Name: 동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: 배우세요 동적 마스크 프로젝션 석판술을 사용하여 신경 세포 배양용 미세 패턴 듀얼 하이드로겔 시스템을 제작하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 DMD를 활용하여 신경 세포 생존율과 신경돌기 성장을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 절개와 문화를 DRG 그들의 전문 지식을 공유하기위한 교수 앤서니 Windebank의 실험실 감사의 마음을뿐만 아니라, DMD 설치에 관한 도움이 토론에 대한 교수 Shaochen 첸 것입니다. 이 연구는 리젠트의 ​​루이지애나위원회 툴란 대학 및 보조금에 의해 일부 자금했다 (LEQSF [2009-10] - RD - A - 18)와 NIH (NS065374).

1. DMD 설정 <ol><li> DMD 보드, UV 라이트 가이드 (콜리 메 이터) 및 4X 객관적인 렌즈는 모두 진동 절연 테이블에 수직으로 장착하고 있습니다. </li><li> 자외선 가이드는 빛을 45 ° 거울, 그리고 24 ° 거울의 비행기 아래 (그림 1)의 비행기에 상대의 각도로 거울 배열에 도달할 수 있도록 조정해야합니다. </li><li> 목적 렌즈는 객관적인 렌즈로 치과에서 거리는 렌즈와 관련된 초점 거리에 해당 있도록 탑재합니다. </li><li> 거꾸로 현미경은 DMD에서 반사되는 빛을 초점 현미경을 통해 시각 수 등 객관적인 렌즈, 아래 배치됩니다. 중합 표면에 목적 렌즈의 거리는 약 렌즈의 작동 거리에 해당한다. 현미경의 단계는 다음 가늘게 이미지에 초점이 거리를 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 거리는 선택된 표면 중합에 따라 달라질 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 Explant 문화를위한 듀얼 히드로겔 구성 A. DRG의 explant 부착 <ol><li> 코팅 멤브레인 자체를 피하기 위해 돌보는 비 - X 6 개 - 잘 콜라겐 코팅 세포 배양 삽입 (코닝)의 벽. (또는 소수성 장벽 펜을 사용할 수 있습니다.) </li><li> 37 ° C와 5% CO 2 배양기에서 접착 매체의 1.5 ML과 하루 수화물 삽입합니다. 접착 매체 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.5mM L - 글루타민, 20 μg / ML의 NGF와 neurobasal 매체입니다. </li><li> E - 15 쥐 새끼에서 수확 배아 등의 루트 신경 (DRG). DRG는 많은 사와 같은 삽입 당, 콜라겐 코팅 6 잘 삽입에 도금해야합니다. </li><li> 멤브레인 준수를 DRG 수 있도록 2 시간 삽입을 품어. </li></ol> B. 동적 마스크 photopolymerization 디지털 micromirror 장치 (DMD)는 선택 거울 위치에 따라 조명을 반영 프로젝션 텔레비전에서와 유사한 개별 거울,의 1024 X 768 배열입니다. 우리의 목적을 위해, DMD는 간단하고 신속한 방법으로 specifiable 히드로겔 형상을 만들고, photocrosslinkable hydrogels에 패턴 자외선 (UV) 조명하는 데 사용됩니다. 그림 1은 DMD와 자외선 경로의 설정을 묘사. 저희 DMD는 독립 실행형 장치 임에도 불구하고, 장치는 또한 여러 기존의 현미경과 함께 사용하기 위해 통합될 수 있습니다. <ol><li> 삽입의 모든 여분 액체를 제거하고 삽입 내부 중합 매체 500 μL를 추가합니다. 중합 매체는 10 % PEG (MW 1000) 및 20 μg / ML NGF와 1 %의 펜 / Strep와 보충 neurobasal 중간에 녹아있는 0.5 % Irgacure 2959이 포함되어 있습니다. </li><li> 비 - X 취급 유리 슬라이드에있는 치과 기기 아래에 삽입을 놓으십시오. </li><li> 포함된 알프 - 3 기본적인 GUI 프로그램의 사용을 통해, DMD에 "photomask"로 사용할 수있는 적절한 흑백 이미지를로드합니다. 우리 목적을 위해서도 bifurcating 형상 neurite지도 시스템의 구현에 대한 수 있도록 선정되었습니다. </li><li> 시각화를위한 거꾸로 현미경을 사용하여 DMD를 반영 가시 광원을 사용하여 photomask에 적절한 위치와 조직 explants을 맞춥니다. </li><li> UV 광원에 대​​한 가시 광원을 전환하고 crosslinking 충분한 때까지 PEG 솔루션을 조명. 삽입의 네 가지 DRG에 대한 (주어진 및 5.0 왓츠 / DMD에 cm이 사건은, crosslinking이 같은 작은 55으로 초 완료 수있는 조건.) 반복합니다. </li><li> 무균 DPBS, 1 % 펜 - Strep 각 삽입 세 번 씻으십시오. </li><li> 세포 배양 삽입 아래 1.5mL 성장 매체를 추가하고 30 분 동안 인큐베이터에서 평형 수 있습니다. 성장 매체는 2 % B - 27, 1 %의 펜 / Strep, 0.5mM L - 글루타민은, 20 μg / ML NGF가 포함된 neurobasal 매체입니다. </li></ol> C. 보조 히드로겔 Puramatrix <ol><li> 의 연결을 응용 프로그램의 경우 1 %의 Puramatrix는 무균 H 2 O에서 0.15 %로 제조 업체의 지시에 따라 희석는 1 μg / ML 용해 laminin과 보완. </li><li> 모든 초과하는 미디어는 멸균 솜 팁 작은 주걱, Kimwipe 또는 micropipette을 사용하여 DRG explants를 포함 PEG의 공백에서 제거해야합니다. </li><li> Puramatrix가 넘쳐없이 빈 공간을 채우기 위해 micropipette와 PEG의 공백에 추가됩니다. 무효 볼륨에 따라 일반적으로 1 μL를 만들마다 사용됩니다 ~. </li><li> Puramatrix가 생리적 소금 용액과 접촉 즉시 자기 조립 과정을 시작, 부풀어 PEG 즉,하지만 성장 매체의 1.5 ML는 총 겔화을 보장하기 위해 삽입 아래에 추가 한 시간 동안 인큐베이터에 배치됩니다. </li><li> 처음 Puramatrix가 약산성이므로 산도가 평형 수 있도록 한 시간 후에 미디어를 변경합니다. </li><li> 미디어 변경은 대략 매 48시간 필요합니다. 모든 미디어는 것을주의하십시오기계 약한 Puramatrix의 무결성을 보호하기 위해, 아래에 삽입 말했다. </li></ol> 아가로 오스 <ol><li> 의 연결을 응용 프로그램에 대한, 아가로 오스는 성장 매체에 1 %의 솔루션 희석되고 아가로 오스는 완전히 (~ 1 시간)까지 녹이고 60 ° C의 물을 욕조에 배치. 솔루션은 다음 1 μg / ML 용해 laminin과 보충합니다. </li><li> 모든 초과 미디어는 PEG의 공백을 제거합니다. </li><li> 아가로 오스는 넘쳐없이 빈 공간을 채우기 위해 PEG의 공백에 추가됩니다. 무효의 볼륨에 따라 일반적으로 1 μL를 만들마다 사용됩니다 ~. </li><li> 성장 매체의 1.5 ML은 6 잘 플레이트 (8 ° C) 미리 차게하고, 아가로 오스가 들어있는 삽입을하는 아가로 오스를 허용하도록 냉각 매체로 전송하고 적어도 3 분 8 ° C에서 냉장고에 유지 젤. </li><li> 마지막으로, 삽입은 미리 예열 성장 매체의 1.5 ML (37 ° C)로 전송 37에서 인큐베이터에 유지됩니다마다 48 시간 필요한 미디어의 변화와 함께 ° C. </li></ol> 3. 듀얼 히드로겔 3D 셀 캡슐화 어떤 자기 조립 젤을 사용하면 듀얼 히드로겔 캡슐이 적합합니다. photocrosslinkable 젤이 경우 PEG에서 예를 Puramatrix 또는 아가로 오스 들어, 자기 조립 젤의 기하 프레 젠 테이션에 대해 구조적 지원 역할을합니다. 방법 중 일부, 특히 photomask의 젤과 선택의 유형은 특정 원하는 응용 프로그램에 따라 달라집니다. <ol><li> DMD에 적절한 마스크를로드합니다. 우리의 응용 프로그램, 세포 생존을 위해, 우리는 단순히 세포의 이미징에 투입 Puramatrix의 원통형 프레 젠 테이션을 선택했습니다. 세포 신호를 공부 연구자 chemotactic 분자의 확산 있도록 compartmental 기하학에 관심이 있으실 것으로 생각됩니다. 또한 동맥의 대략 근사치는 혈관 연구하는 것이 가능 응용 프로그램을 상징하는 표시했다. </li><li> 비 - X 코팅 슬라이드에 DMD 아래 폴리 에스테르 세포 배양 비 - X로 삽입하고, 장소의 벽을 취급. </li><li> 삽입 중합 매체 500 μL를 추가합니다. 55초에 대한 자외선에 노출에 의해 PEG의 crosslinking을 유도. </li><li> 무균 DPBS, 1 % 펜 - Strep로 세 번 씻으십시오. </li><li> PEG의 공백에서 모든 여분의 미디어를 제거합니다. </li><li> 펠렛에 원하는 농도에서 세포를 스핀 다운. 케어는 Puramatrix은 소금 용액과 접촉 즉시 자기 조립을 시작으로, 전에 혼합하기 위해 세포 펠렛에서 모든 미디어를 제거로 이동합니다. 무균 H 2 O로 희석 0.15 %의 Puramatrix 내부의 세포를 중지 10 %의 자당과 보충. </li><li> PEG의 공백 내부 Puramatrix / 셀 / 자당 혼합물을 주입. </li><li> 삽입 아래 성장 매체의 1.5 ML를 추가, 한 시간 동안 인큐베이터 안에서 젤 수 있습니다. </li><li> 일시간 후 미디어를 변경하고 이후 매 48 시간 ~. </li></ol> 4. 싱글 히드로겔 3D 셀 캡슐화 단일 히드로겔 캡슐은 세포가 photocrosslinkable 히드로겔 내부 검사 수있는 모든 상황에 맞는 것입니다. <ol><li> DMD에 적절한 마스크를로드합니다. 세포 생존 연구, 우리는 다시 실린더를 나타내는 기본적인 원형 마스크를 선택했습니다. 방법 4에 표시된 것과 유사한 마스크는 다시 해당 연구 분야에 대한 적용 수 있습니다. </li><li> 비 - X 코팅 슬라이드에 DMD 아래 폴리 에스테르 세포 배양 비 - X로 삽입하고, 장소를 취급. </li><li> 어떤 원하는 농도에서 세포는 동질적인 유통을 위해 잘 혼합, 10 % PEG 솔루션에 직접 추가할 수 있습니다. </li><li> 삽입 중합 매체 500 μL를 추가합니다. 55초에 대한 자외선에 노출에 의해 PEG의 crosslinking을 유도. </li><li> 무균 DPBS, 1 % 펜 - Strep로 세 번 씻으십시오. </li><li> 매 ~ 이일 변화, 아래와 삽입 위에 두 성장 매체로 채웁니다. </li></ol> 5. 박막 히드로겔 중합 <ol><li> DMD에 적절한 마스크를로드합니다. </li><li> 비 - X 코팅 슬라이드에 콜라겐 - 코팅 폴리 에스테르 세포 배양 비 - X로 삽입하고, 장소를 취급. </li><li> 그냥 삽입 (6 웰 플레이트에 삽입을위한 ~ 250-300 μL)의 하단을 충당하기 위해 충분한 중합 매체를 추가합니다. 미디어가 실온에서 30-45분에 대한 삽입 막에 침투 수 있습니다. </li><li> micropipette 또는 Kimwipe와 삽입의 초과 중합 매체를 제거합니다. 완전히 삽입의 바닥을 커버하기 위해 UV - 투명 오일 충분한 양의를 추가합니다. 삽입 중합 매체 포화 삽입 막 위에 서로 다른 계층을 형성하는 기름 오랫동안, 상온에서 15~30분 위해 앉아 수 있습니다. </li><li> DMD 아래 삽입하고 슬라이드를 놓습니다. 자외선에 노출에 의해 PEG의 crosslinking을 유도. 때문에 PEG 층의 두께의 crosslinking은 치과에서 5.0 왓츠 / cm 2 사건에서와 같은 작은 15 초 완성하실 수 있습니다. </li><li dpbs strep><li> 6 잘 조직 배양 플레이트에 삽입을 저장합니다. 원하는 농도에 일시 중지 세포 성장 매체를 추가하고 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 세포 배양 삽입 내부의 세포 현탁액의 충분한 볼륨을 피펫. 그런 다음, 완전히 세포 생존 (~ 1.5 ML)를 유지하기 위해 삽입 아래의 충분한 성장 매체를 추가합니다. </li><li> 48 시간 경과 후에는 모든 unadhered 세포를 이동시키다하는 살균 DPBS 1 %의 펜 - Strep로 삽입을 세 번 씻으십시오. 대략 매 48시간 한 미디어를 변경합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 듀얼 히드로겔의 예로는 DRG explants를 포함하는 것은 그림 2에 표시됩니다 구조. 셀룰러 마이 그 레이션 및 neurite 확장이 세포 허용 듀얼 히드로겔 지역의 건설로 제한됩니다 것을 확인할 수 있습니다. 그림 3은 듀얼 히드로겔 구조 내부 마찬가지로 캡슐 dissociated 세포를 묘사. DMD의 photomask의 동적 특성으로 인해 캡슐에 사용할 수있는 도형은 광학의 크기와 해상도에 의해 제한됩니다. 셀 캡슐 하나의 photopolymerizable 히드로겔, PEG 안에 수도 있었고, 죽은 / 라이브 생존 능력 시험은 그림 4 입증 수행되었다. PEG의 캡슐화는 PEG는 신경 세포에 이상적인 환경을 대표하지 않는 등, 단 예로위한 것입니다. 따라서, 우리 PEG 구조의 실현 세포 생존은 당연하게도 낮습니다. 마지막으로, 세포 배양 삽입에서 세포 유착에 대한 패턴 제한 레이어 얇은 PEG 필름을 활용의 예는 그림 5에 표시됩니다. 또한, 가능 "나쁜"결과의 예는 그림 6에서 제공됩니다. 그 결과 우리가 실험실에서 개발된 방법의 가능한 사용의 작은 파편만이 나타냅니다. 그들은 쉽게, 다재 다능한 우리의 접근의 가능성을 입증하기위한 있으며, 연구자들이 자신의 가능성 adaptations을 개발하는 "원칙의 증거"로 취급 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 석판술에 사용되는 빛의 경로의 도식 그림. 삽입된 페이지 : 자외선은 45 °와 미러 배열의 비행기 아래에 24 °의 각도로 치과를 조명. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 이중 히드로겔 구조를 포함하는 DRG가 표시 성장 및 확산. 베타 III의 tubulin (녹색), DAPI 스테인드 세포 핵 (파란색)으로 표시 neurites과 polymerized PEG 구조 (회색)을 portraying AD) 이미지. DRG explants는 Puramatrix에 포함되어 분기점 (들)을 향해 성장 neurites과 패턴의 원형 지역에 위치하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 성장 매체 48 시간 후 calcein AM, 라이브 세포 마커와 레이블 세포를 포함하는 이중 히드로겔 구조. AD) dissociated DRG의 신경을 ​​(~ 5x10 3 셀 / ML)이있는 Puramatrix 가득한 다양한 PEG 모양. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 단일 히드로겔이 (5x10 3 셀 / ML) 성장 매체 24 시간 후에 ethidium homodimer - 1 (빨간색)으로 표시 Calcein AM (녹색)와 죽은 세포와 레이블 라이브 세포를 포함하는 개념입니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 셀 제한 PEG 선택적으로 투과 지원의 콜라겐 코팅 멤브레인에 dissociated 세포를 준수하는 "테스트 패턴"을 사용하여 박막으로 polymerized. 죽은 세포가 ethidium homodimer - 1 (빨간색)으로 표시하는 동안 A, B) 라이브 세포는 Calcein AM (녹색) 48 시간 후에 표시됩니다. 최소 세포 접착은 얇은 PEG 필름을 포함하는 지역에서 발생합니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 바람직하지 결과의 대표 이미지를 표시합니다. A) 사용할 수 없게 PEG로 이어지는 PEG의 부분 중합은 개념입니다. 부적 절한 중합은 사전 폴리머 매체 중합 매체의 부족 금액, 부족 자외선 노출이나 광학의 부적 절한 초점에 초승달 모양의 존재로 인해 발생할 수 있습니다. B) 베타 III의 tubulin (녹색), DAPI 스테인드 세포 핵 (파란색)으로 표시 neurites과 polymerized PEG 구조 (회색)을 portraying 이미지. neurites는 패턴 PEG 채널 이외의 성장 수있었습니다. 이것은 종종 조건에서 발생되는 주입하는 동안 PEG 부분 위에 Puramatrix가 넘치 거든.

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</ol>

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여기 설명되어있는 방법은 간단하고 재현성 세포 배양 시스템을 추구하는 탐정에 의해 사용될 수 있습니다. 이론적으로 가능한 photopolymerizable hydrogels의 다양한 때문에, 환경은 전체 조직 explants 포함한 모든 세포 유형과 함께 사용할 수 있도록 맞춤 수 있습니다. 또한, 듀얼 히드로겔 시스템은 자신에 비정질 형태를 형성하는 경향이 자기 ​​polymerizing hydrogels의 프레 젠 테이션에 개선 공간적 제어를위한 수 있습니다. 그 결과 &quot;2.5D&quot;micropatterned의 히드로겔 구조 편리 미세한 평가 수있는 2D 구성에서 제시 신경 성장을위한 3D 매트릭스를 제공합니다. 젤이 polymerized하고있는 기판은 또한 실험적인 디자인의 큰 제어를위한 수 있도록 다양한 수 있습니다. 우리의 방법은 우리가 유리 슬라이드 (데이터가 표시되지 않음)에서 중합에 비해 향상된 생존 능력 (그림 4)을 볼 수 있으므로, 세포 배양 투과의 지원과 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 그러나, 다른 중합 표면은 다른 응용 프로그램에 대한 자세한 적용 수 있습니다 유리 제조 예를 들어, microfluidics 실험이나 세포 집계 형성에 사용 슬라이드. 이러한 문화 시스템과 우리의 경험은 어려움의 잠재적인 영역의 식별하게되었다. 첫째,주의 방법은 구성의 불임을 유지하기 위해 필요합니다. DMD 설치의 부피가 큰 특성으로 인해, 그것은 무균 조건 하에서 중합 단계를 작동하기가 어렵습니다. 이 문제를 방지하려면 방법에서 설명한 헹굼 단계에서 도움이되며, 항생제는 모든 미디어에 사용해야합니다. 또한, polymerized 구조의 최종 두께와 모양은 사전 폴리머 혼합물의 유동적인 행동에 크게 의존하고, 초승달 모양의 존재는 (그림 6) 너무 얇은 또는 불완전 polymerized 아르 겔 구성이 발생할 수 있습니다. 두 단계는 세포 배양 삽입 내부 초승달 모양의 형성을 최소화하기 위해 취할 수 있습니다. 두꺼운 hydrogels (&gt; 200 μm의) 삽입의 내부 벽 주위에 비가 X의 단순 코팅 충분하십시오. 그러나, 같이 간단히 얇은 구조 (&lt;200 μm의)을 위해, 위에서 설명한, 기름 층이 모두 초승달 모양을 최소화하고 자유 라디칼 중합의 산소 담금질을 깨뜨릴 필요합니다. 해상도가 점점 두꺼운 젤로 실현 기능의 크기 감소와 함께, 두께에 좌우 되는것 발견되었습니다. 해상도는 또한 기능은 히드로겔에 긍정적이거나 부정적인 구제를 표현 여부에 따라 다양. 그러나, 우리는 광학을 집중로만 현미경 목표를 사용하여 ~ 100 μm의 규모에 대한 최소한의 기능 크기와 구조에 대한 충분한 해상도를 달성했습니다. 우리의 실험은 여기에서 설명한 이중 히드로겔 구조가 neurite 성장과지도의 기본에 - 체외 모델의 형성을위한 훌륭한 기초를 대표하는 것으로 나타났습니다. 고용 micropatterning 기술은 기존의 방법 18,19의 적응이지만, 우리의 세트 업 디자인을 구현하는 간단한을 강조하고 세포 배양 삽입에 듀얼 히드로겔 구성 생산에 최적화된되었다; 세포 배양 삽입뿐만 아니라 세포 생존을 향상 줬어요 이전 자기편 조직 explants 주변 crosslinking로. 표시된 결과의 범위는 우리 연구소의 이익에 의해 제한되지만, 우리는이 책자에서 설명하는 방법 3D 세포 배양의 제조에 대해 상대적으로 싸고, 빠르고 사용하기 쉬운 방법을 찾고 연구에 유용하게 될 것입니다 모델.

<table><tbody><tr><td>디지털 마이크로미러 소자(Digital Micromirror Device)</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 코팅 트랜스웰 투과성 지지체(Collagen Coated Transwell Permeable Support)</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>원고 내에서는 세포 배양 인서트(Cell Culture Insert)로도 지칭됨</td></tr><tr><td>폴리에스테르 트랜스웰 투과성 지지체(Polyester Transwell Permable Support)</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>원고 내에서는 세포 배양 인서트(Cell Culture Insert)로도 지칭됨</td></tr><tr><td>Neurobasal 배지</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>신경 성장 인자(Nerve Growth Factor)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(B-27 Supplement)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>오일(Oil)</td><td>카놀라유와 실리콘 오일 모두 사용함</td><td></td><td>UV 투과성이 있어야 하며, 메니스커스(meniscus) 형성을 최소화해야 함</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 micropatterned hydrogels의 제작

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

점점, 패턴의 세포 배양 환경은 세포 특성을 연구하기위한 관련 기술되고 있으며, 많은 연구자들은 더 나은 1-3 생체내 특성의 모방 체외 실험에서 나타내는 3 차원 환경을 필요로 믿습니다. 이러한 암 연구 4, 신경 공학 5, 심장 생리학 6 및 세포 - 매트릭스 7,8 상호 작용과 같은 분야의 연구는 세포의 행동은 전통적인 monolayer 문화 및 3D 구조 사이에 크게 차이가 나타났습니다. Hydrogels 때문에 그들의 다양한 다재 다능한 및 9-12 작용화 통해 맞게 분자 구성 능력의 3D 환경으로 사용됩니다. 수많은 기법 electrospinning 13 엘라스토머 우표를 포함하여 14 셀 - 지원 매트릭스로 구성 창조를 위해 존재하는, 잉크젯 인쇄 15, 첨가제 photopatterning 16, 정적 photomask 프로젝션 리소그래피 - 17과 동적 마스크 microstereolithography 18. 불행히도, 이러한 방법은 여러 생산 단계 및 / 또는 기존의 세포 및 조직 배양 방법에 쉽게 적응하지 장비를 포함하고 있습니다. 이 프로토콜에 채용된 기술은 UV 시작한 자유 라디칼 중합을 통해 유도된 crosslinking 기하학적으로 구체적인 쓰임새 (에틸렌 글리콜) (PEG) hydrogels에 대한 동적 photomasks을 생성하기 위해 디지털 micromirror 장치 (DMD)를 사용하여, 후자의 두 가지 방법을 적응. 그 결과 &quot;2.5D&quot;구조는 신경 성장을위한 제한된 3D 환경을 제공합니다. 우리는 PEG는 Puramatrix 또는 아가로 오스 중 하나에서 만들어진 달리 못생긴하지만 휴대 허용 자체 조립 젤로 휴대 제한 지역 공급 구조 역할을하는 듀얼 히드로겔 접근 방식을 사용합니다. 이 과정은 기존의 세포 배양 방법 및 기판와 함께 사용하기위한 높은 재현성 쉽게 적응하는 빠르고 간단한 한 단계의 제조이다. 이러한 배아 등의 루트 신경 (DRG)로 전체 조직 explants는, 같은 neurite 가지로 실험 assays를위한 듀얼 히드로겔 구성에 포함될 수 있습니다. 또한, dissociated 세포는 photocrosslinkable 또는 자체 polymerizing 히드로겔에 캡슐이 될 수도 있고, 선택 셀 제한 photopatterning를 사용하여 투과 지원 막을 준수. DMD를 사용하여, 우리는 히드로겔 두께 ~ 1mm까지 구성하지만, 박막은 (&lt;200 μm의) PEG 구조가 자유 라디칼 중합 반응의 산소 담금질에 의해 제한되었다 만들었습니다. 우리는 이후 얇은 PEG 구조 중합을 허용 중합 액체 위에 기름 층을 활용하는 기술을 개발했습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 microfabricated 신경 세포와 조직 문화의 생산을위한 3D 히드로겔 시스템의 급속한 생성을 설명합니다. 시연 듀얼 히드로겔 구조 언급된 세포 생존, 마이 그 레이션 및 / 또는 neurite 성장과지도를 포함한 신경 과학의 연구에 유용 될 수 있습니다 체외 모델에서 다목적 나타냅니다. 또한, 프로토콜 hydrogels 및 세포의 여러 유형에 대해 작업할 수 있듯이, 잠재적인 응용 프로그램은 다양하고 광대한 모두 있습니다.

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

패턴화된 세포 배양 환경은 세포 특성을 연구하기 위한 유용한 기술로 점점 더 주목받고 있으며, 많은 연구자들은 ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 신경 연구를 위한 미세 패턴화된 이중 하이드로젤 세포 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아 배측 신경절(dorsal root ganglia)과 같은 조직 이식물을 투과성 세포 배양 인서트에 도말합니다. 그 다음, 디지털 미세 거울 소자(digital micro mirror device, DMD)를 동적 광마스크로 사용하여 광가교성 하이드로젤 내에 미세 패턴을 생성합니다.이어서 해리된 세포 현탁액이 포함될 수 있는 pure와 같은 자가 조립 하이드로젤을 첨가합니다. 세포 분석 전에는 적절한 배양 시간이 필요합니다. 최종적으로 DMD에 의해 정의된 특정 기하학적 구성에 따른 신경 세포 생존율과 신경 돌기 성장을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 투과성 세포 배양 인서트와 같은 거의 모든 기판에 맞게 동적인 광 질량을 빠르게 생성, 수정 및 원거리에서 투사할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 신경계에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 신호 전달, 세포 이동, 세포 간 접촉 또는 형태 형성 등 구체적인 기하학적 제약이 필요한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. DMD 보드, UV 광원 가이드 및 4배 대물렌즈는 모두 진동 격리 테이블 위에 수직으로 장착되어 있습니다.DMD에서 반사된 초점광을 현미경을 통해 시각화할 수 있도록 도립 현미경을 대물렌즈 아래에 배치합니다. DMD 설정에 관한 자세한 내용은 동봉된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 먼저, X explant 배양물을 접종할 6-웰 콜라겐 코팅 세포 배양 인서트를 준비하고, 멤브레인 자체에 닿지 않도록 주의하며 세포 배양 인서트의 벽면을 rain X로 코팅합니다.그 다음, 인서트에 aian 배지 1.5 milliliters를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, E 15 쥐 새끼로부터 배아 등쪽뿌리신경절(DRG)을 수확한 후, 콜라겐 코팅된 6-well 인서트 각각에 최대 4개의 DRG를 플레이팅하고, DRG가 막에 부착될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양합니다.배양 기간이 끝나면, DRG는 광중합 준비가 완료됩니다. 디지털 미세 거울 소자(DMD)는 1024 by 768 배열의 개별 거울로 구성되며, 거울의 위치에 따라 빛을 선택적으로 반사합니다. 본 절차에서는 DMD를 사용하여 광 CRO, 즉 연결 가능한 하이드로겔에 자외선을 패턴화함으로써, 단순하고 신속한 방식으로 지정된 하이드로겔 기하학적 구조를 생성합니다.저희의 DMD는 독립형 장치이지만, 많은 기존 현미경과 통합하여 사용할 수도 있습니다. 먼저, 인큐베이터에서 DRGX 식물을 꺼내어 인서트 내의 모든 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 인서트 내부에 500 µL의 중합 배지를 추가합니다.DRGX 식물이 포함된 인서트를 레인 엑스트레(rain extre) 유리 슬라이드로 옮긴 후, 슬라이드를 DMD 아래에 배치합니다. ALP three 기본 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램을 사용하여 포토마스크로 사용할 흑백 이미지를 DMD에 로드합니다. 본 실험에서는 도립 현미경과 DI 가시광선 광원을 이용한 신경돌기 유도 시스템을 구현하기 위해 분지형 모양을 선택하였습니다.DMD에서 반사되는 빛을 가이드로 삼아 조직 절편을 포토마스크의 적절한 위치에 맞춥니다. 다음으로, 가시광선 광원을 UV 광원으로 교체합니다. 세포 배양액 내부의 중합 매질을 조사합니다.PEG의 가교 결합이 완료될 때까지 삽입하십시오. 인서트에 있는 각 DRG에 대해 이 과정을 반복하십시오. 그런 다음 1% penicillin streptomycin이 포함된 멸균 인산염 완충 식염수로 각 인서트를 세 번 세척하십시오.마지막으로, 세포 배양 인서트 아래에 성장 배지 1.5 milliliters를 추가하고 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 30분 동안 평형을 맞춥니다. 배양 기간 동안, 순수 매트릭스를 30분 동안 초음파 처리합니다. 펩타이드를 가용화하기 위해 제공된 1%solution을 멸균수에 0.15%로 희석하고, 1 microgram per milliliter의 가용성 laminin을 첨가합니다.30분 후, 인큐베이터에서 배양물을 꺼내 인서트에서 과잉 배지를 모두 흡입하여 제거합니다. 그다음 현미경으로 보이드(void)를 관찰하면서, DRGX explan이 포함된 PEG 구조체의 보이드 영역 내부에서 배지를 흡입하여 제거합니다. X explan 주변의 보이드 내에 순수 매트릭스 용액 약 1 µL를 피펫으로 분주합니다. 이때 순수 매트릭스가 페그 보이드 밖으로 넘치지 않도록 주의하십시오.그 후 인서트 아래에 성장 배지 1.5 milliliters를 피펫으로 넣고 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에 1시간 동안 보관합니다. 이 시간이 지난 후 완전히 적응되었는지 확인하기 위해 성장 배지를 교체하고 배양물을 다시 인큐베이터로 옮깁니다. 성장 배지는 배양 48 hours마다 교체합니다.DRGX 식물을 포함하는 이중 하이드로겔 구조물의 예가 여기에 제시되어 있습니다. DRGX 식물은 성장 및 증식 마커로 라벨링되었습니다. 중합된 PEG 구조물은 회색으로 보이며, beta three tubulin으로 라벨링된 DRG NEURITES는 녹색으로 나타나고, DPI 염색된 세포핵은 파란색으로 보입니다.세포 이동과 망상 돌기 확장이 이중 하이드로젤 구조의 세포 허용 영역으로 제한됨에 유의하십시오. 이중 하이드로젤 캡슐화는 자가 조립 젤과 광가교 가능 젤을 함께 사용할 때 적합합니다. 이 경우, PEG는 자가 조립 젤의 기하학적 배치를 위한 구조적 지지체 역할을 합니다.예를 들어, 순수 매트릭스 또는 aris가 있습니다. 겔의 종류와 포토마스크의 선택은 구체적으로 원하는 응용 분야에 따라 달라집니다. 이전에 입증된 바와 같이, Rain-X를 사용하여 폴리에스테르 세포 배양 인서트의 벽면을 처리하십시오.인서트를 Rain X가 코팅된 슬라이드 위로 옮겨 DMD 아래에 배치합니다. 다음으로, 인서트에 중합 배지 500 µL를 첨가합니다. 이번 생존 실험에 적합한 마스크를 DMD에 로드합니다.세포 이미징을 돕기 위해 순수 매트릭스의 원통형 프레젠테이션이 사용됩니다. 가교 결합 후, 인서트를 UV 광선에 55초 동안 노출시켜 PEG 가교 결합을 유도합니다. 새로 형성된 공극을 멸균된 DPBS와 1% pen strep으로 세척합니다.마이크로 피펫이나 멸균 면봉을 사용하여 공극 내의 모든 과잉 액체를 제거합니다. Matrixx 순수 용액을 30분 동안 초음파 처리하여 준비하고, 1 µg/mL의 수용성 laminin과 10% sucrose가 첨가된 멸균수에 0.15% 농도로 희석합니다. 그다음, 배양할 세포를 원심분리하여 펠렛 형태로 만듭니다.세포 펠릿으로부터 배지를 완전히 흡입하여 제거하고, 0.15% pure matrix 용액에서 약 5×10³ cells/mL의 농도로 펠릿을 재부유시킵니다. pure matrix는 염 용액과 접촉하면 자가 조립이 시작되므로, 세포 펠릿에서 모든 배지를 흡입하여 제거하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 보충제가 첨가된 pure matrix 세포 혼합액 약 1 µL를 피펫으로 peg void에 분주합니다.이 부피는 보통 피펫 1.5 milliliters의 성장 배지를 인서트 아래에 채워 넘치지 않게 빈 공간을 채우기에 충분합니다. 그다음, 순수 매트릭스 2차 하이드로겔을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 완전한 겔화를 유도합니다. 이 시간이 지난 후, 배지를 흡입하여 제거하고 인서트 아래에 신선한 배지를 추가합니다. 이때 기계적으로 취약한 순수 매트릭스가 손상되지 않도록 주의하십시오.배양물을 조직 배양 인큐베이터로 옮기고, 배양 48시간마다 배지를 교체하십시오. 다음은 다양한 이중 하이드로젤 구조체 내에 캡슐화된 살아있는 DRG 뉴런의 예시입니다. 성장 배지에서 48시간 후에, 세포를 녹색으로 나타나는 생세포 마커인 calcium am으로 라벨링하였습니다.여기서는 DMD 포토 마스크의 동적인 특성 덕분에, 캡슐화에 사용할 수 있는 기하학적 구조가 광학 장치의 치수와 해상도에 의해서만 제한됩니다. 세포를 폴리에스터 세포 배양과 유사하게 광가교성 하이드로젤 내부에서 관찰할 수 있는 경우, 단일 하이드로젤 캡슐화가 적합합니다. Rain-X를 사용하여 삽입한 후, Rain-X가 코팅된 슬라이드 위에 두고 DMD 아래에 배치하십시오.이전과 마찬가지로, 배양할 세포를 원하는 농도로 중합 배지에 직접 피펫팅하고 잘 섞어 균일하게 분포하도록 합니다. 그런 다음 중합 배지가 혼합된 세포액 500 µL를 인서트에 피펫팅합니다. 적절한 마스크를 선택하여 DMD에 로드하고, 55초 동안 UV 광선에 노출시켜 PEG 가교를 유도합니다.세포 생존 연구를 위해, 기본 원형 마스크를 사용하여 실린더를 나타냅니다. 인서트를 멸균된 DPBS와 1% pen strep으로 3회 세척한 다음, 인서트 아래에 1.5 milliliters의 성장 배지를 피펫으로 분주하고 인서트가 완전히 잠길 만큼의 충분한 성장 배지를 상단에 추가합니다. 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 조건에서 배양하며 48시간마다 배지를 교체합니다. 다음은 PEG 내부에 캡슐화된 살아있는 해리된 피질 뉴런의 예시입니다. 살아있는 세포는 calcium am으로 표지되어 녹색으로 나타나며, 죽은 세포는 ahy homodimer one으로 표지되어 적색으로 나타납니다.PEG 캡슐화는 단지 예시로 제시된 것이며, PEG가 신경 세포에 이상적인 환경을 제공하는 것은 아닙니다. 선택된 기하학적 구조는 세포 생존력을 연구하기 위한 간단한 수단을 나타내지만, 광범위한 구조로 변경하여 적용할 수 있습니다. 박막 하이드로젤을 사용하여 제한된 세포의 특정 패턴을 생성할 수 있습니다.앞서와 마찬가지로 폴리에스테르 세포 배양 인서트를 Rain X로 처리한 후, Rain X 처리된 슬라이드 위에 놓습니다. 그런 다음 중합 배지 250 내지 300 µL를 처리된 세포 배양 인서트 바닥에 피펫팅합니다. 이 부피는 인서트 바닥을 겨우 덮을 정도의 양이며, 배지가 인서트 막에 스며들 수 있도록 실온에서 30 내지 45분 동안 배양합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 인서트에서 과량의 배지를 흡입하여 제거합니다.그 다음, 인서트 바닥에 UV 투과성 오일을 충분한 양으로 피펫팅하여 해당 영역을 완전히 덮습니다. 오일이 중합 배지 위에 뚜렷한 층을 형성할 수 있도록 인서트를 실온에서 15분에서 30분 동안 배양합니다. 인서트 막을 포화시킨 후 DMD에 적절한 마스크를 로드합니다.인서트와 슬라이드를 DMD 아래에 배치한 후, UV 광선에 노출시켜 페그(peg) 가교를 유도합니다. 멸균된 DPBS와 1% pen strap으로 인서트를 세 번 세척한 다음, 인서트를 6-웰 조직 배양 플레이트로 옮겨 배양할 세포를 수확하고 펠렛화합니다. 배지를 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 mL당 10⁴에서 10⁶ cells 사이의 원하는 농도로 성장 배지에 재현탁합니다.그런 다음, 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 세포 배양 인서트 내부에 충분한 부피의 세포 현탁액을 피펫으로 분주합니다. 세포 생존력을 완전히 유지할 수 있도록 인서트 아래에 충분한 성장 배지를 추가합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양합니다.멸균된 DPBS와 1% pen strep으로 인서트를 3회 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 그 후 웰에 신선한 성장 배지를 추가합니다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 48시간마다 배지를 교체합니다.여기에서는 세포 제한적 PEG를 테스트 패턴을 사용하여 박막으로 중합함으로써, 분리된 세포를 투과성 지지체의 콜라겐 코팅 막에 선택적으로 부착시켰습니다. 세포는 48시간 배양 후 라벨링되었습니다. Calcein AM으로 라벨링된 살아있는 세포는 녹색으로 나타나며, Ethidium homodimer-1로 라벨링된 죽은 세포는 빨간색으로 나타납니다.얇은 PEG 필름이 포함된 영역에서는 세포 부착이 최소한으로 일어나는 것을 확인할 수 있습니다. 이는 바람직하지 않은 결과의 한 예입니다. PEG의 부분 중합으로 인해 사용할 수 없는 PEG 구조체가 형성되었습니다.프리폴리머 배지 내의 메니스커스 형성, 폴리머화 매질의 양 부족, 불충분한 UV 노출 또는 광학 장치의 초점 불량으로 인해 부적절한 폴리머화가 발생할 수 있습니다. 이는 A-D-R-G-X 식물 배양의 불량한 듀얼 하이드로겔 3D 캡슐화 사례입니다. 이 이미지에서 녹색으로 보이는 신경돌기가 패턴화된 페그 채널 외부로 성장했음을 확인할 수 있습니다.이는 주입 중에 순수 매트릭스가 PEG 부분 위로 넘쳐흐를 때 자주 발생합니다. 이 절차를 따르십시오. 전기생리학적 특성이나 표현형 발현과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 패치 클램핑이나 면역조직화학 염색과 같은 다른 표준 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 신경세포 배양 연구를 위해 단일 또는 이중 하이드로젤 시스템의 기하학적 형태를 지정하는 동적 마스크 투영 포토리소그래피(dynamic mask projection photolithography) 사용법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

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우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

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우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

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이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.

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여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

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우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

마이크로미터 규모의 3D 프린팅을 통해 신경 세포 배양을 위한 고분자 장치의 신속한 프로토타이핑이 가능합니다. 원리 증명으로, 뉴런 사이의 구조적 연결은 신경돌기 성장에 영향을 미치는 장벽과 채널을 만들어 제한되었으며, 이러한 조작의 기능적 결과는 세포 외 전기 생리학에 의해 관찰되었습니다.

2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

배우세요 동적 마스크 프로젝션 석판술을 사용하여 신경 세포 배양용 미세 패턴 듀얼 하이드로겔 시스템을 제작하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 DMD를 활용하여 신경 세포 생존율과 신경돌기 성장을 연구하는 데 활용됩니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

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