로 조사할 수 있습니다.
이 프로토콜은 DIC 광학 또는 형광을 사용하여 C. elegans 배아의 생체 이미징을 시연합니다. 배아 준비 및 이미징 기술 최적화를 위한 상세한 단계를 제공합니다.
Live imaging of C. elegans embryos enables mechanistic de-risking of cellular processes such as chromosome assembly and cytokinesis, providing predictive confidence in target validation for early discovery programs. The protocol leverages accessible microscopy and open-source software to support scalable, reproducible phenotypic screening in a disease-relevant system with known lineage and genetic tractability.
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic screening prior to lead optimization stages.