막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

본 절차의 전반적인 목표는 단일 세포 표면의 부위 특이적 형광 표지를 활용하여 막 단백질의 구조적 역학을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 빨간색 C로 표시된 바와 같이 세포 외 도메인과 transmembrane 도메인의 인터페이스에 있는 잔기들을 개별적으로 시스테인으로 돌연변이시켜 수행됩니다. 그 다음, 이 잔기가 시스테인 반응성 형광체로 표지될 수 있는지 확인해야 합니다. 본 절차의 두 번째 단계는 시스테인 돌연변이 유발 및 형광체 표지가 단백질의 역학 또는 구조적 상태에 영향을 미치는지 조사하는 것입니다.

표시된 설정을 사용하여 이를 수행합니다. 절차의 세 번째 단계는 형광 강도의 변화를 표적 단백질의 반응 속도론적 파라미터와 비교 및 대조하는 것입니다. 전형적인 형광 추적 곡선이 여기에 표시되어 있습니다.

절차의 마지막 단계는 거리 제약 조건을 결정하기 위해 전압 클램프 측정과 병행하여 광파괴 속도를 측정함으로써, 돌연변이된 시스테인 쌍을 공여체 Fluor four 또는 공여체-수용체 Fluor four로 표지하는 것입니다. 이 그림에서 검은색은 수용체가 없을 때의 공여체 광파괴 속도를, 빨간색은 수용체가 있을 때의 공여체 광파괴 속도를 나타냅니다. 궁극적으로, 단백질의 구조 변화로 인한 형광 강도의 변화가 전압 클램프 형광 측정법을 통해 막 단백질 기능과 상관관계가 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 단백질의 구조적 상태 변화가 어떻게 세포막을 통한 소분자 및 이온 수송을 촉진하는지와 같이 막 이온 수송 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 우선 나트륨-칼륨 펌프를 Xenopus oocyte 발현에 적합한 벡터로 클로닝하여 절차를 시작하십시오. 다음 단계는 동봉된 논문에 설명된 대로 transmembrane 도메인과 extracellular 도메인 사이의 인터페이스에 위치한 잔기에 시스테인 돌연변이를 도입하는 것입니다.

완료 후, 동반된 논문에 기술된 대로 플라스미드 DNA를 mRNA로 전사한 뒤 DNA 시퀀싱을 통해 돌연변이 삽입 여부를 확인하고, 수술 전 분광광도계를 사용하여 mRNA의 수율을 정량화합니다. 수술 중 구토를 방지하기 위해 개구리를 12시간 동안 금식시켜야 합니다. 다음 날 수술을 시작하려면, 개구리가 발가락 꼬집기에 반응하지 않을 때까지 마취액에 담급니다.

개구리를 마취액에서 꺼내어 기저귀 패드의 흡수면 위에 등 쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 개구리가 촉촉한 상태를 유지할 수 있도록 개구리 위에 젖은 종이 타월을 덮어줍니다. 또한, 개구리의 눈이 떠져 있는 경우 생리식염수로 눈을 촉촉하게 유지합니다.

개구리 정중선의 한쪽에 작은 피부 절개를 만듭니다. 난소를 찾아 개구리의 체외로 꺼냅니다. 이때 난소가 피부에 닿지 않도록 주의하십시오.

난소를 제거하여 링거액이 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 조직을 다시 복강 내에 넣기 전, 남은 조직에 출혈이 있는지 확인합니다. 출혈이 발생하면, 출혈이 멈출 때까지 멸균 면봉으로 압박합니다.

단속 봉합법을 사용하여 절개 부위를 봉합함으로써 수술을 마무리합니다. 가위를 사용하여 개구리를 사육장으로 옮겨 마취에서 회복하도록 합니다. 분리된 난소 엽을 더 작은 부분으로 나눕니다.

덩어리들을 collagenase가 포함된 calcium 첨가 ringer 용액으로 옮깁니다. 다음으로, 분해 용액을 18 °C에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 대부분의 난모세포가 분리되면, calcium 제외 ringer 용액으로 난모세포를 세척합니다.

그런 다음 난자를 칼슘이 제외된 링거액(ringer solution minus calcium)에 넣고 상온에서 10분 동안 배양합니다. 이 시점에서, 칼슘이 포함된 링거액(ringers plus calcium solution)으로 난자를 충분히 세척합니다. 그 후 주입 전 보관을 위해 난자를 칼슘이 포함된 링거액으로 옮깁니다.

다음 단계로, -20 °C 냉동고에서 합성된 mRNA를 꺼냅니다. 최종 부피가 50 nL가 되도록 mRNA 25 ng을 첨가합니다. 그 후, 주입 단계에서 mRNA를 세포 내로 주입합니다.

난모세포를 ringer solution 및 1 mg/mL gentamicin에 넣고 18 °C의 암소에서 3~7일 동안 배양합니다. 이렇게 하면 난모세포의 세포막 내에 나트륨-칼륨 펌프가 발현됩니다. 실험 당일, 배양기에서 난모세포를 꺼내 loading buffer에 45분 동안 두고, 이어서 post loading buffer에 45분 동안 둡니다.

이는 세포 내 나트륨 농도를 높여 나트륨-칼륨 펌프의 측정을 용이하게 합니다. 형광 측정을 위해, TMRM 또는 FM과 같은 5 µM의 원하는 형광체를 포함하는 post loading buffer 내에서 난모세포를 암소에서 5~10분 동안 배양합니다. 형광 표지 후, 염료가 없는 post buffer로 난모세포를 충분히 세척합니다.

광퇴색을 방지하기 위해 난자를 어두운 곳에 보관하십시오. 2전극 전압 고정 측정 준비를 위해, 먼저 미세 전극에 3 M potassium chloride를 채우고 저항을 테스트합니다. 저항값은 0.5에서 1.5 mega ohms 사이여야 합니다.

시스테인 스캐닝 실험을 위해, 형광 현미경에 5 35 DF 50 여기 필터, 5 65 EFLP 방출 필터 및 5 70 DRLP 이색 거울을 장착하십시오. 다음으로, 형광 현미경 스테이지 위의 RC 10 챔버에 oocyte를 배치하십시오. 그런 다음 앰플리파이어를 사용하여 막 전위를 일정 값으로 유지하면서 두 미세 전극을 oocyte에 조심스럽게 삽입하십시오.

용액 교환이나 막 전위 변경과 같은 적절한 기법을 사용하여 단백질을 활성화함으로써 막을 가로지르는 이온 플럭스를 측정하십시오. 동시 형광 측정을 위해서는 100 watt 텅스텐 광원을 사용하여 공여체 형광체를 여기시키고, 형광 표지에 따른 형광 강도 변화를 감지하기 위해 0 2 2, A photo DDE를 핀으로 고정하십시오. 시스테인 스캐닝 이후에 진행하십시오.

P clamp 10 소프트웨어로 제어되는 전압 단계를 사용하여 정지 전류에서의 형광 강도 변화를 측정합니다. 프로토콜의 두 번째 단계에서는 거리 측정과 함께 이방성(anisotropy) 측정을 수행합니다. kappa squared 값의 범위를 계산하기 위해, 이방성 측정으로 회전에 의한 fluoro four의 상대적 이동성을 측정합니다.

계산에 관한 자세한 내용은 동반 논문을 참조하십시오. 거리 제약을 측정하려면 형광체로 표지할 수 있는 두 개의 접근 가능한 세포 외 cysteine 잔기를 가진 holo enzyme을 사용하십시오. 1 µM FM과 4 µM TMRM이 포함된 post loading buffer를 첨가하십시오.

이것이 공여체와 수용체입니다. Oocyte 한 배치당 fluoro 4:1 비율로, 1 µM FM만을 첨가합니다. 이것은 공여체 fluoro 전용입니다.

다른 난자 배치 4개에 추가하여, 두 배치의 난자를 모두 얼음 위 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 이를 통해 acceptor fluoro four가 표지된 hollo 효소와 표지되지 않은 hollo 효소의 측정이 가능해집니다. 다음으로, 현미경에 475 DF 40 여기 필터, 530 DF 30 방출 필터 및 505 DRLP 다이크로익 미러를 장착합니다.

그런 다음 난자를 형광 현미경 스테이지 위의 챔버에 놓습니다. 용액의 흐름을 지속적으로 유지하면서 수용체 플로라의 존재 및 부재 시 공여체 표백의 시간 의존성을 측정합니다. 넷. 이러한 결과는 Forster의 이론을 활용하여 나트륨-칼륨 펌프 상의 두 잔기 사이의 거리를 계산하는 데 사용될 수 있습니다.

단백질의 기능성을 확인하기 위해 등전위 전극 전압 고정(voltage clamp) 측정을 동시에 수행해야 합니다. pClamp 10의 clamp X 기능을 사용하여, 최소 4회의 기록에 대해 공여체 형광체(donor fluorophore)의 광파괴(photo destruction) 결과를 평균화하십시오. 단백질 서브유닛의 상대적 움직임을 측정하려면 수용체 및 공여체 형광체가 포함된 이중 시스테인 구조체(double cysteine constructs)를 사용하십시오.

이들 잔기에서의 형광 강도는 단백질의 구조적 상태에 영향을 받지 않으며, 두 형광체 사이의 거리의 함수가 될 것입니다. 다음으로, 현미경의 필터 세트를 475 a F 40 여기 필터, 595 a F 60 방출 필터 및 505 DRLP 다이크로익 미러로 변경하십시오. 그런 다음 형광 현미경 스테이지 위의 챔버에 OI를 배치하십시오.

다음으로, 100 watt 텅스텐 광원으로 공여체를 들뜨게 하여 수용체인 Fluoro four의 형광 강도를 측정합니다. 전압 리간드 또는 용액 교환과 같은 적절한 방법을 사용하여 막 단백질을 활성화하고, 동시에 형광 강도의 변화를 측정합니다. 이 그림은 세포막을 통한 이온 수송과 형광 강도 변화 사이의 상관관계를 보여줍니다.

위쪽 트레이스는 10 µM 및 10 mM ing가 존재하는 상태에서 나트륨 테스트 용액과 칼륨 테스트 용액이 있을 때의 전류 클램프 측정값을 보여줍니다. 아래쪽 트레이스는 전류 클램프 측정과 동시에 측정된 형광 강도의 변화를 보여줍니다. 이 그림은 수용체 형광체인 TMRM으로 라벨링된 두 개의 난모세포를 보여줍니다.

왼쪽의 난모세포는 야생형 sodium potassium atpa를 발현하며, 오른쪽의 난모세포는 하나의 접근 가능한 cysteine 잔기를 가진 sodium potassium APAs를 발현합니다. 이 그림의 상단 트레이스는 전압 펄스에 따른 과도 전류 데이터를 보여줍니다. 하단 트레이스는 전압 펄스에 따른 형광 강도 변화의 실시간 기록을 보여줍니다.

이 그림은 도너(donor)의 광퇴색(photobleaching)에 따른 시간 의존성을 보여주며, 어셉터(acceptor) fluoro four의 존재 및 부재 하에서 도너의 광파괴를 측정하였습니다. 어셉터 fluoro four가 없을 때 광퇴색이 더 빠르게 일어납니다. 각 트레이스는 4회 측정값의 평균입니다. 이 그림은 구조적 변화에 따른 상대적인 서브유닛(subunit)의 이동을 보여줍니다.

형광 변화는 빨간색 트레이스로, 전류 흐름은 검은색 트레이스로 표시됩니다. 왼쪽에 표시된 형광 강도의 증가는 형광 층 사이의 거리가 가까워짐을 나타냅니다. 가운데에 표시된 형광 강도의 변화 없음은 형광 층 사이의 거리가 정지 상태로 유지됨을 나타냅니다.

오른쪽에 표시된 형광 강도의 감소는 이 절차를 수행하는 동안 형광체들이 서로 더 멀어졌음을 나타냅니다. 속도론적 및 정상 상태 형광 강도의 변화를 단백질의 구조적 변화와 연관 지어 생각하는 것이 중요합니다.