막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

이 절차의 전반적인 목표는 단일 세포 표면의 부위 지시 형광 표지를 사용하여 막 단백질의 확인 역학을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 적색 C.It 에서 볼 수 있듯이 세포외 및 막관통 도메인의 계면에서 잔기를 시스틴에 개별적으로 돌연변이시켜 수행된 다음 이 잔기를 시스틴 반응 플루오로 4로 표지할 수 있는지 여부를 결정하는 데 필요합니다. 절차의 두 번째 단계는 시스틴(cystine), 돌연변이 유발 및/또는 플루오로 4(fluoro four) 표지가 단백질의 동역학 및/또는 확인 상태에 영향을 미치는지 여부를 검사하는 것입니다.

이 작업은 표시된 설정을 사용하여 수행됩니다. 절차의 세 번째 단계는 형광 강도의 변화를 표적 단백질의 운동 매개변수와 비교하고 대조하는 것입니다. 일반적인 형광 흔적이 여기에 나와 있습니다.

절차의 마지막 단계는 돌연변이된 시스테인 쌍을 공여체 Fluor fours 또는 공여체 수용체 Fluor fours로 라벨링하여 전압 클램프 측정과 함께 광 파괴율을 측정하고 거리 제약을 결정하는 것입니다. 이 그림은 검은색 도큐터가 없는 경우 기증자 사진 파괴율을 보여주며, 수혜자가 있는 경우 도니아의 사진 파멸은 빨간색으로 표시됩니다. 궁극적으로, 단백질 확인 변화의 결과인 형광 강도의 변화가 전압 클램프 형광 측정을 통해 막 단백질 기능과 상관될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 단백질의 확인 상태 변화가 원형질막을 가로지르는 소분자 및 이온 수송을 촉진하는 방법과 같은 막 이온 수송 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 나트륨 칼륨 펌프를 xop posts, Lavis 난모세포 발현에 적합한 벡터로 클로닝하여 절차를 시작합니다. 다음 단계는 동반 논문에서 설명한 바와 같이 막관통(transmembrane)과 세포외(extracell) 도메인 사이의 경계면에 위치한 잔기에서 시스테인 돌연변이를 만드는 것입니다.

완료되면 동반 논문에 설명된 대로 혈장 DNA를 mRNA에 전사한 후 DNA 염기서열 분석으로 돌연변이가 삽입되었는지 확인하고 수술 전에 분광 광도계를 사용하여 mRNA의 수율을 정량화합니다. 개구리는 수술 중 구토를 방지하기 위해 12시간 동안 금식해야 합니다. 다음 날 수술을 시작하려면 개구리가 발가락을 꼬집어도 반응하지 않을 때까지 개구리를 마취액에 담그십시오.

마취액에서 개구리를 제거하고 기저귀 패드의 흡수 면에 등쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 개구리를 촉촉하게 유지하기 위해 젖은 종이 타월을 개구리에 올려 놓습니다. 또한 개구리의 눈이 열려 있으면 식염수로 촉촉하게 유지하십시오.

개구리의 정중선 한쪽을 작게 절개합니다. 난소를 찾아 개구리의 바깥쪽으로 가져옵니다. 난소를 피부에 만지지 마십시오.

난소를 제거하고 링거 용액이 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. smic cavity 내부에 다시 넣기 전에 나머지 조직에 출혈이 있는지 확인하십시오. 출혈이 발생하면 멸균 Q-tip으로 출혈이 멈출 때까지 압력을 가하십시오.

중단된 봉합사 패턴을 사용하여 절개 부위를 봉합하여 수술을 마칩니다. 가위를 사용하여 마취에서 회복하기 위해 개구리를 집으로 되돌립니다. 분리된 난소엽을 더 작은 부분으로 나눕니다.

덩어리를 링거 용액과 콜라겐 분해 효소로 칼슘으로 옮깁니다. 그런 다음 소화 용액을 섭씨 18도에서 2시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 대부분의 세포가 분리되면 칼슘을 뺀 링거 용액으로 난모세포를 세척합니다.

그런 다음 실온에서 칼슘을 뺀 링거 용액에서 난모세포를 10분 동안 배양합니다. 이 시점에서 링거와 칼슘 용액으로 세포를 철저히 세척하십시오. 그런 다음 주사 전에 저장하기 위해 난모세포를 링거 용액과 칼슘으로 옮깁니다.

다음 단계에서는 영하 20도의 냉동고에서 합성된 mRNA를 회수합니다. 25나노그램의 mRNA를 50나노리터의 최종 부피에 추가합니다. 그런 다음 주입 후 mRNA를 cyte에 주입합니다.

난모세포를 링거 용액과 겐타마이신 1밀리리터당 1밀리그램에 넣고 섭씨 18도의 어둠 속에서 3-7일 동안 배양합니다. 이를 통해 나트륨 칼륨 펌프가 난모 세포 원형질막 내에서 발현될 수 있습니다. 실험 당일, 인큐베이터에서 난모세포를 제거하고 45분 동안 로딩 버퍼에 넣은 다음 45분 동안 로딩 후 버퍼에 넣습니다.

이는 세포 내 나트륨 농도를 증가시켜 나트륨 칼륨 펌프를 쉽게 측정할 수 있도록 합니다. 형광 측정의 경우, TMRM 또는 FM과 같은 원하는 형광단의 5마이크로몰이 포함된 로딩 후 버퍼에서 암흑 속에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 세균총 4개 라벨링 후, 무염료 포스트 버퍼로 난모세포를 철저히 세척합니다.

사진 표백을 방지하기 위해 난모세포를 어두운 곳에 보관하십시오. 두 개의 전극 전압 클램프 측정을 준비하기 위해 먼저 마이크로 전극에 3몰 염화칼륨을 채우고 저항을 테스트합니다. 저항은 0.5에서 1.5메가옴 사이여야 합니다.

시스테인 스캐닝 실험의 경우 형광 현미경에 5 35 DF 50 여기 필터, 5 65 EFLP 방출 필터 및 5개의 70 DRLP diic mirror를 장착하십시오. 다음으로, octe를 형광 현미경 스테이지의 RC 10 챔버에 놓습니다. 그런 다음 증폭기를 사용하여 두 마이크로 전극을 모두 octe에 부드럽게 삽입하여 멤브레인 전위를 일정한 값으로 유지합니다.

용액 교환 또는 막 전위 변경과 같은 적절한 기술을 사용하여 단백질을 활성화하여 멤브레인 전체의 이온 플럭스를 측정합니다. 동시 형광 측정의 경우 100와트 텅스텐 광원을 사용하여 도너 형광단을 여기시키고 핀 0 2 2, A 사진 DDE를 사용하여 형광 라벨링을 위한 형광 강도의 변화를 감지합니다. 시스테인 스캔 후.

P clamp 10 소프트웨어에 의해 제어되는 전압 단계를 사용하여 고정 전류에서 형광 강도의 변화를 측정합니다. 프로토콜의 두 번째 부분은 거리 측정과 함께 anes atropy 측정을 수행하는 것입니다. 카파 제곱 값의 범위를 계산하기 위해 atropy는 회전으로 인한 fluoro four의 상대적 이동성을 측정합니다.

계산에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 기사를 참조하십시오. 거리 제약을 측정하려면 플루오로 4로 표지할 수 있는 두 개의 접근 가능한 세포 외 시스테인 잔기가 있는 홀로 효소를 사용합니다. 1마이크로몰 FM과 4마이크로몰 TMRM을 포함하는 포스트 로딩 버퍼를 추가합니다.

그것이 바로 기증자이자 수용자입니다. 난모세포의 한 배치에 대한 Fluoro fours는 하나의 마이크로몰 FM만 추가합니다. 그것은 단지 기증자 플루오로입니다.

4개에서 다른 배치의 난모세포는 어둠 속에서 30분 동안 얼음 위에서 두 배치의 난모세포를 모두 배양합니다. 이를 통해 acceptor fluoro four가 있거나 없는 상태로 표지된 hollo 효소를 측정할 수 있습니다. 다음으로, 현미경에 4 75 DF 40 여기 필터, 5개의 30 DF 30 방출 필터 및 5 0 5 DRLP 다이크로익 미러를 장착합니다.

그런 다음 난모세포를 형광 현미경 스테이지의 챔버에 놓습니다. 연속적인 용액 흐름을 유지하고, 수용체 세균총의 존재 유무에서 공여체 표백의 시간 의존성을 측정합니다. 4. 이러한 결과는 산림 관리인을 사용하여 나트륨 칼륨 펌프의 두 잔류 물 사이의 거리를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.

방정식 2: 전극 전압 클램프 측정은 단백질이 기능하는지 확인하기 위해 동시에 이루어져야 합니다. P 클램프 10의 클램프 X 기능을 사용하여 최소 4개의 OH 사이트 기록에 대해 기증자 플루오로 4의 광 파괴 결과를 평균화합니다. 단백질 소단위체의 상대적 움직임을 측정하려면 수용체와 공여체 플루오로 4를 포함하는 이중 시스테인 구조를 사용합니다.

이러한 잔기에서의 형광 강도는 단백질의 확인 상태에 둔감하며 두 4 사이의 거리에 따라 달라지며 이는 두 개의 4 사이의 거리에 따라 달라집니다. 그런 다음 현미경의 필터 세트를 4 75 a F 40 여기 필터, 5 95 a F 60 방출 필터 및 5 0 5 DRLP 이색성 미러로 변경합니다. 그런 다음 OI를 형광 현미경 스테이지의 챔버에 놓습니다.

다음으로, 공여체는 100와트 텅스텐 광원과 수용체의 형광 강도로 여기됩니다. Fluoro four는 전압 리간드 또는 용액 교환과 같은 적절한 방법을 사용하여 측정하고 막 단백질을 활성화하며 동시에 형광 강도의 변화를 측정합니다. 이 그림은 세포막을 가로지르는 이온 수송의 상관관계와 형광 강도의 변화를 보여줍니다.

상단 트레이스는 10마이크로몰 및 10밀리몰이 있는 상태에서 나트륨 테스트 용액 및 칼륨 테스트 용액이 있는 상태에서 현재 클램프 측정값을 보여줍니다. 아래쪽 트레이스는 현재 클램프 측정과 함께 측정된 형광 강도의 변화를 보여줍니다. 이 그림은 TMRM으로 표지된 2개의 난모세포, 즉 수용체 플루오로 4개를 보여줍니다.

왼쪽의 난모세포는 야생형 나트륨 칼륨 atpa를 발현하고, 오른쪽의 난모세포는 접근 가능한 시스테인 잔류물이 하나 있는 나트륨 칼륨 APA를 발현합니다. 이 그림의 상단 트레이스는 전압 펄스에 대한 과도 전류 데이터를 보여줍니다. 아래쪽 트레이스는 전압 펄스에 따른 형광 강도 변화의 실시간 기록을 보여줍니다.

이 그림은 광표백, 공여체 광파괴의 시간 의존성을 보여주며, 수용체 플루오로 4의 부재 및 존재 여부에서 측정되며, 수용체 플루오로 4 없이 광 표백이 더 빠르게 발생합니다. 각 추적은 4개의 oh 사이트 기록의 평균입니다. 이 그림은 확인 변경에 대한 상대적인 하위 단위 이동을 보여줍니다.

형광 변화는 빨간색 트레이스로 표시되고 현재 흐름은 검은색 트레이스로 표시됩니다. 왼쪽에 표시된 형광 강도의 증가는 식물군 바닥이 서로 더 가깝게 이동한다는 것을 나타냅니다. 중간에 표시된 형광 강도의 변화가 없다는 것은 Fluor four 거리가 정적으로 유지되고 있음을 나타냅니다.

오른쪽에 표시된 형광 강도의 감소는 이 절차를 시도하는 동안 Fluor fours가 더 멀리 이동한다는 것을 나타냅니다. 운동 및 정상 상태 형광 강도의 변화를 단백질의 확인 변화와 연관시키는 것을 기억하는 것이 중요합니다.