Name: 이미징 C. 엘레간스 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 C. elegans 태아의 실시간 이미징 방법을 DIC 광학 및 형광 현미경을 활용하여. 오픈 소스 소프트웨어로 세포 역학을 관찰하고 발달 생물학 연구에 필수적인 고품질 영상 데이터를 획득하세요.

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웜 준비 <ol><li> 이전 이미지 22 적절한 접시 18 24으로 L4 애벌레 벌레를 전송합니다. 이것은 초기 배아의 충분한 공급 달걀 베어링 성인을 보장합니다. </li><li> 바셀린하고, 아가로 오스의 튜브를 준비합니다. 우리는 전자 레인지에서 비커에 바셀린을 용해하고 관 당 4-5 ML의 나누어지는으로 분배하여 여러 15mL 팰컨 튜브를 준비합니다. 마찬가지로 2-3% (W / V) 버퍼의 아가로 오스 (M9 또는 달걀 버퍼)와 팔콘 튜브로 나누어지는 4-5 ML을 용해. 증발을 최소화하기 위해 초과로 끓여야하지 않도록주의하십시오. 영상의 날, 65-70 ° C 열 블록에 바셀린 1 튜브를 녹으 전자렌지에 아가로 오스 1 튜브를 녹여 다시 끓어 최소화하기 위해주의하십시오. 용융 상태에 바셀린하고, 아가로 오스를 유지하는 열 블록에 튜브를 저장합니다. </li><li> 아가로 오스 패드를 확인합니다. 각 가이​​드 슬라이드의 상단과 하단을 준수 일반적인 실험실 테이프의 단일 층으로 덮여 슬라이드 2 개의 가이드 슬라이드 사이에 새로운 현미경 슬라이드를 놓습니다. 새 슬라이드에 녹아 아가로 오스로부터 2-3 방울을 배치 부러 엔드와 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 원본 슬라이드 2 차 슬라이드 직각와 커버, 그것이 포함하고 얇은 사각형 패드를 만들 수있는 아가로 오스를 확산하는 데 도움이되도록. 2 차 슬라이드 가이드 슬라이드에 테이프 위에 나머지해야합니다. 아가로 오스 농도가 두꺼운 패드 5 %의 증가 수 있습니다. </li><li> 해부 범위와 백금 와이어를 사용하면 18mm X 18mm의 coverslip에 M9이나 에그 버퍼의 9 - 12μL 드롭, 전송이 성인 웜 "을 선택하십시오." </li><li> 바늘 (우리가 27G1 / 2 바늘을 사용) 또는 배아를 공개 메스와 오픈 웜 컷. 웜 중간에 잘라보십시오. </li><li> 배아를 포함하는 18x18 mm의 coverslip에 아가로 오스 패드 (아래 한천 사이드)를 낮춥니다. 트림 한천​​은 면도날로 커버 슬립의 가장자리에서 확장됩니다. </li><li> coverslip 넷 모두의 가장자리에 녹아 바셀린을 적용하기 위해 페인트 또는 얇은 나무 스틱을 이용하여 인감 Coverslip. </li></ol> (알 껍질이 제대로 형성되지 않는 경우 IE) 배아는 압력에 민감한있다면 달려있어 한천 마운트에 대안은 23 방울. 이미징는 수정이나 감수 분열과 같은 초기 이벤트를 따라 utero에서 수행할 수 있습니다. 웜는 Levamisole 24 anesthetized해야합니다. 개발의 특정 단계에서 배아의 수를 증가하기 위해서는 몇 가지 벌레 한 시간과 부드럽게 피펫 미세 팁 또는 속눈썹 브러쉬를 사용하여 함께 위치 배아 또는 입 pipetting에 의해 해부 수 있습니다. 4D Nomarski DIC (차등 간섭 대비) 영화 <ol start="8"><li> 올림푸스 BX61 현미경을 켜십시오. 카메라가 다른 기기에 의해 방출 EM 파도에 민감하기 때문에 그것은 마지막으로, 수은 전구 (GFP 또는 형광 필요한 경우) 첫째 설정되어 있습니다. 모든가되면 마이크로 관리자를 시작합니다. DIC 또는 형광 이미징에 해당하는 구성 파일을 선택합니다. 주요 차이점은 DIC 파일 형광 셔터 제어를 포함하지 않는다는 것입니다. 각 파일은 해당 필터 큐브 및 카메라 이득 설정을 선택합니다. </li><li> 10X 목표를 사용하여 현미경에서 배아를 찾습니다. 이미징 분야 내에서 여러 배아를 얻기 위해서 젊은 배아의 그룹에 대한 웜기구 근처보세요. 최고의 이미지에 대한 웜 내부 배아를 사용하지 마십시오. </li><li> 목적은 이미징을 위해 (1.4 NA 0.9) 높은 배율 (100x로 40x)와 해상도로 소프트웨어 스위치를 사용합니다. </li><li> ; Nomarski DIC 광학을 (다음 웹 사이트가 도움이 DIC 광학의 설명과 용어를 포함하는 조정 <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> 우리 올림푸스 BX61에있는 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다 <ol><li> 편광판 - 콘덴서 아래의 슬라이더 </li><li> 콘덴서 월라스튼 프리즘 - 터렛 콘덴서에 그냥 무대 아래. </li><li> 대상 월라스튼 프리즘 - 필터 큐브 아래의 슬라이더 </li><li> 2 차 편광판 (분석기) - DIC 위치에 필터 큐브 </li></ol></li><li> 빛의 경로 (소프트웨어 시작이해야)의 분석 (2 차 편광자)를 위치 DIC에 필터 큐브를 전환합니다. </li><li> 두 polarizers가 제대로 (교차) 정렬되었는지 확인합니다. 두 월라스튼 프리즘은 빛을 경로 밖에있는 경우보기의 필드는 어둠해야합니다. 필요한 경우이 정확한지 때까지 콘덴서 아래의 편광을 회전. </li><li> 빛의 경로에 목표 (어퍼) 월라스튼 프리즘을 삽입합니다. </li><li> 당신이 사용하고있는 목표를 일치 월라스튼 프리즘을 선택 콘덴서에 포탑을 회전합니다. </li><li> 렌즈의 NA와 일치하도록이 포탑 아래의 슬라이더를 조정하십시오. </li><li> 최적의 쾰러 조명을위한 콘덴서를 집중. </li><li> 상단 월라스튼 PRI를 조정SM이 슬라이더에있는 손잡이를 회전하여 최적의 콘트라스트를 얻을 수 있습니다. </li><li> 소프트웨어 시작에 의해 제어되는 다른 설정은 카메라의 이득 (0으로 설정)와 8 비트 아니라 16 비트 TIFF 파일로서 저장 파일에 스위치를 포함합니다. </li></ol></li><li> 좋은 이미지를주는 빛의 레벨을 조정합니다. (보통 4.7 볼트를 사용하는 () 소프트웨어를 통해 제어). 우리는 가장 밝은 픽셀 그냥 포화 수준 이하 있도록 예제를 조명하는 것을 선호합니다. 배아의 노른자의 과립이 명확하게 눈에 띄는 3 차원 얼굴로 이미지에 좋은 DIC 광학 결과입니다. 예제를 조명 빛이 시료의 한쪽 (또는 표본의 기능)이 밝은 조명과 반대편은 그림자에 있으며 어두운 표시되도록 각도에서 빛나는하는 것으로 판단되는 경우 등 또는이 설명하실 수 있습니다. </li><li> 이 이미지에 원하는 배아를 포함하는이자 (ROI)의 지역을 선택하고, 창문을 줄이기 위해 투자 수익 (ROI) 버튼을 설정을 누릅니다. </li><li> 다차원 수집 창을 엽니다. Z - 스택 (조각)과 시간 포인트를 선택합니다. </li><li> 배아의 하단 (초점의 일부 노른자의 과립 지난 초점 비행기)를 찾기 위해 현미경의 초점 노브를 사용하십시오. 선택 아래를 클릭하십시오. 배아의 정상을 확인하고 설정하는 반복합니다. 우리는 일반적으로 하나 마이크론 단계 크기를 사용하고 ~ 20 초점 비행기와 끝. 배아 및 세포가 상대적으로 두께가 있기 때문에 우리는 일반적으로 각각의 시점에서 여러 개의 초점 비행기를 수집합니다. 또한 세포가 서로 다른 방향으로 나누어 시작 특히 그들은 원래 초점 비행기 그들을 또는 밖으로 이동 배아에서 주변의 다른 세포를 치환 수 있습니다. 당신의 현미경이 초점 모터가없는 경우에는 수동으로 관심있는 셀 또는 프로세스를 따르도록 초점을 조정할 수 있습니다. </li><li> 시간 지점과 시간 간격의 입력 번호가 필요합니다. 우리는 일반적으로 15초 간격을 사용하여 500 시간 포인트의 최대를 설정합니다. 원하는 때 우리가 인수를 필요로하고 중단 없을 정도로 우리는 더 많은 시간을 포인트로 시작합니다. 당신은 이미지 여러 초점 비행기있다면, 시간이 지점 사이의 간격에 초점 비행기의를 얻기위한 시간이 충분한지 확인하십시오. </li><li> 데이터를 저장할 위치를 선택하거나 만듭니다. 소프트웨어에만 마지막으로 이미지를 표시하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 파일 이름을주고 취득을 클릭합니다. 제대로 작동하기 위해 처음 몇 시간 지점에 대한 자동 이미지 수집을 모니터링합니다. </li><li> 이 인수를 중지하려는 경우 중지를 클릭, 10X 목표로 전환하여 다음 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 완료되면 영상이 빛을 경로에서 DIC 구성 요소를 제거합니다. 객관적 필요한 경우 해제 깨끗한 기름. 카메라와 함께 시작을 모두 켭니다. </li></ol> GFP 영화 <ol start="20"><li> 현미경을 시작하고 위의 배아를 찾으십시오. 형광 셔터의 소프트웨어 제어를 포함 구성 파일을 사용합니다. </li><li> 상단 DIC 프리즘 (슬라이더가) 빛 경로에 있지 않은지 확인합니다. </li><li> FITC / GFP에 필터 큐브를 (자동으로 시작시 설정) 스위치 </li><li> 16 비트 TIFF (자동으로이 구성 파일과 함께 시작에서 설정)에 255 카메라 게인 및 이미지 파일을 변경합니다. </li><li> 하얀 빛을 끄십시오. </li><li> 미리보기 이미지 영상 라이브 클릭하십시오. 빛의 노출을 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. 또는 단일 이미지를 수집하는 스냅 이미지를 사용합니다. </li><li> 수은 전구 전원 / 중성 농도 필터, 좋은 이미지를 얻을 노출 길이를 조정합니다. 일반적으로, 당신은 형광 신호의 셀을 클릭하고 photobleaching에 photodamage을 줄이기 위해 원하는 데이터를 얻기위한 샘플을 도달 최소 조명을 사용해야합니다. </li><li> 시간 간격, 시간 포인트의 번호와 초점 비행기의 개수를 설정합니다. 우리는 종종 50~10초 간격과 1-3 초점 비행기를 사용합니다. </li><li> 투자 수익 (ROI)을 선택하고 이전 단계 13-19에 설명된대로 이미지 수집을위한 매개 변수를 설정합니다. </li></ol> 분석 영화 <ol start="29"><li> 데이터는 사용자가 입력한 이름으로 폴더와 4D 스택의 각 이미지를 TIFF 파일의 일련의 텍스트 파일과 노출 수준 및 시간 간격과 같은 XML 파일이 포함된 메타 데이터를 포함에 저장됩니다. </li><li> TIFF 이미지는 두 가지 방법을 통해 ImageJ으로 열 수 있습니다. (방법) 첫 번째는 가장 간단한이며, 또한 각 파일의 메타 데이터를 읽습니다. (방법 B) 두 번째 ImageJ에 할당된 메모리의 양을보다 큰 파일을 열려면 가상 메모리를 사용할 수 있지만, 그것은 메타 데이터를 포함하지 않습니다. <ol class="lalpha"><li> 마이크로 관리자 플러그인을 사용하여 <ol><li> 마이크로 관리자에 구축하고 사용 ImageJ를 (이것은 당신이 이전에 설치된 수도 있습니다 그 밖의 다른 버전과 다를 수 있습니다 ImageJ의 새 버전을 설치) 및 데이터를 열 수있는 플러그인을 포함하고 있습니다. 또는 당신은 ImageJ의 다른 버전에 대한 플러그인 폴더로 Micro-Manager-1.3/plugins 폴더의 내용을 복사할 수 있습니다. </li><li> , 플러그인 메뉴로 이동 마이크로 관리자를 선택한 다음 열기를 마이크로 관리자 파일입니다. </li><li> 당신이 확인하고 확인을 클릭하여 원하는 데이터를 포함하는 폴더를 선택합니다. </li><li> Z와 T 치수를 통해 재생할 수 있습니다. </li></ol></li><li> LOCI plugi를 사용하여BioFormats 가져오기와 함께 영화를 엽니다 N. <ol><li> TIFF 파일이 들어있는 폴더에서 XML과 TXT 파일을 전송하고, 데이터 집합의 이름과 일치하는 두 파일의 이름을 바꿉니다. </li><li> ImageJ 내에서, 데이터 브라우저 또는 바이오 형식 수입 중 다음 플러그인으로 이동 풀다운 메뉴를, LOCI을 선택합니다. </li><li> 귀하의 티파니 스택이있는 폴더를 찾습니다. 첫 번째 TIFF 파일을 클릭한 다음 엽니다. </li><li> Hyperstack와 스택을 볼 수 있습니다. 데이터 집합 조직에서 유사 이름, 스왑 크기와 그룹 파일을 선택하고 모든 시리즈를 엽니다. 메모리 관리에서 선택 (특히 대용량 데이터 집합에 대한) 가상 스택을 사용합니다. 확인을 클릭합니다 </li><li> 플러그인 설정 데이터의 크기를 (# 시간 지점과 초점 비행기의) 확인하고 &lt;&gt; 괄호 집합 사이의 범위를 표시합니다. 확인을 클릭하거나 시간 지점 및 / 또는 열 초점 비행기의 수를 변경할 수 있습니다. </li><li> 치수는 각 시리즈에 해당하는 확인합니다. </li><li> Z와 T 치수를 통해 재생할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> Nomarski DIC 영화에서 그림 1. 스틸스 일찍 C. 동안 정상적인 세포 이벤트를 설명하는 엘레간스의 배아 개발 : pronuclear 마이 그 레이션 (0-5:45), 비대칭 1 부 (6시 45분부터 14시 45분까지)와 비동기 2 부 (14:45-27:00). 데이터는 60x 1.35 NA 렌즈로 수집했다. 하나 마이크론 간격 20 초점 비행기는 40 μs 노출과 함께 15 초마다를 수집했다. 그 뒷부분의 오른쪽 복부 아래입니다하므로 이미지 회전했다. 스케일 바는 10 미크론을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. metaphase에서 초기 anaphase (A C)를 anaphase에서 스핀들 midzone에 게재되기 전에까지하는 염색체에 존재하는 염색체 여객 복합 GFP - 라벨 subunit (AIR - 2)의 역동적인 움직임을 설명하는 형광 영화에서 스틸 cytokinesis 완료 (F로 C). 데이터는 60x 1.35 NA 렌즈로 수집했다. 하나의 초점 평면은 50 μsec 노출 10 초마다를 수집했다. 그 뒷부분이 오른쪽으로되도록 이미지 회전했다. 스케일 바는 10 미크론을 나타냅니다. 와일드 타입 배의 영화 한 Nomarski 영화. 그림 1에 해당하는 영화. 뒷부분이 오른쪽 복부 아래로 것은 왼쪽 하단입니다. 설정 원본 데이터의 단일 초점 비행기를 표시합니다. 이미지가 매 15 초 수집되어 재생이 다시 초당 14 프레임으로 설정 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> GFP를 표현 야생 형 배아의 영화 두 형광등 영화 : AIR - 2. 그림 2에 해당하는 영화. 뒷부분은 오른쪽 상단에 있습니다. 영화는 하나의 초점 비행기로 수집했다. 이미지가 매 10 초 수집되어 재생이 다시 초당 14 프레임으로 설정 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

라이브 시간 저속 영상을위한 주요 고려 사항은 세포와 유기체의 무결성과 생존을 보존하는 것입니다. DIC 현미경은 시료가 조명 소스에서 자외선 및 과도한 가열에 노출되지이라는 이점을 제공합니다. DIC 현미경은 세포를 마이 그 레이션과 같은 cytokinesis 같은 세포 모양의 변화를 감지하고 같은 mitotic 스핀들과 핵 막 같은 subcellular 구조를 식별하는 데 적합합니다. 기자 단백질의 형광 이미징 추가 subcellular 구획을 식별하고 특정 단백질의 시각화를함으로써 DIC 현미경을 보완합니다. phototoxicity 및 형광 이미징 동안 배아 손상의 위험을 완화하기 위해, 우리는 보통 감소 UV 조명 강도 및 조명 기간을 상쇄하기 위해 카메라의 디지털 게인을 향상시킬 수 있습니다. 희미한 형광 유전자 변형 기자 들면, deconvolution 알고리즘은 배경이 촬영된 이미지의 품질을 향상시킬 수 감소 밖의 포커스 라이트 또는 deblurring 알고리즘을 할당합니다. 이러한 공촛점 또는 multiphoton 시스템과 같은 고급 현미경 가끔 필요하지만, 우리는 많은 형광 기자가 고품질의 이미지를 항복이 epifluorescent 현미경 설정을 사용하여 몇 군데 수있는 것으로 나타났습니다. 마이크로 관리자 (http://www.micro-manager.org)은 무료로되고 이외에 직접 TIFF 형식으로 파일을 대신 많은 상용 소프트웨어 패키지의 독점 파일 형식을 저장합니다. 이것은 크게 ImageJ, 포토샵 및 기타 이미지 편집 소프트웨어에서 이미지 파일을 읽는 데 필요한 파일 변환 단계를 제거함으로써 데이터의 분석을 간소화합니다.

하마 마츠 오카 - ER 카메라와 올림푸스 BX61 현미경. 10X 계획 형석 (NA 0.3) 및 60x PlanAchromat (NA 1.35) 객관 렌즈 마이크로 관리자 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) 이미지 J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) 아가로 오스 - 분자 생물학 / 겔 전기 영동 등급 피셔 Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 (카탈로그 # 12-550-15) 연구실 테이프 (피셔 카탈로그 # 15-901 시리즈) 18mm X 18mm # 1.5 Coverslips M9 (242 MM KH 2 PO 4, 40 MM 나 2 HPO 4, 9 밀리 g NaCl, 19 MM NH 4 Club 호텔 MgSO 4) (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). 에그 버퍼 (118 MM NaCl, 48 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 25 MM HEPES, pH를 7.3) 25. 바셀린 브러쉬 / 스틱 면도날 열 블록 해부 현미경 웜 22 플래티넘 와이어 22을 선택 27G1 / 2 정밀 글라이드 니들 (베크턴 디킨슨) 또는 작은 블레이드와 메스

이미징 c. 엘레간스</emepifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

이러한 염색체 조립, 분리 및 cytokinesis로 휴대 프로세스는, 본질적으로 동적입니다. 형광 - 표시 기자 단백질 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 시간 저속 영상은, 그렇지 않으면 고정 샘플 1,2 분석에서 유추됩니다 이러한 동적 이벤트의 시간적 진행의 시험을 수 있습니다. 또한, 세포 프로세스의 개발 규제의 연구 개발 기간 동안 손상 유기체에서 시간 경과 실험을 실시하고 필요로. Caenorhabiditis 엘레간스 배아 따라서 4,5 및 개발 6-9 세포 생물학 질문을 공부에 이상적인 실험 모델을 제공 빛을 투명 3 혈통 알려진 세포와 빠른, 불변량 발달 프로그램을하고 있습니다. C.가 엘레간스 앞으로 유전학 (무작위 돌연변이 유발 10,11 기준)과 특정 유전자를 대상으로 역방향 유전학 (RNAi - 중재 간섭에 기초하고 돌연변이 유발 12-15 타겟)에 의해 유전자 조작을 수정할 수있는 것입니다. 또한, 유전자 변형 동물은 쉽게 찬란 태그 단백질이나 기자 16,17 표현을 만들 수 있습니다. 이러한 특징은 쉽게 생체내 18-21의 근본적인 세포 발달 과정을 조절 유전자 경로를 식별할 수 있도록 결합되어 있습니다. 이 프로토콜에서는 C. 라이브 이미징을위한 방법을 제시 복합 epifluorescent 현미경의 DIC 광학 또는 GFP의 형광을 사용하여 엘레간스의 배아. 우리는 일반적으로 고정 샘플 이미징에 사용되는 즉시 사용할 수 현미경은, 또한 이미징 프로세스를 자동화하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용 시간 저속 분석을 위해 적용할 수있는 쉽게 보여줍니다.

<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 배아는 세포 생물학과 발전을 연구위한 강력한 시스템입니다. 우리는 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 쉽게 사용할 수 epifluorescent 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용 DIC 광학 또는 형광을 이용하여 배아.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

염색체 조립, 분리 및 세포질 분열과 같은 세포 과정은 본질적으로 역동적입니다. ...를 이용한 살아있는 세포의 타임랩스 이미징은

본 프로토콜은 널리 보급된 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 활용하여 Norky DIC 광학 또는 형광 기법으로 초기 C. elegans 배아의 역동적인 사건을 이미징하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 C. elegans 배아를 해부하고 이미징을 위해 마운팅하는 방법부터 시작합니다. 이후 최상의 세부 사항을 갖춘 최적의 이미지를 얻기 위해 DIC Norky 광학 장치의 적절한 설정 방법을 검토합니다.오픈 소스 소프트웨어와 결합하여 우수한 형광 이미지 데이터를 수집하기 위해 광시야 에피 형광 및 조명 교정 방법 또한 검토되었습니다. 우수한 현미경 관찰을 통해 발달 중인 배아의 세포 역학을 시각화할 수 있습니다. 용어가 혼동될 수 있고 적절한 기술을 글로 설명하기 어렵기 때문에, D iic Optics를 올바르게 설정하는 데 있어 이 방법의 시각적 설명이 매우 중요합니다.또한, 연구자는 형광 이미징을 수행할 때 빛 노출을 최소화하도록 주의해야 합니다. 광독성과 광퇴색을 제한하기 위해, 이미징용 배아를 준비하려면 먼저 두 가지 고정 용액을 만듭니다. 하나는 녹인 바셀린이며, 다른 하나는 버퍼에 2~3% agarose를 섞은 용액입니다.이미지화할 구조물이 매우 취약한 경우, 끓어오르지 않도록 주의하면서 더 밀도가 높은 aros를 만들 수 있습니다. 두 가지 스톡 용액은 전자레인지에서 녹인 후 4~5 mL씩 분주하여 보관합니다. 이미지화 당일, Vaseline 용액 분주액을 65~70 °C 히팅 블록에서 녹이고, arose 용액 분주액을 전자레인지에서 녹입니다.다시 한번, 끓지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 이 용액들이 용융 상태를 유지하도록 히트 블록에 보관하십시오. 다음으로, 두 개의 슬라이드 상단과 하단을 실험용 테이프로 고정하고, 테이프를 붙인 두 슬라이드 사이에 깨끗한 슬라이드를 배치하십시오.이제 녹은 aros를 깨끗한 슬라이드 위에 몇 방울 떨어뜨리고 다른 깨끗한 슬라이드로 덮습니다. Aros는 얇은 정사각형 패드 형태로 퍼지며 웜 패드가 준비됩니다. 해부 현미경과 백금 와이어 픽을 사용하여 성체 웜 두 마리를 18 x 18 mm 커버슬립 위의 9~12 µL 버퍼 방울로 옮깁니다.그 다음 절단합니다. 바늘이나 메스를 사용하여 벌레를 절개함으로써 배아를 방출시키되, 한천 쪽이 아래로 향하게 합니다. 벌레 패드를 18 by 18 millimeter 커버 슬립 위에 배치하고, 돌출된 한천은 면도날로 제거합니다.마지막으로, 커버슬립을 밀봉하기 위해 페인트 브러시나 이쑤시개를 사용하여 용융된 바세린 용액을 테두리를 따라 도포합니다. 이제 세포를 이미징할 준비가 되었습니다. 슬라이드를 현미경에 올릴 때, 두 편광판이 서로 수직으로 정렬되었는지 확인하십시오.월러(waller)와 프리즘이 모두 광로에서 벗어나 있는지 확인하십시오. 시야가 어둡지 않다면, 어두워질 때까지 콘덴서 아래의 편광판을 회전시키십시오. 10배 대물렌즈를 사용하여 배아를 찾으십시오.영상 영역 내에 여러 개의 배아를 확보하기 위해 벌레 몸체 주변에서 어린 배아 그룹을 찾으십시오. 최상의 영상을 얻으려면 벌레 내부에 있는 배아는 피하십시오. 적절한 배아를 찾았다면, 더 높은 배율의 대물렌즈로 전환하십시오.이제 필터 큐브를 DIC로 전환하십시오. 다음으로, 상부 대물렌즈 월스톤 프리즘을 광로에 삽입하고 콘덴서의 터렛을 회전시켜 대물렌즈와 일치하는 하부 월스톤 프리즘을 선택하십시오. 프리즘이 배치되면, 이 터렛 아래의 슬라이더를 조정하여 렌즈의 개구수(numerical aperture)에 맞추십시오.최적의 쾰러 조명을 얻으려면 콘덴서 다이아프램의 가장자리가 가장 선명하게 보일 때까지 콘덴서의 초점을 맞추십시오. 가장 선명하다는 것은 빛과 어둠의 경계가 가장 뚜렷하거나 초점이 맞았을 때를 의미합니다. 최적의 대비를 얻으려면 슬라이더의 노브를 돌려 조리개와 프리즘을 조정하십시오.이제 현미경을 사용할 준비가 거의 완료되었습니다. 이제 micromanager 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에서 추가적인 이미징 파라미터를 제어할 차례입니다. 먼저 카메라 게인(gain)을 0으로 설정하는 것으로 시작하십시오.그 다음, 파일을 16비트가 아닌 8비트 TIFF로 저장하도록 설정을 변경하십시오. TIFF 파일은 나중에 Image J와 같은 오픈 소스 소프트웨어로 분석할 수 있습니다. 다음으로, 가장 밝은 픽셀이 포화 수준 바로 아래에 오도록 광량을 조절하십시오. 모든 과정이 올바르게 수행되었다면, 빛이 비스듬히 들어오는 것처럼 보여 이미지가 3D처럼 보일 것입니다.이미지가 선명하게 보이면, 촬영하고자 하는 배아를 선택하고 관심 영역(region of interest)을 지정합니다. 현미경에 포커스 모터가 있는 경우, 이를 사용하여 각 시점마다 여러 초점 평면을 수집하십시오. 다차원 획득(multidimensional acquisition) 창을 열고, 초점 노브를 조정하여 일부 난황 과립이 초점이 맞는 첫 번째와 마지막 초점 평면을 찾아 Z-stack의 상단 및 하단 평면을 설정합니다.단계 크기를 설정합니다. 이를 통해 수집할 초점 평면의 수가 정의됩니다. 이제 모든 초점 평면을 획득하기에 충분히 긴 시간 간격을 설정하십시오.최대 시간 지점을 매우 높게 설정하여 수동으로 중지할 때까지 소프트웨어가 이미지를 촬영하도록 할 수 있습니다. 프로세스를 모니터링할 수 있도록 소프트웨어에서 마지막으로 획득한 이미지만 표시하도록 설정하십시오. 이제 이미지 파일 이름을 지정하고 이미지 획득을 시작하십시오.이미지 분석은 다음 섹션의 마지막 부분에서 간략하게 검토할 것입니다. GFP 영상을 제작하는 과정은 4D 또는 Musky DIC 영상을 만드는 것과 매우 유사하지만, 형광 셔터의 소프트웨어 제어가 포함된 구성 파일을 사용합니다. 배아가 위치한 상태에서, 상단 월스톤 프리즘이 광로에 있지 않은지 확인하고 필터 큐브를 F-I-T-C-G-F-P로 전환하십시오.소프트웨어 시작 시 자동으로 설정되지 않았다면, 카메라 게인(gain)이 255로 설정되어 있는지 확인하십시오. 이미지 파일은 16비트 tiff 형식으로 설정됩니다. 이제 투과광원을 끄고 라이브 이미징(live imaging)을 클릭하십시오.형광 신호의 신호 대 잡음비(signal to noise ratio)가 양호하게 나타나도록 UV 광원의 강도와 노출 시간을 조정하되, 세포를 보존하기 위해 빛 노출은 최소한으로 유지하십시오. 다음으로 시간 간격을 설정하십시오. 시간 지점의 수와 초점 평면의 수를 설정한 후, 앞서 설명한 대로 이미지 획득을 진행합니다.영상을 분석하려면 오픈 소스 소프트웨어를 사용하십시오. MicroManager 플러그인이 설치된 Image J를 사용합니다. 매우 큰 영상의 경우 loci 플러그인을 사용하여 Image J로 가져올 수 있습니다. 이것은 nor masky, DIC 광학계로 촬영한 야생형 배아입니다.후측은 오른쪽 하단이며, 복측은 왼쪽 하단입니다. 영상은 15초마다 수집된 단일 초점 평면 이미지 시퀀스를 보여줍니다. 재생 속도는 초당 14프레임으로 설정되었습니다.이 배아는 첫 번째 배아 분열 동안 형광을 발하며, 여기서 후방은 오른쪽 상단 방향입니다. 이 영상은 10초 간격으로 단일 초점 평면에서의 변화를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 동적인 사건들을 연구하기 위해 DIC Naski 광학과 에피 형광을 모두 사용하여 살아있는 배아를 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.최적의 이미지를 얻기 위해 DIC Nomar 광학계를 설정하는 방법에 대해 더 잘 이해하셨기를 바라며, 항상 더 고급 현미경에 의존하지 않고도 에피 형광 조명(epi fluorescence illumination)을 사용하여 고품질의 형광 데이터를 얻을 수 있다는 점을 인지하시기 바랍니다. 또한, 이러한 이미징 기술을 특정 유전자 기능이 결핍된 배아를 조사하는 데 적용하여, 세포 분열이나 발생 과정 중 관심 있는 사건에 필요한 유전적 요구 사항을 추가로 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

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동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

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여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

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이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

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이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

배우세요 C. elegans 태아의 실시간 이미징 방법을 DIC 광학 및 형광 현미경을 활용하여. 오픈 소스 소프트웨어로 세포 역학을 관찰하고 발달 생물학 연구에 필수적인 고품질 영상 데이터를 획득하세요.

이미징 C. 엘레간스 태아

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