Name: 곤충의 적응 운동력이있는 사람의 행동의 신경 기초를 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 학습하세요 곤충의 적응 운동 행동을 연구하는 신경과학 방법을 미끄러운 표면에서 다리 근육 활동과 접촉 신호를 동시 기록하여 운동 제어 메커니즘을 규명합니다.

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우리는 마이클 Dübbert, 올리버 호프만, 한스 Scharstein, 월 Sydow 우수한 기술 지원 앤 Wosnitza 감사합니다. 이 연구는 AB에 DFG 부여 부 857 / 8,10에 의해 지원되었다

1. 워킹 표면 검은 도보 표면 두 니켈 코팅 황동 플레이트 이루어진 것은 영구적으로 나란히 입사하여 전기에 직접의 종축 아래 2 - 구성 요소의 2mm 폭의 스트립 에폭시 접착제 (UHU 플러스, UHU GmbH를, 독일)에 의해 서로 절연 동물. 그들은 13.5x15.5cm 총 표면적 (그림 1)을 생산하고 있습니다. 왼쪽 및 오른쪽 다리에 대한 반 비행기의 분리는 각 측면에 하나의 다리를위한 독립 tarsa​​l 연락처 모니터링을 허용합니다. <ol><li> 접시는 slipperiness 및 전기 전도성을 전달 NaCl - 용액을 포화 5 부품 95 부품 글리세린의 비율로 글리세린 / 물 혼합과 윤활이며 점도가 (샹카와 쿠마, 1994) 약 430cStokes입니다. </li><li> 혼합물은 표면에 직접 적용되고 0.1 - 0.2mm의 전체 두께를 보장하기 위해 부드러운 조직의 조각으로 분산됩니다. </li></ol> 2. 광학 자극 설정 <ol><li> 워킹 에피소드가로 약의 거리에 위치 두 라운드, 그라운드 유리 화면 (직경 130mm, Marata 화면, Linos Photonics, 괴팅겐, 독일)에 줄무늬 패턴을 프로젝트에 Scharstein (1989)에 의해 설명이 프로젝터를 사용하여 elicited 수 있습니다. 눈에서과 플레이트 (Fig.1)의 왼쪽과 오른쪽 프런트 엔드에 45 °의 각도로 70mm. 줄무늬 패턴의 파장은 λ에 지속적으로 보관됩니다 = 21 °. 움직이는 자극의 대비 주파수는 0.35, 0.72, 1.07 및 1.49Hz 사이에 다양한 수 있습니다. 동물의 반응만을 대비 주파수 ω / λ에 의존 이후 패턴 대비가 (페르미와 Reichhardt 1963) 높으면 (ω = 각속도, λ = 패턴 파장), 우리는 실험을 통해 λ을 변경할 않았 . 동물의 측면에 밝은 줄무늬의 휘도는 약 15cd/m2 및 대비 0.8입니다. 스틱 곤충의 화합물 눈 (Carausius morosus)는 24 dorso - 복부 축에 ommatidia (Friza, 1928)와 rostro - 꼬리 축에 몇 가지 더 있습니다. 스틱 곤충 눈의 발산 각도가 평균 6.2이므로 ° (Jander 및 볼크 - Henrichs, 1970)의 패턴 파장이 약 4 배 ommatidia의 각도했다. 실험은 어두운 패러데이 케이지에 설정하고 20-22에서 어두운 방에 ° C.에서 수행하는 </li><li> 앞으로 걷는이 모두 화면에 진보적인 패턴에 의해 유도된 어디에 밖으로 각 화면의 이동이나 화면 사이에 위치 흰색 배경에 하나의 검은 광선에 줄무늬 </li><li> 터닝은 두 화면에서 같은 방향으로 이동 줄무늬에 의해 유발됩니다. 우리는 이동 줄무늬의 속도와 회전 각도 사이의 상관 관계를 발견하지 않았습니다. 줄무늬 패턴의 휘도가 도보로 유도로 설정되면, 그것은 일반적으로 추가 조정이 필요하지 않지만, 그것은 프로젝터의 할로겐 램프의 전압에 의해 필요에 따라 다른 동물 조정할 수 있습니다. </li></ol> 3. 실험 동물 준비 <ol><li> 여성 성인 스틱 곤충 (Carausius morosus)는 여러 개의 커넥터를 가진 황동 튜브에 삽입 얇은 발사 스틱 (3x5x100mm, WxHxL),에 (치과 시멘트, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld 호텔, 독일) 복부 쪽을 붙이면됩니다. 접착제 적어도 부분적으로 강화된 때까지 동물은 약 ​​잠시 다운 개최된다. </li><li> 머리와 다리는 자유 운동을 허용하도록 다월의 전면과 측면에서 내다. 모든 다리의 coxae의 분야뿐만 아니라 복부의 주요 부분은 아교 무료 왼쪽되어야한다. </li><li> 곤충 머리, 흉부, 각 대퇴골과 경골의 말초 끝을는 나중에 비디오 추적 치과 시멘트와 혼합 형광 안료 (박사 크레머 Farbmühle, Aichstetten, 독일)로 표시됩니다. </li></ol> 4. EMG 전극의 배치 이 예제에서와 같은 다른 다리 근육의 근육 활동, 흉부 및 원인 길게 끌기 (전진 운동)과 다리의 철회 (뒤로 이동)에 위치하고 있습니다 분도기와 견인기의 coxae 근육은, EMG 전극에 의해 기록됩니다 흉부에 이식. 모든 EMG 녹음이 differentially 증폭됩니다. 신호는 더 이상 (Vers.5.05, CED (10X) 증폭하고, spike2로 AD 변환기를 통해 수입, preamplifier (전자 워크샵, 아열대 연구소, 쾰른), 대역 통과 필터 (100Hz - 2000Hz)에 100x 증폭되었다 영국 캠브리지). <ol><li> 전극 (; 47μm 외경 Elektrisola, Eckernhagen, 독일) 코팅 구리선에서 만들어집니다. 한 전극에 대한 두 개의 전선이 처음 접착제로 뭉개졌어 후, 두 끈적 와이어 서로 주위 트위스트 아르 </li><li> 한쪽 끝에 꼬인 철사 끝을는 미니 플러그에 납땜합니다. 다른 끝에있는 와이어가 동물에 삽입을위한 절연없이 깨끗한 종료를 제공하기 위해 절단됩니다. </li><li> EMG 전극은 plugge 아르D 황동 튜브의 끝에있는 작은 커넥터에. </li><li> minuten 핀은 표피에 작은 구멍을 천공하는 데 사용됩니다 </li><li> 전극의 컷 끝나는 그런 다음 우리의 경험에서, 잡음 비율에 좋은 신호를주는, 서로 약 1mm 거리에서 분리되어 근육에 삽입됩니다. 주의의 손상을 방지하기 위해 근육에 너무 깊이 전극을 삽입하지 않도록해야합니다. 그림 2는 동물의 근육에 전극의 위치를​​ 보여줍니다. 그림 3은 장소에 전극 와이어와 동물을 보여줍니다. </li><li> 우리는 장소에 전선을 잡고 histoacrylic 접착제 (3M Vetbond, St.Paul, MN, 미국)의 작은 방울을 사용합니다. </li><li> 접지 와이어는 복부에 삽입됩니다. </li></ol> 5. Tarsal 문의 녹음 Tarsal 연락처는 항상 EMG의 흔적과 함께 기록됩니다. 미끄러운 표면 두 개의 반쪽으로 분할되기 때문에, 두 contralateral tarsa​​l 연락처 최대 동시에 등록할 수 있습니다. 이러한 목적으로, 다리는 접시와 앰프 사이에 회로를 닫습니다 "스위치"로 사용됩니다. 현재는 각 접시의 바닥에 두 소켓을 통해 개별적으로 접시에 적용할 수 있습니다. 우리는 90 °의 위상 지연되는 펄스 발생기 (모델 MS501, 전자 워크샵, 아열대 연구소, 쾰른)와 2 4mV amplitudes 두 개의 사각형 웨이브 신호를 생성할 수 있습니다. 신호는 60dB (/ 1000) 및 미끄러운 표면의 두 반쪽에 적용하여 감쇠됩니다. 이 실험에서 우리는 두 신호 중 하나를 사용하십시오. 그것은 동시에 참조 신호로 잠금 인 앰프로 공급됩니다. 2 위상 잠금 - 증폭기의 (전자 워크샵, 아열대 연구소, 쾰른) 선택 제공된 참조 신호와 동일한 주파수 및 위상에만 신호를 증폭. 두 번째 채널은 90 ° 위상 지연 신호를 감지합니다. 참조 주파수 이외의 주파수에서 잡음 신호를 거부하고 측정에 영향을주지 않습니다. 증폭기 출력 신호는 AD 변환기 (마이크로 1401k II, CED, 캠브리지, 영국)와 디지털을 사용 Spike2으로 공급됩니다. 터치 다운 및 이륙 타르 소의로 및 미끄러운 표면에서 사이에 구리 와이어로 족근 및 경골을 통해 플레이트 (아래 참조 : 5.3-5.8)를에서 전류 흐름. 선택한 증폭기는 높은 입력 저항 (1MΩ)를 보유하고 신호 전압은 동물의 걷는 동작에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해 매우 작습니다. 족근 및 경골을 통해 현재의 통과는 2 4nA 사이입니다. 윤활유에 항목과 표면 사이의 접촉 터치 다운 동안 신호 리드 타임은 1ms 이하입니다. 이륙하는 동안 연락 신호 전환 덜 가파른 더 지연될 수 있습니다. 이것은 지연없이 모세관 상승 효과에 의해 족근에서 윤활유의 찢어과 다리의 움직임에 의한 예정이다 완전한 스윙 단계에서 - 발사. <ol><li> 동물 붙어입니다 발사 스틱과 황동 관은 7 일 사이 무료로 걷는 동안 높이에 해당하는 미끄러운 표면 위에 12mm의 동물의 높이 조정을 허용하는 micromanipulator에 삽입됩니다. </li><li> 모니터 다리의 곤충 족근이 바닥에 때마다 전류 흐름을 측정하기 위해 철사 (직경 47μm)은 약 15cm 길이 토막 내다입니다. </li><li> 구리의 절연은 알코올로 멀리 연소에 의해 제거됩니다. </li><li> 루프는 전선의 한쪽 끝을 함께 형성과 동물의 족근 차 하락이다 </li><li> 루프는 동물과 와이어 사이 좋은 접촉을 제공하는 경골의 말초 끝에 달려있다. </li><li> 와이어는 다음 두 구성 요소 접착제 (ProTempII, 위 참조)의 드롭으로 동물의 근육에 고정하고, 악어 클램프를 통해 차동 증폭기에 연결됩니다. </li><li> 의 종료, 전극 크림의 드롭에서 와이어의 전도성을 향상시키기 위해 연락 분야에 (마르케트 Hellige, 프라이 부르크, 독일) 적용됩니다. </li><li> 신호 강도는 다음 모니터 테스트됩니다. 자물쇠 - 인 - 앰프의 로우 패스 필터 속성 (상수 시간 10ms)와 타르 소의 점진적 lift-off/touch-down 때문에 신호가 정확하게 사각형 신호되지 않습니다. 하나는 따라서 tarsa​​l 접촉의 정확한 타이밍을 확인하고 수동으로 디지털 소프트웨어에 의해 결정 각 이벤트를 확인하기 위해 전환 지점 가까이에 적합한 임계값을 설정할 수 있습니다. tarsa​​l 접촉을 바탕으로, 우리는 주어진 다리의 족근가 자세하고 스윙 단계로 공기에 있었던 시간 지상에 있던 시간을 정의. </li><li> 카메라에 대한 트리거 신호는 EMG 추적 및 tarsa​​l 연락처 신호를 동시에 기록하고, 행동 및 기록 추적의 프레임 상관 관계에 의해 정확한 프레임을 수 있습니다. </li></ol> 6. 디지털 분석을 위해 다리 운동의 광학 녹음 미끄러운 표면에 스틱 곤충의 스테핑 주파수 3 - 4Hz (그레이엄과 크루즈, 1981)를 도달할 수 있습니다. <ol><li>도보 시퀀스를 녹음하기 전에 거울은 터치 다운에 대한 추가 영상 모니터를 가지고 동물 뒤에 45 ° 각도로 배치됩니다. 카메라가 외부 트리거되고 그림은 FireWire를 인터페이스를 통해 PC에 공급하고 있습니다. </li><li> 우리는 디지털 다리 움직임을 분석하는 100fps의 고속 비디오 카메라 (말린 F - 033C, 연합군 비전 테크놀로지, Stadtroda, 독일)와 위에서 시퀀스를 도보로 기록하고, EMG 활동과 tarsa​​l 접촉으로 그들을 상관 관계. </li><li> 도보 시퀀스의 녹음하는 동안 동물은 형광 마커를 조명 강도 조정됩니다 파란색 LED 배열 (30 - 50V DC, 휘도 24cd, 전자 워크샵, 아열대 연구소, 쾰른 대학)와 조명입니다. 문학 (Schlegtendal, 1934)에 따르면, 스틱 곤충은 컬러 비전을 가지고하지 않으며 우리는 돌려 응답에 자외선 조명의 부정적인 영향을 관찰하지 않았습니다. 카메라 렌즈 앞에 노란색 필터는 활성화 빛의 짧은 파장을 억제하고 비디오 레코딩에 대한 높은 콘트라스트를 제공합니다. </li><li> 동영상 파일은 모션 추적 소프트웨어 (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak 서비스, 베를린, 독일)를 사용하여 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 7. 워킹 시퀀스 녹음 <ol><li> 컨트롤로서, 먼저 손상 동물과 함께 산책 순서가 기록됩니다. </li><li> 줄무늬 패턴의 속도가 설정되어 있고, 패턴과 비디오 녹화는 동시에 약 시작됩니다. </li><li> 동물이 자발적으로 운동을 시작하지 않으면, 그것은 안테나에 브러시 (배슬러 및 웨그너, 1983), 또는 공기의 퍼프가 함께 복부에 자극 수 있습니다. 이 경우, 동물은 복부의 왼쪽에있는 감동은 왼쪽과 반대 설정하는 경향이있다. 줄무늬 패턴은 동물이 보행 또는 연속 기록 3 분 후에 때까지 멈출 때까지 계속 유지됩니다. </li><li> 한 다리의 근육 활동이 인근 다리에서 감각 입력에 의존하는 방법까지 테스트하기 위해, 동물은 그 다리를 autotomize을 유도합니다. autotomy의 사이트는 초 이내에 자연까지 닫습니다. autotomized 앞 뒷다리와 동물의 예제는 그림 3에 표시됩니다. </li><li> 예를 들어, 하나의 중간 다리를 가지고 동물 실험을 위해, 우리는 포셉 한 켤레 (슈미트 및 그런드, 2003)와 근위 대퇴골을 곤란하게하여 프로와 metathoracic 다리 autotomy을 유발하거나 coxae의 수준에있는 다리를 잘라 손상 동물에서 녹음 후. 그 후 복구 시간을 30 분 최소가 동물에게 주어집니다. </li><li> 그럼 우리가 전에 새로운 산책 시퀀스를 기록합니다. 감소 준비에서, 우리는 자주 페인트 브러쉬 스트로크를 사용하여 도보로 유도해야합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 실험 설치, A :. 다리 추적 형광 안료로 표시된 및 EMG 녹음 및 tarsal 연락처 측정 유선 미끄러운 표면 위에 닿는 스틱 곤충의 사진. B : 미끄러운 표면에 걷는 동안 이중 다리 tarsa​​l 문의 기록을위한 배선 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 스틱 곤충 중간 다리의 근육에있는 분도기와 견인기 근육의 EMG 전극의 위치에 대한 위치. ML : 중간 다리, FL : 앞 다리 <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> . 그림 3 대신에 중간 다리의 프로 및 견인기 근육의 EMG 와이어와 곤충을 스틱, 앞 뒷다리는 중간 다리의 운동학 및 근육 활동에 인접 다리의 존재의 효과를 연구하기 위해 제거되었습니다 감소 준비. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 내부 중간 다리에 tarsal 연락처 참조 신호와 견인기 EMG 활동의 예 추적하는 동안이 가고 있습니다. 다리가 다리를 앞으로 단계하게 나타내는, 지상 접촉 ( "폐쇄 회로")가 동안 추적의 시작 부분에서 (첫 번째 파란색 상자) 견인기는 자세 동안 활성화되어 짧은 스위치 (두 번째 파란색 상자) 후, 다리가 거꾸로 감독 단계의 발생을 보여주는 공기 ( "개방 회로", 셋째 파란색 상자)에있는 동안 견인기는 스윙하는 동안 활성화됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 화면 분도기에서 녹화 촬영 (위 추적)와 견인기 (중간 추적) 근육과 동시에 기록 tarsal 문의 추적 (하단 추적). 단계 사이클에서 두 근육의 활동에 해당하는 EMG의 추적에있는 교류 활동을 참고, 그 직전과 도중에 분도기 활동입니다스윙, 다리 자세에 후 터치 다운 타르 소의 동안 tarsa​​l 지상 문의 연락처 추적 신호 손실 및 견인기 활동. 삽입은 동물의 동작을 확인하는 데 사용되는이 기록에 해당하는 일치하는 동영상 파일을 보여줍니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 허용하는 설정을 설명해야 큰 정도 바닥에 다른 도보 사지의 기계적 변위로 인한 간접 효과에서 neuronally 생성 도보 활동의 uncoupling에 동작과 허가 터닝의 광학 유도 세대. 반면에 지상 반응 병력이나 tarsa​​l 문의에 대한 신경 시스템을 통해 다리 사이에 잠재적인 정보의 흐름은 여전히​​ 가능하고 실험자이 감소 준비에 같은 정보의 영향을 공부하실 수 있습니다. 미끄러운 표면 설치의 주요 장점은 동물이 매우 높은 걸어 경향, 그리고 도보 또는 treadwheel에 스테핑 반대로, 동물이 자연 산책의 모든 방향으로 스윙과 자세 위상 동작을 수행할 수를 표시 것을 포함합니다. 또한, 모든 다리 자유의 정도는 동물이 손상 또는 반 그대로 준비 여부 산책 곡선을 수행할 수 있습니다. 다리가 수동적으로 동물이나 아래 기판의 운동의 전진 운동에 의해 간단하게 이동할 수 없기 때문에, 모든 운동은 다리의 모터 출력 (; 그레이엄과 웬들러, 1981 크루즈, 1976) 반영합니다. 하나 사지 운동 운동학의 분석과 모터 활동의 electrophysiological 녹음을 결합 수 있기 때문에 설치와 같은 회전이나 앞으로 대 뒤로 걷는 등 적응 행동의 연결을 기초를 조사하기 위해 매우 적합합니다. 우리는 산책을 이끌어하는 스틱 곤충의 optomotor 응답을 사용합니다. 회전 줄무늬 패턴에 대한 동물의 반응은 미끄러운 표면에 닿는 동안 산책 곡선을 수행하기 위해 준비를 보여줍니다. 대부분의 놀랍게도 우리에게, 단일 다리 준비에 하나의 다리는 질적 손상 동물에서와 같은 이동 패턴을 보여줍니다. 우리는 따라서 커브 걷는 컨트롤 인근 다리에서 감각 입력을 조정하지 않고 주로 기능을 수 있다고 믿을만한 이유가 있습니다. 그것은 제거된 다리의 모터 뉴런의 활동도 optomotor 패턴의 영향인지 여부를 추가로 실험에서 테스트하는 것이 중요합니다. 설정은 쉽게 동물의 앞에 하나의 스트 라이프를 배치하거나 부드럽게 안테나를 당겨 같은 직선 순방향 및 역방향 도보로 다른 작업의 연구를 허용하도록 수정할 수 있습니다. 접선의 정확한 측정은 우리가 근육 활동과 다리의 위치를​​ 상호 연관시킬 수 있습니다. 이 전기 접촉 신호의 높은 시간 해상도는 1ms보다되며 스윙에서 자세 단계로 스위치의 타이밍을 새로운 관점에서 우리를 이끌고 있습니다. 해상도는 실시 윤활제의 전단에있는 지연으로 인해 전환을 스윙하는 자세와 미끄러운 표면에 길게 끌기 동안 이륙 완료에 필요한 부족에 대한 더 있습니다. 우리는 메커니즘을 이해하려는 경우에도 불구하고, 자세 전환으로 정확한 스윙에 대한 지식은 특히 유용합니다 첫 번째 단계입니다 다른 행동 상황에서 제어 근육 타이밍 및 다리 근육의 조정 활동 (참조 : Büschges 외, 2008;. Büschges &amp; Gruhn 2008). 예를 들어, 우리는 중간 다리의 견인기 및 분도기의 coxae 근육을 사용하고 동시에 다리가 사용된되는 행동 컨텍스트를 모니터링하는 동안 정확하게 스윙에서 자세 단계로 전환와의 활동을 상호. 이러한 목적을 위해, 우리는 산책을 유도하고 지속적으로 근육 활동을 기록했다. 주어진 다리는 회전 방향에 따라 내부 또는 외부 다리 수 있습니다. 스테핑 중간 다리에서 기능적 의미에서 안쪽 다리 역할을, 그것은 (Fig.4 참조 견인기하고 오래 끄는 근육 기능 자세 근육 역할을 모두 다리가 간헐적으로 앞으로 이동 단계에 추가로 하위 단계를 생성 할 수 있기 때문에 볼 수 있습니다 ). 두 근육에서 electromyograms (EMGs)는 정류와 터치 다운의 시간과 최초의 근육 스파이크의 지연 시간 계산을 정상화되었습니다. 흥미롭게도, 존경하는 두 근육의 대기 시간은 - 발사와 터치 다운 각각의 스윙이나 자세 근육 (Fig.4 참조)이 아닌 근육 자체에있는 근육의 기능에 따라, 그리고에서만 경미한 변경을 보여 활동 발병의 타이밍. 자세로 스윙에서 상태의 변화에​​ 대한 대부분의 설명은 tarsa​​l 문의 트리거 자세의 시작의 감각 신호를 가정합니다. 터치 다운 및 스틱 곤충의 근육을 활성화 간의 짧은 대기 시간이 약 그들이 의존하고 어떤 감각 정보를 가지고하는 방법의 흥미로운 질문은 이제 수정 설치와 함께 해결하실 수 있습니다. 요약에서, 우리는 안정적으로 고정 스틱 곤충의 직선과 곡선 산책을 이끌어 수있는 미끄러운 표면 설정을 보여줍니다. 운동학, 근육 활동과 tarsa​​l 터치 다운의 타이밍과 리프트 - 오프는 모니터와 두 가지 행동 C에 상관 수 있습니다동시에 ontexts. 이것은 우리에게 그대로 동​​물과 기본 메커니즘뿐만 아니라 하나의 다리 근육 활동과 행동 컨텍스트 간의 상세한 관계를 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>2액형 에폭시 접착제</td><td>UHU plus, UHU GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 스크린 (직경 130mm)</td><td>Linos Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>치과용 시멘트</td><td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Germany</td><td>3M Id : 70-2011-0358-0 카탈로그 번호 : 46430</td><td>3M (&lt;a href=&quot;http://www.3m.com/">http://www.3m.com/&lt;/a&gt;) 또는 치과 공급업체를 통해 구입 가능</td></tr><tr><td>형광 안료</td><td>Dr. Kremer Farbm&amp;uuml;hle, Aichstetten, Germany</td><td>카탈로그 번호: 예) 56200 형광 안료 골든 옐로우, 56350 형광 안료 플레임 레드</td><td>&lt;a href=&quot;http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en&lt;/a&gt; 또는 &lt;a href=&quot;http://www.kremerpigments.com/">http://www.kremerpigments.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>조직용 아크릴 접착제</td><td>3M</td><td></td><td>공급처: WPI</td></tr><tr><td>피복 구리선</td><td>Elektrisola Eckernhagen</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>전극 크림</td><td>Marquette Hellige, Freiburg, Germany</td><td></td><td>해당 제품은 현재 단종되었으며, 다음과 같은 제품을 추천함: &lt;a href=&quot;http://www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>펄스 발생기</td><td>Model MS501, electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>락인 증폭기</td><td>Zoological Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AD 컨버터</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전치 증폭기</td><td>Zoological Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고속 비디오 카메라</td><td>Allied Vision Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV LED 어레이</td><td>Zoological Institute</td><td></td><td>30-50V DC, 전자 작업실&lt;br/&gt;
&amp;#955;390-395nm&lt;br/&gt;휘도 24cd</td></tr><tr><td>디지털화 소프트웨어 Spike2</td><td>Vers.5.05, CED, Cambridge, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>동작 추적 소프트웨어</td><td>Mikromak service, Berlin, Germany</td><td>WINanalyze, Vers.1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

곤충의 적응 운동력이있는 사람의 행동의 신경 기초를 공부

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

동작을 걷는 신경 기초를 공부 하나는 자주 그 다리 움직임 기판과 일반적인 접촉을 통해 다른 다리 수동 세력과 상호 작용에서 발생하는에서 neuronally 생산 스테핑 출력을 분리 힘들다는 문제에 직면해있다. 우리는 신경계 모터 출력, 스테핑 무브먼트의 동점 분석에 의해 생산되는 특정 운동의 어느 부분이 이해하고 싶다면, 따라서, 모터 활동 electrophysiological 녹음을 구비해야합니다. 행동 동물에의 연결이나 근육 활동의 기록은 종종 가능한 자유의 많은 도로로 이동하는 능력에있는 동물을 제한 수 electrophysiological 장비에 의해 제한됩니다. 이 중 implantable 전극을 사용하고 긴 밧줄에 동물 이동함으로써 피할 수 있습니다 (. 즉, Clarac 외, 1987; Duch &amp; 플루거, 1995, 봄 외, 1997;. Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) 또는 전송로 telemetric 장치 (; 피셔 외, 1996;. 쓰치다 외 2004;. 하마 외, 2007;.. 왕 외, 2008 Kutsch 외, 1993)를 사용하여 데이터입니다. 성공적으로 큰 arthropods에 사용되는 이러한 우아한 방법, 모두는 종종 하나 쉽게 긴 밧줄에 뒤엉키다 작은 도보로 곤충에 적용하기 어려운 증명이나 telemetric 장치의 무게는 배터리에 의해 방해하고 있습니다. 또한, 이러한 모든 경우에, 그것은 운동의 순수의 연결을 기반으로하고 기판을 통해 걷는 다리 사이에 기계적 결합에 의해 끼쳤다 효과 구별하기 위해 여전히 불가능합니다. 이 문제에 대한 하나의 해결책은 장소에서 도보로 무료이며 그것이 로컬 효과적으로 대부분의 지상 접촉 역학을 제거 미끄러운 표면을 통해 예를 들어, 일시 중지 닿는 동물의 실험을 실시하는 것입니다. , 역방향 도보 (그레이엄과 엡스타인, 1985) 또는, (Gruhn 외, 2009a. Tryba과 Ritzman, 2000a, B) 회전;이 탈출 응답 (Camhi와 레비, 1988 Camhi 및 놀렌, 1981) 연구에 사용되고 있습니다 속도의 변화 (Gruhn 외., 2009b)와 그것은 실험자 쉽게 동점 분석 (Gruhn 외., 2006)와 내부 및 세포 생리학을 결합 수 있습니다. 우리는 다운 터치와 같은 손상 및 감소 준비에 정직과 곡선 도보로 다른 행동 패러다임 아래 - 발사와 관련하여 행동 스틱 곤충의 다리 근육의 타이밍을 조사하기 위해 미끄러운 표면 설치 프로그램을 사용합니다.

우리는 미끄러운 표면에 산책, 곁에 곤충의 전기적 기록 tarsa​​l 연락처 신호 초과 모터 활동을 기록하는 방법을 설명합니다. 이것은 기판을 통해 다리 사이의 기계적 상호 작용의 감소 영향에 따라 적응 행동의 신경 기초를 연구하는 데 사용됩니다.

보행 행동의 신경학적 기초를 연구할 때, 신경계에서 생성된 보행 출력물과 ...으로부터 오는 출력물을 분리하기 어렵다는 문제에 자주 직면하게 됩니다.

본 실험 절차의 전반적인 목표는 다리 근육 생리학을 분석하는 것입니다. 이는 다양한 보행 상황에서 구속된 곤충의 타이밍과 운동학을 분석하는 것을 포함합니다. 본 연구에는 상대적으로 크기가 크고 분절 신경절이 명확하게 구분되어 있는 대벌레 *raus miosis*가 사용되었습니다.먼저, 형광 비디오 추적을 위해 동물을 테더링하고 라벨링합니다. 다음으로, 신근(protractor)과 굴근(retractor)에 EMG 전극을 배치합니다. 그런 다음 미끄러운 표면에서 부절 접촉 기록을 하기 위해 테더링된 곤충을 준비합니다.절차의 마지막 단계는 다양한 보행 상황에서 다리 근육 활동과 tarsal 접촉을 동시에 기록하는 것입니다. 결과적으로 근육 타이밍의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 행동 맥락에 따라, 다리가 사용됩니다. 기존의 연구 방식과 같은 기술과 비교했을 때 이 방법의 주된 장점은 다음과 같습니다.트랙 볼(trek balls) 위에서 걷게 하면 지면을 통한 기계적 결합이 제거됩니다. 이 방법은 운동 능력을 가진 동물의 보행에서 단일 다리가 어느 정도 기여하는지와 같은 운동 제어의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 단일 다리 수준에서 보행 속도와 보행 방향의 변화를 연구할 수 있게 됨으로써, 이 기술의 영향은 적응형 운동 행동 분야를 개척하며 본 설정의 유용성을 입증할 것입니다.제 실험실의 기술자인 Peter Boha가 제작한 장치로, 2mm 너비의 2액형 에폭시 띠로 서로 절연되어 단단히 결합된 두 개의 니켈 도금 황동판을 사용합니다. 동물이 미끄러지듯 걸을 수 있는 표면을 준비하기 위해, 부드러운 티슈를 사용하여 각 판의 절반 부분에 전기 전도성 글리세린 식염수 혼합물을 각각 도포합니다. 용액이 적절하게 도포되면 두께는 0.1에서 0.2mm 사이가 되어야 하며, 표면 동점도는 약 430 centi stokes가 됩니다.두 개의 원형 갈색 유리 스크린을 플레이트 앞에 배치하여, 실험 중에 동물 눈으로부터 70 millimeters 거리가 되도록 합니다. 이 스크린에 움직이는 줄무늬 패턴이 투영되면 동물이 앞으로 걷기 시작합니다. 보행은 두 스크린에서 줄무늬가 바깥쪽으로 움직이는 점진적 패턴에 의해 유도되거나, 스크린 사이에 배치된 흰색 배경의 단일 검은색 빔에 의해 유도될 수 있으며, 후자의 경우 더 긴 직선 보행 시퀀스를 이끌어낼 수 있습니다.동일한 방향으로 이동하는 두 개의 점진적 줄무늬 패턴이 나타나면 회전이 유도됩니다. 실험 장치가 조립되면, 치과용 시멘트 테더를 사용하여 실험 동물을 준비할 수 있습니다. 성체 암컷 대벌레의 복측이 아래로 향하게 하여 소켓이 달린 황동 튜브에 부착된 얇은 bolsa 스틱 위에 고정합니다. 머리와 다리는 자유롭게 움직일 수 있도록 dell의 전면과 측면으로 돌출시킵니다.다음으로 치과용 시멘트와 혼합한 형광 색소를 사용하여 추후 비디오 추적을 위해 머리, 흉부, 그리고 각 다리의 원위 대퇴골과 경골에 표시를 합니다. 동물의 근육 활동은 흉부에 삽입된 EMG 전극을 통해 기록됩니다.신호는 프리앰프에서 100배 증폭된 후, 디지털 신호로 변환되기 전에 다시 10배 증폭되고 100 hertz에서 2000 hertz 범위로 필터링됩니다. 전극은 접착제를 바른 두 개의 코팅된 구리선으로 제작하며, 두 선을 서로 꼬아준 뒤 꼬인 와이어의 한쪽 끝을 미니 플러그에 납땜하고, 다른 쪽 끝은 미세 핀 펀치를 사용하여 큐티클에 작은 구멍을 내어 전극이 통과하도록 절단합니다. 근육과 접촉시키기 위해 와이어 한쪽 끝의 미니 플러그를 동물이 연결된 황동 튜브에 부착된 소켓에 삽입합니다.전극의 절단된 끝부분을 큐티클 바로 아래에 있는 구멍을 통해 근육 속으로 삽입하여, 각 전극의 두 와이어가 약 1mm 간격으로 떨어진 서로 다른 구멍에 위치하도록 합니다. 와이어를 고정하기 위해 소량의 histo acrylic glue를 사용합니다. 곤충 보행의 운동학과 근육 생리학 사이의 관계를 파악하기 위해, 참조 전극 역할을 할 와이어 하나를 복부에 추가로 삽입합니다.보행 중 족근(tarsal) 접촉은 EMG 기록 중에 측정하며, 15 centimeter 길이의 구리선 끝부분의 절연체를 알코올로 태워 족근을 통해 흐르는 전류를 측정할 수 있도록 합니다. 다음으로, 와이어의 한쪽 끝에 루프를 만들어 동물의 족근에 끼운 뒤 경골(tibia)의 원위단에서 조여 고정합니다. 그 후 와이어를 동물의 흉부에 치과용 시멘트 한 방울로 고정하고, 동물이 접착된 황동 튜브의 볼사 스틱(bolsa stick)을 마이크로 매니퓰레이터에 연결합니다.미끄러운 표면 위로 동물의 높이를 7~12mm 사이로 조정할 수 있도록 하며, 이는 엘리게이터 크림프(alligator crimp)를 통해 자유 보행하는 곤충의 높이에 해당합니다. 전선의 반대쪽 끝은 미분 락인 증폭기(differential lock-in amplifier)에 연결합니다. 전선 끝부분의 전도성을 높이기 위해 접촉 부위에 전극 크림을 한 방울 도포합니다. 회로는 플레이트 하단의 플러그를 통해 플레이트를 증폭기에 연결함으로써 완성됩니다.펄스 발생기는 신호를 생성하여 이 플러그를 통해 플레이트의 양측에 인가합니다. 플레이트에서 나오는 리드선 중 하나는 증폭기에 연결되어 기준 신호로 사용됩니다. 이제 동물을 배치하고 전선을 연결하면, 동물의 다리가 스위치 역할을 하여 tarsus를 통해 전류가 흐르며 플레이트와 증폭기 사이의 회로가 닫히게 됩니다.이를 통해 접촉 시 1ms 미만의 리드 타임을 갖는 신호와 이탈 시 발생하는 지연 신호를 생성합니다. 부절을 위아래로 움직여 신호 강도를 테스트합니다. 그런 다음 EMG 와이어를 증폭기에 연결합니다.카메라의 트리거 신호는 tarsal 접촉 및 EMG 트레이스와 동시에 기록되어, 각 트레이스의 프레임별 상관관계 분석이 가능하도록 합니다. 이제 동물이 제자리에 있고 모든 장치가 부착된 상태에서 보행 시퀀스를 기록할 수 있습니다. 대조군으로서 움직임에 대한 시각적 기록을 생성하기 위해 시각적 패턴과 비디오 녹화를 동시에 시작합니다.초당 100프레임의 고속 비디오 카메라를 사용하여, 동물 위쪽과 동물의 뒤편 45도 각도로 배치한 거울을 통해 다리의 움직임을 기록합니다. 동물이 자발적으로 이동을 시작하지 않는 경우에는 브러시로 복부를 자극하거나 퍼퍼(puffer)로 더듬이를 자극할 수 있습니다. 청색 LED 라이트 어레이로 동물을 조사하고 카메라 렌즈에 황색 필터를 장착하면 동물의 형광 마커 추적 성능을 향상시킬 수 있습니다.이렇게 하면 활성화 광의 단파장을 억제하고 비디오의 대비를 높일 수 있습니다. 먼저 대조군으로서 정상 동물의 보행 시퀀스를 기록하십시오. 시각적 자극을 변경하면 이동 방향이 바뀝니다.필요한 경우, 포셉으로 대퇴마디를 집어 다리를 절단하고 동물이 30분 동안 회복하도록 합니다. 이제 소실된 다리의 생리학적 역할을 평가할 수 있습니다. 이 이미지의 점들은 가운데 다리의 신근(protractor muscle)과 굴근(retractor muscle)에 배치된 전극의 위치를 나타냅니다.본 EMG 준비 과정에서는 중간 다리의 운동학 및 근육 활동에 인접한 다리가 미치는 영향을 연구하기 위해 앞다리와 뒷다리를 제거하였습니다. 이제 회전하는 동물의 이 트레이스 데이터를 살펴보면, 상단 트레이스는 tarsal 접촉 트레이스를 보여줍니다. 하단 트레이스는 retractor muscle의 EMG를 보여줍니다.추적 시작 단계의 전진 보행 시, 다리가 지면에 닿아 있는 지지기 동안 견인근(retractor)이 활성화됩니다. 짧은 전환 과정을 거친 후 다리는 후진 보행을 수행하며, 이때 견인근은 다리가 공중에 떠 있는 유각기 동안 활성화됩니다. 동물이 상단에서 보행하는 동안 수집된 모든 데이터의 전체 모습이며, 상단에는 전진근(protractor)의 EMG 파형이 나타나 있습니다.중앙에는 견인근의 EMG 트레이스가 있으며, 아래에는 족근 접촉 신호가 있습니다. 삽입 그림에서는 고속 카메라로 촬영한 동물의 실제 움직임을 확인할 수 있습니다. EMG 트레이스의 교차 활동은 보행 주기 동안 두 근육의 활동에 해당합니다.프로트랙터(protractor) 근육은 스윙 단계(swing phase) 직전과 도중에 활성화되며, 리트랙터(retractor) 근육은 접지 후와 스탠스 단계(stance phase) 동안 활성화됩니다. 숙달되면 준비 과정은 90분 이내에 완료될 수 있으며, 이 절차 이후 몇 시간 동안 데이터를 획득할 수 있습니다. 개발 이후에는 운동학적 분석이나 단일 세포 기록과 같은 다른 방법들을 거의 온전한 상태의 행동 동물에서 수행할 수 있습니다.이 기술은 운동 제어 분야의 연구자들이 단일 부속지가 어떻게 유연하고 적응적인 이동 패턴을 생성하는지에 대한 문제를 해결하는 데 도움을 주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 기록하고 계량화 할 수있는 비디오 속도 추적 현미경 시스템을 개발...

C. elegans 추적 및 행동 측정

이 비디오는 자유롭게 걷는 파리를 추적하여 일반적인 운동 능력을 평가하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 비디오 추적 소프트웨어를 사용한 분석의 설정 및 데이터 분석을 보여줍니다.

자유롭게 걷는 파리 추적: 초파리의 이동을 평가하는 방법

우리는 초기 변성 단계에서 Manduca sexta에 전극을 이식하는 새로운 수술 절차를 제시합니다. 이 기술을 사용하면 신경근 조직과 기계적으로 안정적이고 전기적으로 신뢰할 수 있는 결합을 통해 비행 신경생리학 역학을 연구할 수 있습니다. 우리는 또한 곤충 요에 대한 밧줄 연구를 위한 새로운 자기 부상 플랫폼을 제시합니다.

곤충 비행 동작 모니터링에 대한 초기 변성 삽입 기술

우리는 이전에 우리가 닿는 바퀴벌레의 개별 단위의 활동을 모니터링 할 수 있습니다 바퀴벌레 뇌의 중심 단지로 사극 전선을 주입하는 기술을 개발했다. 여기에서 우리는 우리가 자유롭게 곤충을 움직이는 뇌 활동을 기록 할 수 있도록하는 기술의 수정 된 버전을 제시한다.

자유롭게 곤충 워킹 뇌 세포 와이어 사극 기록

여기서 우리는 측면 관점에서 초파리 성인 및 애벌레 돌연변이 표현형의 고품질 디지털 영상을 획득하는 간단하고 널리 접근 현미경 기술을 설명합니다.

의 고품질의 디지털 비디오 취득 초파리 측면 관점에서 애벌레 및 성인 동작

냄새 소스 지역화하는 능력 벌레의 생존에 필요한 인공 냄새 추적에 적용될 것으로 기대된다. 곤충 제어 로봇은 실제 silkmoth에 의해 구동 로봇 플랫폼을 통해 곤충의 냄새 추적 능력을 평가하기 위해 우리가 할 수있다.

곤충 제어 로봇 : 이동 로봇 플랫폼은 곤충의 냄새 추적 능력을 평가하는

이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster를 사용하여 설탕 유도 검색 행동을 기록하기 위한 행동 분석을 설명합니다. 이 분석은 먹이 및 먹이 찾기 관련 행동뿐만 아니라 기본 신경 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초파리에서 설탕 유도 국소 검색 행동 추적

이 프로토콜은 전통적인 포유류 모델에 대한 대안으로 운동 기능 장애의 정량화를 통해 초파리의 신경 독성을 평가하기 위한 고처리량, 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 민감하고 재현 가능하며 윤리적으로 유리한 모델을 사용하여 제약 화합물, 환경 제제 또는 유전자 변형의 신경독성 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다.

신경독성에 대한 판독으로서의 Drosophila melanogaster 의 운동 기능 장애에 대한 행동 분석

이 연구는 가장 큰 Lyapunov 지수(LLE)를 측정하여 C. elegans 의 운동에 대한 연령의 영향을 조사합니다. 나이가 들수록 C. elegans 는 운동 조절이 증가하고 그에 따른 감소를 보입니다. 결과는 5일 후에 LLE가 최고조에 달하고 벌레가 나이가 들면서 감소하는 것으로 나타났습니다.

Caenorhabditis elegans의 운동의 연령 의존적 역학: Lyapunov 지수 분석

학습하세요 곤충의 적응 운동 행동을 연구하는 신경과학 방법을 미끄러운 표면에서 다리 근육 활동과 접촉 신호를 동시 기록하여 운동 제어 메커니즘을 규명합니다.

곤충의 적응 운동력이있는 사람의 행동의 신경 기초를 공부

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