Name: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: 학습하세요 비대칭 수용체 패턴에서 HL-60 세포의 롤링 궤적을 분석하는 방법을. 마이크로콘택트 프린팅과 유동 챔버를 활용하여 무표지 세포 분리를 위한 기판 공학에 활용할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 MIT에서 기술 혁신에 대한 Deshpande 센터 (RK와 JMK)와 화학 및 생물 분판 프로그램을 통해 RK로 NSF 경력 보너스 0,952,493에 의해 지원되었다. 우리는 솔저 Nanotechnologies (외설) 및 시설의 사용을위한 MIT의 마이크로 기술 연구소 (MTL)에 대한 연구소 주셔서 감사합니다.

1. 롤링 HL60 세포 1.1. 문양의 기판 제작. <ol><li> 골드 코팅 유리 슬라이드에 PEG 분자의 자기 조립 monolayers을 (샘스) 교체하기 위해 microcontact 인쇄 (μCP) 4-7 사용 : α = 10의 경사 각도와 수용체의 패턴을 정의 microcontact 인쇄 polydimethylsiloxane (PDMS) 우표를 조작 SU - 8 성형 공정에 의해 °. 20 분 피라 냐는 물고 기지 너한테 솔루션 (황산의 혼합 3시 1분 30 % 과산화수소로)와 금 표면을 청소하고 사용하기 전에 24.5 ° C에서 풍부한 디 물로 표면을 씻어. 에탄올의 5mM PEG 솔루션 잉크 PDMS 스탬프를. 20 분 동안 공중에 우표를 건조시킵니다. 부드럽게 40 초에 대한 황금의 표면에 도장을 넣고 금 표면과 스탬프 사이 좋은 연락 방법이 있는지 확인하십시오. 초과 압력이 필요하지 않습니다. 에탄올로 표면을 씻어 N 2의 흐름에 따라 그것을 건조. </li><li> 24.5에서 3 시간 동안 재관류 챔버 (전자 현미경 과학)를 사용 ° C 패턴 P - selectin과 함께 남아있는 지역. P - selectin 솔루션 (15 μg / DPBS에 ML) 내에 기판을 품어 풍부한 DPBS로 표면을 씻어. </li><li> Backfill 1 H를위한 BSA (DPBS 1 MG / ML)로 표면이 아닌 특정 상호 작용을 차단합니다. 풍부한 DPBS로 표면을 씻어. </li></ol> 1.2. 세포는 흐름 회의소에서 실험 롤링. <ol><li> 직사각형 흐름 챔버의 패턴 표면을 통해 HL60 세포 (~ 10 5 셀 / ML (); 폭 W = 1.0 cm, 길이 = 6cm, Glycotech, Inc의 높이 H = 0.0127 cm)의 정지를 흐름 24.5에서 ° C. 0.5 dyn / cm 2 (~ 0.05 PA) 주변에 대응하는 전단 응력과 75 μL / 분 유량을 생성하기 위해 주사기 펌프 (세계 정밀 계측기, SP230IW)를 사용합니다. τ 비행기 Poiseuille 흐름 방정식 판매량 유량입니다 Q μ는 동점도 (0.001002 아빠들)입니다 τ는 = 6μQ/wh 2를 사용하여 전단 응력을 계산, W는 흐름 챔버의 넓이이며, H는의 높이입니다 흐름 챔버. </li><li> 300 기간이 일반적으로 초당 1 프레임의 속도로, 4를 사용하여 접착제 P - selectin 기판과 상호 작용을 압연 HL60 세포를 기록하기 위해 장착된 카메라 (Andor iXon 885) × 목적으로 거꾸로 현미경 (니콘 TE2000 - U)를 사용하여 S. 각 전단 응력의 크기와 패턴 경사 각도 세 독립적인 실험을 수행합니다. 각 실험에서 얻은 평균 값을 의미 및 표준 편차로 제시 데​​이터입니다. </li><li> 데이터 분석. 패턴 라인 가장자리를 따라 트랙을 생성하는 프리웨어 8 추적 입자를 이용한 사용자 정의 Matlab (Mathworks, 주식 회사) 프로그램으로 이미지 시퀀스를 분석합니다. P - selectin 밴드의 끝부분까지 연장 트랙이 선택 두 개의 직선 세그먼트 장착되어 있습니다 - 흐름에 부합 하나, 패턴 가장자리에 부합 다른. 이 두 세그먼트는 다음 가장자리에 속도를 압연하고, 일반 지역에 속도를 압연, 가장자리 추적 길이를 계산하는 데 사용됩니다. </li></ol> 2. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2640/2640fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 (A)는 4 × 목표를 사용하여 접착제 P - selectin 기판과 HL60 압연 상호 작용의 동영상 변환 현미경 이미지 중 하나를 보여줍니다. 밝고 어두운 지역은 각각, P - selectin 수용체와 PEG 지역과 일치합니다. 그림 (B)는 맞춤형 Matlab 프로그램을 사용하여 얻은 트랙을 보여줍니다. 가장자리 경사 각도는 10 °와 전단 응력은 0.5 dyn / cm 2이었다. 에지 추적 길이, L E, 변위, D, 그리고 모서리에 각각 밴드, V E와 V P, 내부 압연 판매율이 (C - 1) 그림에 설명되어 있습니다. 그림은 (C - 2) 보여줍니다 에지 추적 길이 분포 (기록된 세포의 수를.) Insets은 L E의 평균 가치와 가장자리에 압연 속도 (V E)를 표시하고 경사 각도에서 밴드 (V P) 내부 α = 10 ° 및 0.5 dyn / cm 2 주위의 유체 전단 응력의 ​​크기. 오차 막대는 하나의 표준 편차, N = 각 조건 3 복제 실험 (3 복제 표면). 나타냅니다

<ol><li>Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+control+of+cell+rolling+in+two+dimensions+through+surface+Patterning+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors.</a> Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).</li>
<li>Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+Lateral+Displacement+of+HL60+Cells+Rolling+on+Asymmetric+P-selectin+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns.</a> Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).</li>
<li>Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+rolling+in-vivo+is+mediated+by+p-selectin+glycoprotein+ligand-1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1.</a> Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).</li>
<li>Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+patterns+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Printing patterns of proteins.</a> Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).</li>
<li>James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+protein+layers+on+solid+substrates+by+thin+stamp+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing.</a> Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+proteins+on+mixed+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).</li>
<li>Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: 
	
 <a target="_blank" href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a> Forthcoming.</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.</li>
<li>Greenberg, A. W., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+mediated+by+differential+rolling+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell separation mediated by differential rolling adhesion.</a> Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).</li>
<li>Higuchi, A., Tsukamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+of+hepatocytes+and+fibroblasts+through+surface-modified+polyurethane+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).</li>
<li>Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+surfaces+segregate+compliant+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned surfaces segregate compliant microcapsules.</a> Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 microcontact 인쇄 2를 사용 가공 비대칭 수용체 - 패턴 표면에 세포 회전 궤도를 조사하기 위해 프로토콜을 설명합니다. PEG와 P - selectin 영역 사이의 명확한 대비를 보여주는 패턴 표면의 광학 현미경 이미지는 스탬핑이 성공적인지 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 샤프, 직선 가장자리는 스탬핑이 잘 수행하면 볼 수 있습니다. 하드 스탬프 누르면 패턴의 정밀도를 제한 스탬프 변형이 발생할 수 있습니다. 물결 모양 가장자리는 잉크 농도가 너무 높으 또는 스탬핑 시간이 너무 긴 경우 얻을 수 있습니다. 우표와 표면 사이의 접촉 불량은 우표의 크기 (&lt;0.5 cm 2) 너무 작은 경우가 아닌 균일한 PEG 패턴 발생합니다. 비 - 신선한 잉크 솔루션 때문에 P - selectin을 passivate 감소 능력의 PEG - 패턴 영역에서 압연 세포가 발생할 수 있습니다. 실제 경사 각도가 표면과 상호 작용하지 않습니다 자유 흐르는 세포의 패턴과 궤도의 영상...

<table><tbody><tr><td>인간 전골수성 백혈병 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td>HL60 세포</td></tr><tr><td>금 코팅 유리 슬라이드</td><td>EMF</td><td>TA134</td><td>금 슬라이드</td></tr><tr><td>(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674508</td><td>PEG</td></tr><tr><td>재조합 인간 P-selectin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ADP3-050</td><td>P-selectin</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>BSA-50</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 인산염 완충 식염수</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>황산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>316989</td><td></td></tr></tbody></table>

비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

비대칭 수용체 패턴에 압연에 의해 흐름에 직교 세포의 측면 변위는 세포 1 라벨이없는 분리 및 분석을위한 새로운 장치의 개발을위한 기회를 제공합니다. 이러한 장치는 지속적인 흐름 분리, 또는 다른 셀 또는 phenotypes 수용체 표현의 수준을 구별하기 접착력을 조절 수용체 패턴 측면 변위를 사용할 수 있습니다. 수용체 - 패턴 기판의 셀 압연 궤도의 본질을 이해하는 것은 기판과 같은 장치의 설계 기술이 필요합니다. 여기, 우리는 세포 압연 접착력 2를 지원 비대칭 수용체 패턴에 셀 압연의 탄도를 연구를위한 프로토콜을 보여줍니다. P - selectin 수용체의 잘 정의된, μm의 규모 패턴이 흐름 챔버에 통합되었습니다 골드 코팅 슬라이드에 microcontact 인쇄를 사용하여 가공되었습니다. PSGL - 1 리간드 3 표현 HL60 세포 무늬 라인의 들판을 가로질러 거듭하고 거꾸로 명시야 현미경에 시각되었습니다. 세포는 측면 편향 1 결과 패턴의 경사 가장자리를 따라 굴러 및 추적. 각 세포는 일반적으로 패턴 가장자리를 따라 일정한 거리 (모서리 추적 길이로 정의)를 압연 가장자리에서 분리하고, 다운 스트림 패턴 reattached. 이 분리가 어려운 흐름 챔버의 출구 입구에서 세포의 전체 궤적을 추적할 수 있습니다 있지만, 입자 추적 소프트웨어는 그들이 하나의 수용체에 이동하는 때 시간 동안 세포의 압연의 탄도를 분석하고 항복하는 데 사용된 - 패턴 라인. 궤도는 다음 셀 롤링 판매율과 다른 패턴으로 각 셀의 가장자리 추적 길이의 배포판을 얻기 위해 조사되었다. 이 프로토콜은 수용체 패턴에 세포 회전 궤도를 quantifying과 패턴 각도 및 전단 응력 등이 엔지니어링 매개 변수를 관련된 유용합니다. 이러한 데이터는 레이블이없는 세포 분리 및 분석을위한 microfluidic 장치의 설계에 유용합니다.

우리는 비대칭 수용체 - 패턴 기판에서 셀을 회전 궤도를 관찰하고 분석하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 결과 데이터는 레이블이없는 세포 분리 및 분석을위한 수용체 - 패턴 기판의 엔지니어링하는 데 유용합니다.

비대칭 수용체 패턴 위를 구르는 세포가 유동 흐름에 수직 방향으로 측면 변위되는 현상은 새로운 ...의 개발 가능성을 제시합니다.

본 프로토콜은 무표지 세포 분리 및 분석을 위한 수용체 패턴 기판 설계를 용이하게 하기 위해, 비대칭 수용체 패턴 상에서의 세포 롤링 궤적을 관찰하고 분석합니다. 먼저 금 기판 위에 PEG 분자를 마이크로 컨택 프린팅하여 자기 조립 단분자층의 교차 패턴을 생성한 후, P-selectin 수용체로 기판의 빈 공간을 채웁니다. 다음으로, 해당 기판을 유체 챔버에 장착합니다. 챔버 내부로 HL 60 세포를 흘려줍니다.P selectin 패턴 위에서 HL 60 세포의 롤링 상호작용 이미지 시퀀스를 기록하고, 비디오에서 변환된 이미지를 분석하십시오. MATLAB 프로그램을 사용하여 평면, 영역 및 가장자리에서의 롤링 세포 가장자리 추적 경로, 길이 및 롤링 속도를 구할 수 있습니다. 이 방법은 전단 흐름 하에서 비대칭 수용체 패턴 위로 HL 60 세포가 어떻게 이동하는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이는 수용체 패턴상에서 세포의 궤적을 관찰함으로써 세포 표면 상호작용을 정량화하고 세포를 직접 분석하는 데 적용될 수 있습니다. 또한 세포 분리를 위한 마이크로 푸팅(micro footing) 장치 설계에도 활용 가능합니다. 금 기판 위에 PEG 분자의 자기 조립 단분자층이 교대로 나타나는 패턴을 생성하기 위해 마이크로 접촉 인쇄법이 사용됩니다.먼저 PDMS 스탬프에 5 mM PEG 에탄올 용액을 도포합니다. 표면을 20분 동안 건조시킵니다. 스탬프를 금 표면에 40초 동안 부드럽게 올려놓고, 금 표면과 스탬프가 잘 접촉되었는지 확인합니다.과도한 압력은 필요하지 않습니다. 표면을 ethanol로 헹구고 질소 기류 하에서 건조합니다. 이제 perfusion chamber를 사용하여, 기질을 15 µg/mL P selectin 용액과 함께 상온에서 3시간 동안 배양하여 나머지 영역에 P selectin 패턴을 형성하고, chamber를 헹군 다음, 비특이적 상호작용을 차단하기 위해 1 mg/mL BSA로 표면을 1시간 동안 backfill 합니다.세포 롤링 실험을 수행하기 전, DPBS 버퍼로 표면을 헹굽니다. 플로우 챔버를 조립한 후, 수용체 패턴의 경사각이 10도인 직사각형 플로우 챔버 내의 패턴 표면 위로 10⁵ cells/mL 농도의 HL 60 세포 현탁액을 흘려줍니다.실온 24.5 °C에서 진행합니다. 시린지 펌프를 조절하여 75 µL/min의 유량을 생성하며, 이에 해당하는 층류 전단 응력은 0.5 dynes/cm²로 설정합니다. 이제 도립 현미경과 장착된 카메라를 사용하여 HL 60의 롤링(rolling) 현상을 기록합니다.접착성 p-selectin 및 기질과의 상호작용. 4배율 대물렌즈를 사용하여 초당 1프레임의 속도로 300초 동안 촬영한다. 세 번의 독립적인 실험을 수행한다.데이터는 각 실험에서 얻은 평균값의 평균과 표준편차로 나타내십시오. HL 60.Rolling 영상에서 변환한 현미경 이미지입니다. 접착성 p-selectin 및 기판과의 상호작용은 각각 p-selectin 수용체 영역에 해당하는 밝은 부분과 PEG 영역에 해당하는 어두운 부분으로 나타납니다.여기서는 맞춤형 MATLAB 프로그램을 사용하여 트랙을 구분하였습니다. 가장자리 경사각은 10도였으며, 전단 응력은 0.5 dines per centimeter squared였습니다. 가장자리 트랙 길이의 분포, 가장자리 트랙 길이의 평균값뿐만 아니라 밴드의 가장자리와 내부에서의 회전 속도인 VE 및 VP에 대해 추가 분석을 수행하였습니다.이 영상을 시청한 후에는 비대칭 수용체 패턴 상에서 세포 궤적을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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