비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부
2011년 2월 13일
우리는 비대칭 수용체 - 패턴 기판에서 셀을 회전 궤도를 관찰하고 분석하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 결과 데이터는 레이블이없는 세포 분리 및 분석을위한 수용체 - 패턴 기판의 엔지니어링하는 데 유용합니다.
본 프로토콜에서는 비대칭 수용체 패턴 상의 세포 롤링 궤적을 관찰하고 분석하여, 무표지 세포 분리 및 분석을 위한 수용체 패턴 기판 설계를 촉진합니다. 먼저 금 기판 위에 PEG 분자를 마이크로 접촉 인쇄하여 자기 조립 단분자층의 교차 패턴을 생성한 후, P-selectin 수용체로 기판의 빈 공간을 채웁니다. 다음으로, 해당 기판을 유체 챔버에 결합합니다. HL 60 세포를 챔버 내로 흘려보냅니다.
P-selectin 패턴 위에서 HL 60 세포의 롤링 상호작용 이미지 시퀀스를 기록하고, 비디오에서 변환된 이미지를 분석합니다. MATLAB 프로그램을 사용하여 평면, 영역 및 가장자리에서의 롤링 세포 가장자리 추적 길이와 롤링 속도의 궤적을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 전단 흐름 내 비대칭 수용체 패턴 위에서 HL 60 세포가 어떻게 이동하는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.
이 방법은 다른 세포 표면 상호작용의 정량화, 수용체 패턴 상의 궤적 관찰을 통한 세포의 직접 분석, 그리고 세포 분리를 위한 마이크로 푸팅 장치의 설계에 적용될 수 있습니다. 마이크로 접촉 인쇄법은 금 기판 위에 PEG 분자의 자기 조립 단분자층이 교대로 배치된 패턴을 생성하는 데 사용됩니다.
먼저 에탄올에 녹인 5 mM PEG 용액으로 PDMS 스탬프에 잉킹을 합니다. 표면을 20분 동안 건조시킵니다. 스탬프를 금 표면 위에 40초 동안 살며시 올려두고, 금 표면과 스탬프가 잘 밀착되었는지 확인합니다.
과도한 압력은 필요하지 않습니다. 표면을 에탄올로 헹구고 질소 기류 하에서 건조합니다. 이제 관류 챔버를 사용하여, 기질을 15 µg/mL P selectin 용액과 함께 상온에서 3시간 동안 배양하여 남은 영역에 P selectin 패턴을 형성합니다. 챔버를 헹군 후, 비특이적 상호작용을 차단하기 위해 1 mg/mL BSA로 표면을 1시간 동안 백필(backfill)합니다.
세포 롤링 실험을 수행하기 전, DPBS 버퍼로 표면을 세척합니다. 플로우 챔버를 조립한 후, 수용체 패턴의 경사각이 10도인 직사각형 플로우 챔버 내의 패턴 표면 위로 10⁵ cells/mL 농도의 HL 60 세포 현탁액을 흘려줍니다.
실온 24.5 °C에서 진행합니다. 시린지 펌프를 조정하여 유량을 75 µL/min으로 설정하고, 이에 해당하는 층류 전단 응력을 0.5 dyn/cm²로 생성합니다. 이제 도립 현미경과 장착된 카메라를 사용하여 HL 60의 롤링을 기록합니다.
점착성 P-selectin 및 기질과의 상호작용. 4배율 대물렌즈를 사용하여 초당 1프레임의 속도로 300초 동안 관찰합니다. 세 차례의 독립적인 실험을 수행하십시오.
데이터는 각 실험에서 얻은 평균값의 평균과 표준편차로 표시합니다. HL 60.Rolling 영상에서 변환한 현미경 이미지입니다. 접착성 p-selectin 및 기질과의 상호작용은 p-selectin 수용체 영역과 PEG 영역에 각각 해당하는 밝은 영역과 어두운 영역으로 나타납니다.
여기서는 맞춤형 MATLAB 프로그램을 사용하여 궤적을 구분합니다. 가장자리 경사각은 10도였으며, 전단 응력은 0.5 dines per centimeter squared였습니다. 가장자리 궤적 길이의 분포, 가장자리 궤적 길이의 평균값, 그리고 밴드의 가장자리와 내부에서의 회전 속도인 VE 및 VP에 대한 추가 분석을 수행합니다.
이 영상을 시청하고 나면 비대칭 수용체 패턴에서 세포 궤적을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 프로토콜은 비대칭 수용체 패턴 상의 세포 롤링 궤적을 관찰하고 분석하여, 무표지 세포 분리 및 분석을 위한 수용체 패턴 기판의 설계를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 생체 재료
- 미세 유체 역학
배경
- 세포 롤링은 다양한 생물학적 상호작용에서 중요한 과정입니다.
- 비대칭 수용체 패턴은 세포 행동에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 무표지 기술은 세포 분리 및 분석에 필수적입니다.
- 마이크로 접촉 인쇄는 패턴화된 기질을 제작하는 데 유용한 방법입니다.
연구 목적
- 수용체 패턴 기판 위에서 세포 롤링을 관찰하기 위한 프로토콜을 개발합니다.
- 더 나은 기판 공학을 위해 롤링 세포의 궤적을 분석합니다.
- 흐름 조건 하에서의 세포 이동 역학에 대한 통찰을 제공합니다.
사용된 방법
- 금 기판 위에 PEG 분자를 마이크로 접촉 인쇄함.
- 자기 조립 단분자층의 교차 패턴을 생성함.
- P-selectin 및 수용체로 기판의 나머지 부분을 채움.
- 유동 챔버에 통합하여 패턴 위에서 롤링하는 HL-60 세포를 이미징함.
주요 결과
- HL-60 세포 상호작용의 이미지 시퀀스를 기록하였습니다.
- MATLAB을 사용하여 롤링 세포의 궤적을 분석하였습니다.
- 에지 트래킹 길이와 롤링 속도에 관한 데이터를 얻었습니다.
- 비대칭 수용체 패턴 상에서 세포 이동에 대한 통찰을 제공하였습니다.
결론
- 이 프로토콜은 세포 롤링 역학의 세밀한 분석을 가능하게 합니다.
- 효과적인 세포 분리를 위해 비대칭 수용체 패턴을 설계할 수 있습니다.
- 이 방법은 전단 흐름 내 세포 행동에 대한 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
비대칭 수용체 패턴 상에서 세포 롤링 궤적을 이해하면 무표지 미세유체 분리 장치를 합리적으로 설계할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정의된 전단 응력 하에서 가장자리 추적 길이와 롤링 속도에 대한 정량적 데이터를 제공하여, 흐름 내 세포 거동의 예측 모델링을 지원합니다. 이러한 통찰은 세포 정제 및 표현형 분석 워크플로우를 위한 장치 공학의 경험적 반복 횟수를 줄여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 생리학적 전단 응력 하에서 리간드-수용체 결합 역학의 분석을 가능하게 하여, 접착 매개 경로의 표적 검증에 유용한 정보를 제공합니다.
- 운용적 가치: 형광 태그나 유전자 리포터 없이도 수용체의 기능적 활성을 평가할 수 있는 무표지법을 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 수용체 밀도 또는 패턴 기하학적 구조에 따른 비교 분석을 위해 세포 롤링 속도 및 엣지 추적 길이의 정량적 판독값을 생성합니다.
- 운용적 가치: 재현 가능한 접착 분석을 위해 마이크로콘택트 프린팅 및 유동 챔버 통합을 통한 기질 준비 과정을 표준화합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 수용체 패턴 설계와 관찰 가능한 세포 궤적 결과 간의 연관성을 규명함으로써, 접착 기반 분리 전략의 메커니즘적 리스크 감소를 지원합니다.
- 운영적 가치: 롤링 동작에 기반한 세포 표현형 스크리닝을 가능하게 하여, 전임상 모델에서 하위 집단을 농축하는 데 유용합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 초기 발견 단계에 적합하며, 특히 유동 하에서의 부착이 기능적 판독값인 표적을 대상으로 어세이 개발 및 전임상 툴 제작에 필요한 정보를 제공합니다.
- 발견 생물학: 전단 흐름 하에서의 수용체-리간드 상호작용에 대한 가설 검증을 촉진하여, 세포 롤링의 기전적 기여도를 명확히 합니다.
- 스크리닝: 표준화된 정량적 접착 지표를 제공하여 세포주 또는 수용체 조절제의 비교 분석을 가능하게 합니다.
- 분석: 에지 추적 길이 및 롤링 속도의 분포를 산출하여 조건 비교를 위한 통계적 근거를 제공합니다.
- 중개 연구: in vitro 롤링 역학을 전임상 시료 처리를 위한 무표지 세포 분리 장치의 잠재적 활용성과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 타겟과 세포 유형에 걸쳐 접착 매개 세포 행동을 평가할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 제어된 전단 조건 하에서 궤적 매개변수를 정량화함으로써 접착 기반 분리 메커니즘의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 마이크로컨택 프린팅, 수용체 백필링 및 유동 챔버 설정을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 수용체 패턴의 초기 단계 기능 검증을 가능하게 하여 장치 개발의 후기 단계 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 패턴 성능에 대한 실증적 데이터를 제공함으로써 미세유체 분리 기술의 추진/중단(go/no-go) 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 마이크로컨택 프린팅, 표면 화학 및 미세유체 흐름 제어에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 도립 명시야 현미경, 고속 카메라 및 MATLAB 기반 입자 추적 도구의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 다기관 재현성을 위해 기판 제작 및 흐름 조건 보고에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 다른 세포 유형에 적용하려면 리간드-수용체 쌍의 검증과 전단 응력 파라미터의 최적화가 필요합니다.
- 세포-가장자리 상호작용의 일시적인 특성으로 인해 전체 궤적 재구성에 제약이 있으며, 이에 따라 분할 분석이 필요합니다.
