동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

본 실험 절차의 전반적인 목적은 신경 연구를 위한 미세 패턴화된 이중 하이드로젤 세포 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아 배측 신경절(dorsal root ganglia)과 같은 조직 이식물을 투과성 세포 배양 인서트에 도말합니다. 그 다음, 디지털 미세 거울 소자(digital micro mirror device, DMD)를 동적 광마스크로 사용하여 광가교성 하이드로젤 내에 미세 패턴을 생성합니다.

이어서 해리된 세포 현탁액이 포함될 수 있는 pure와 같은 자가 조립 하이드로젤을 첨가합니다. 세포 분석 전에는 적절한 배양 시간이 필요합니다. 최종적으로 DMD에 의해 정의된 특정 기하학적 구성에 따른 신경 세포 생존율과 신경 돌기 성장을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 투과성 세포 배양 인서트와 같은 거의 모든 기판에 맞게 동적인 광 질량을 빠르게 생성, 수정 및 원거리에서 투사할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 신경계에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 신호 전달, 세포 이동, 세포 간 접촉 또는 형태 형성 등 구체적인 기하학적 제약이 필요한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. DMD 보드, UV 광원 가이드 및 4배 대물렌즈는 모두 진동 격리 테이블 위에 수직으로 장착되어 있습니다.

DMD에서 반사된 초점광을 현미경을 통해 시각화할 수 있도록 도립 현미경을 대물렌즈 아래에 배치합니다. DMD 설정에 관한 자세한 내용은 동봉된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 먼저, X explant 배양물을 접종할 6-웰 콜라겐 코팅 세포 배양 인서트를 준비하고, 멤브레인 자체에 닿지 않도록 주의하며 세포 배양 인서트의 벽면을 rain X로 코팅합니다.

그 다음, 인서트에 aian 배지 1.5 milliliters를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, E 15 쥐 새끼로부터 배아 등쪽뿌리신경절(DRG)을 수확한 후, 콜라겐 코팅된 6-well 인서트 각각에 최대 4개의 DRG를 플레이팅하고, DRG가 막에 부착될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 기간이 끝나면, DRG는 광중합 준비가 완료됩니다. 디지털 미세 거울 소자(DMD)는 1024 by 768 배열의 개별 거울로 구성되며, 거울의 위치에 따라 빛을 선택적으로 반사합니다. 본 절차에서는 DMD를 사용하여 광 CRO, 즉 연결 가능한 하이드로겔에 자외선을 패턴화함으로써, 단순하고 신속한 방식으로 지정된 하이드로겔 기하학적 구조를 생성합니다.

저희의 DMD는 독립형 장치이지만, 많은 기존 현미경과 통합하여 사용할 수도 있습니다. 먼저, 인큐베이터에서 DRGX 식물을 꺼내어 인서트 내의 모든 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 인서트 내부에 500 µL의 중합 배지를 추가합니다.

DRGX 식물이 포함된 인서트를 레인 엑스트레(rain extre) 유리 슬라이드로 옮긴 후, 슬라이드를 DMD 아래에 배치합니다. ALP three 기본 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램을 사용하여 포토마스크로 사용할 흑백 이미지를 DMD에 로드합니다. 본 실험에서는 도립 현미경과 DI 가시광선 광원을 이용한 신경돌기 유도 시스템을 구현하기 위해 분지형 모양을 선택하였습니다.

DMD에서 반사되는 빛을 가이드로 삼아 조직 절편을 포토마스크의 적절한 위치에 맞춥니다. 다음으로, 가시광선 광원을 UV 광원으로 교체합니다. 세포 배양액 내부의 중합 매질을 조사합니다.

PEG의 가교 결합이 완료될 때까지 삽입하십시오. 인서트에 있는 각 DRG에 대해 이 과정을 반복하십시오. 그런 다음 1% penicillin streptomycin이 포함된 멸균 인산염 완충 식염수로 각 인서트를 세 번 세척하십시오.

마지막으로, 세포 배양 인서트 아래에 성장 배지 1.5 milliliters를 추가하고 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 30분 동안 평형을 맞춥니다. 배양 기간 동안, 순수 매트릭스를 30분 동안 초음파 처리합니다. 펩타이드를 가용화하기 위해 제공된 1%solution을 멸균수에 0.15%로 희석하고, 1 microgram per milliliter의 가용성 laminin을 첨가합니다.

30분 후, 인큐베이터에서 배양물을 꺼내 인서트에서 과잉 배지를 모두 흡입하여 제거합니다. 그다음 현미경으로 보이드(void)를 관찰하면서, DRGX explan이 포함된 PEG 구조체의 보이드 영역 내부에서 배지를 흡입하여 제거합니다. X explan 주변의 보이드 내에 순수 매트릭스 용액 약 1 µL를 피펫으로 분주합니다. 이때 순수 매트릭스가 페그 보이드 밖으로 넘치지 않도록 주의하십시오.

그 후 인서트 아래에 성장 배지 1.5 milliliters를 피펫으로 넣고 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에 1시간 동안 보관합니다. 이 시간이 지난 후 완전히 적응되었는지 확인하기 위해 성장 배지를 교체하고 배양물을 다시 인큐베이터로 옮깁니다. 성장 배지는 배양 48 hours마다 교체합니다.

DRGX 식물을 포함하는 이중 하이드로겔 구조물의 예가 여기에 제시되어 있습니다. DRGX 식물은 성장 및 증식 마커로 라벨링되었습니다. 중합된 PEG 구조물은 회색으로 보이며, beta three tubulin으로 라벨링된 DRG NEURITES는 녹색으로 나타나고, DPI 염색된 세포핵은 파란색으로 보입니다.

세포 이동과 망상 돌기 확장이 이중 하이드로젤 구조의 세포 허용 영역으로 제한됨에 유의하십시오. 이중 하이드로젤 캡슐화는 자가 조립 젤과 광가교 가능 젤을 함께 사용할 때 적합합니다. 이 경우, PEG는 자가 조립 젤의 기하학적 배치를 위한 구조적 지지체 역할을 합니다.

예를 들어, 순수 매트릭스 또는 aris가 있습니다. 겔의 종류와 포토마스크의 선택은 구체적으로 원하는 응용 분야에 따라 달라집니다. 이전에 입증된 바와 같이, Rain-X를 사용하여 폴리에스테르 세포 배양 인서트의 벽면을 처리하십시오.

인서트를 Rain X가 코팅된 슬라이드 위로 옮겨 DMD 아래에 배치합니다. 다음으로, 인서트에 중합 배지 500 µL를 첨가합니다. 이번 생존 실험에 적합한 마스크를 DMD에 로드합니다.

세포 이미징을 돕기 위해 순수 매트릭스의 원통형 프레젠테이션이 사용됩니다. 가교 결합 후, 인서트를 UV 광선에 55초 동안 노출시켜 PEG 가교 결합을 유도합니다. 새로 형성된 공극을 멸균된 DPBS와 1% pen strep으로 세척합니다.

마이크로 피펫이나 멸균 면봉을 사용하여 공극 내의 모든 과잉 액체를 제거합니다. Matrixx 순수 용액을 30분 동안 초음파 처리하여 준비하고, 1 µg/mL의 수용성 laminin과 10% sucrose가 첨가된 멸균수에 0.15% 농도로 희석합니다. 그다음, 배양할 세포를 원심분리하여 펠렛 형태로 만듭니다.

세포 펠릿으로부터 배지를 완전히 흡입하여 제거하고, 0.15% pure matrix 용액에서 약 5×10³ cells/mL의 농도로 펠릿을 재부유시킵니다. pure matrix는 염 용액과 접촉하면 자가 조립이 시작되므로, 세포 펠릿에서 모든 배지를 흡입하여 제거하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 보충제가 첨가된 pure matrix 세포 혼합액 약 1 µL를 피펫으로 peg void에 분주합니다.

이 부피는 보통 피펫 1.5 milliliters의 성장 배지를 인서트 아래에 채워 넘치지 않게 빈 공간을 채우기에 충분합니다. 그다음, 순수 매트릭스 2차 하이드로겔을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 완전한 겔화를 유도합니다. 이 시간이 지난 후, 배지를 흡입하여 제거하고 인서트 아래에 신선한 배지를 추가합니다. 이때 기계적으로 취약한 순수 매트릭스가 손상되지 않도록 주의하십시오.

배양물을 조직 배양 인큐베이터로 옮기고, 배양 48시간마다 배지를 교체하십시오. 다음은 다양한 이중 하이드로젤 구조체 내에 캡슐화된 살아있는 DRG 뉴런의 예시입니다. 성장 배지에서 48시간 후에, 세포를 녹색으로 나타나는 생세포 마커인 calcium am으로 라벨링하였습니다.

여기서는 DMD 포토 마스크의 동적인 특성 덕분에, 캡슐화에 사용할 수 있는 기하학적 구조가 광학 장치의 치수와 해상도에 의해서만 제한됩니다. 세포를 폴리에스터 세포 배양과 유사하게 광가교성 하이드로젤 내부에서 관찰할 수 있는 경우, 단일 하이드로젤 캡슐화가 적합합니다. Rain-X를 사용하여 삽입한 후, Rain-X가 코팅된 슬라이드 위에 두고 DMD 아래에 배치하십시오.

이전과 마찬가지로, 배양할 세포를 원하는 농도로 중합 배지에 직접 피펫팅하고 잘 섞어 균일하게 분포하도록 합니다. 그런 다음 중합 배지가 혼합된 세포액 500 µL를 인서트에 피펫팅합니다. 적절한 마스크를 선택하여 DMD에 로드하고, 55초 동안 UV 광선에 노출시켜 PEG 가교를 유도합니다.

세포 생존 연구를 위해, 기본 원형 마스크를 사용하여 실린더를 나타냅니다. 인서트를 멸균된 DPBS와 1% pen strep으로 3회 세척한 다음, 인서트 아래에 1.5 milliliters의 성장 배지를 피펫으로 분주하고 인서트가 완전히 잠길 만큼의 충분한 성장 배지를 상단에 추가합니다. 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 조건에서 배양하며 48시간마다 배지를 교체합니다. 다음은 PEG 내부에 캡슐화된 살아있는 해리된 피질 뉴런의 예시입니다. 살아있는 세포는 calcium am으로 표지되어 녹색으로 나타나며, 죽은 세포는 ahy homodimer one으로 표지되어 적색으로 나타납니다.

PEG 캡슐화는 단지 예시로 제시된 것이며, PEG가 신경 세포에 이상적인 환경을 제공하는 것은 아닙니다. 선택된 기하학적 구조는 세포 생존력을 연구하기 위한 간단한 수단을 나타내지만, 광범위한 구조로 변경하여 적용할 수 있습니다. 박막 하이드로젤을 사용하여 제한된 세포의 특정 패턴을 생성할 수 있습니다.

앞서와 마찬가지로 폴리에스테르 세포 배양 인서트를 Rain X로 처리한 후, Rain X 처리된 슬라이드 위에 놓습니다. 그런 다음 중합 배지 250 내지 300 µL를 처리된 세포 배양 인서트 바닥에 피펫팅합니다. 이 부피는 인서트 바닥을 겨우 덮을 정도의 양이며, 배지가 인서트 막에 스며들 수 있도록 실온에서 30 내지 45분 동안 배양합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 인서트에서 과량의 배지를 흡입하여 제거합니다.

그 다음, 인서트 바닥에 UV 투과성 오일을 충분한 양으로 피펫팅하여 해당 영역을 완전히 덮습니다. 오일이 중합 배지 위에 뚜렷한 층을 형성할 수 있도록 인서트를 실온에서 15분에서 30분 동안 배양합니다. 인서트 막을 포화시킨 후 DMD에 적절한 마스크를 로드합니다.

인서트와 슬라이드를 DMD 아래에 배치한 후, UV 광선에 노출시켜 페그(peg) 가교를 유도합니다. 멸균된 DPBS와 1% pen strap으로 인서트를 세 번 세척한 다음, 인서트를 6-웰 조직 배양 플레이트로 옮겨 배양할 세포를 수확하고 펠렛화합니다. 배지를 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 mL당 10⁴에서 10⁶ cells 사이의 원하는 농도로 성장 배지에 재현탁합니다.

그런 다음, 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 세포 배양 인서트 내부에 충분한 부피의 세포 현탁액을 피펫으로 분주합니다. 세포 생존력을 완전히 유지할 수 있도록 인서트 아래에 충분한 성장 배지를 추가합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양합니다.

멸균된 DPBS와 1% pen strep으로 인서트를 3회 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 그 후 웰에 신선한 성장 배지를 추가합니다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 48시간마다 배지를 교체합니다.

여기에서는 세포 제한적 PEG를 테스트 패턴을 사용하여 박막으로 중합함으로써, 분리된 세포를 투과성 지지체의 콜라겐 코팅 막에 선택적으로 부착시켰습니다. 세포는 48시간 배양 후 라벨링되었습니다. Calcein AM으로 라벨링된 살아있는 세포는 녹색으로 나타나며, Ethidium homodimer-1로 라벨링된 죽은 세포는 빨간색으로 나타납니다.

얇은 PEG 필름이 포함된 영역에서는 세포 부착이 최소한으로 일어나는 것을 확인할 수 있습니다. 이는 바람직하지 않은 결과의 한 예입니다. PEG의 부분 중합으로 인해 사용할 수 없는 PEG 구조체가 형성되었습니다.

프리폴리머 배지 내의 메니스커스 형성, 폴리머화 매질의 양 부족, 불충분한 UV 노출 또는 광학 장치의 초점 불량으로 인해 부적절한 폴리머화가 발생할 수 있습니다. 이는 A-D-R-G-X 식물 배양의 불량한 듀얼 하이드로겔 3D 캡슐화 사례입니다. 이 이미지에서 녹색으로 보이는 신경돌기가 패턴화된 페그 채널 외부로 성장했음을 확인할 수 있습니다.

이는 주입 중에 순수 매트릭스가 PEG 부분 위로 넘쳐흐를 때 자주 발생합니다. 이 절차를 따르십시오. 전기생리학적 특성이나 표현형 발현과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 패치 클램핑이나 면역조직화학 염색과 같은 다른 표준 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 신경세포 배양 연구를 위해 단일 또는 이중 하이드로젤 시스템의 기하학적 형태를 지정하는 동적 마스크 투영 포토리소그래피(dynamic mask projection photolithography) 사용법을 충분히 이해하게 될 것입니다.