Name: 전갈 페그 Sensilla의 전기 생리학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 전갈 페그 Sensilla의 전기 생리학 연구 방법을 통해 화학 감각 반응을 기록하는 기술을 익히세요. 미네랄 오일 챔버와 미세 전극을 사용하여 개별 감각기의 활동을 정밀하게 측정할 수 있습니다.

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우리는 생활 자금, 오클라호마 대학 학부 연구 기회 프로그램, 그리고이 작품을 자금에 대한 동물학의 부 감사합니다. 또한 편집에 도움 박사 마리엘의 Hoefnagels 감사합니다.

1. 사전 녹음, 라이브 동물 준비 <ol><li> 자사 홈 병의 전갈을 제거하고 미리 차게 유리 컨테이너에 배치, 다음, 두 분 최소 냉동 환경 (-5 ° C)에 전갈이 들어있는 항아리를 놓습니다. 이 시간은 연령에 따라 다를 수 있습니다, 크기, 연구에서 구체적인 전갈의 종류 등. 동물이 움직이지되면 그러나 일반적으로 냉동 환경 단계가 완료되었습니다. </li><li> 이분 후, 차가운 유리 용기에서 고정 전갈을 제거하고, 현미경 슬라이드에 복부 쪽을 놓으십시오. 스팅거, 꼬리, 다리, 그리고 moldable 점토 (석유 기반의 반 아켄 Plastalina)와 pedipalps를 확보. </li><li> 전갈의 pectines 넣어하는 플랫폼을합니다. 펙튼의 크기에 따라 플랫폼의 길이와 너비를 조정합니다. 일반적으로, 우리의 플랫폼은 현미경 커버 유리 밖으로 건설하고 약 10 (L) X 18 (W) mm입니다. </li><li> 에 맞게 (필요한 경우) 테이프를 트리밍, 펙튼 플랫폼에 양면 접착 테이프를 준수합니다. </li><li> pectinal 챔버하려면, 3~4mm의 깊이에 미리 녹인 왁스 (우리는 100 % 밀랍 칩을 사용)으로 플랫폼의 사면 세를 넣어. 우리는 뜨거운 접시에있는 유리 페트리 접시 안에 칩을 배치하여 왁스를 녹여. pectinal 챔버의 가장자리에 왁스가 상온으로 냉각되면, 이것은 높이 1mm에 대해 왁스의 벽을 만들어야합니다. </li><li> 동물, pectinal 삽입 지점을 찾아, 그것을 단지 사후 플랫폼의 취소 왁스칠 가장자리 (테이프 측면까지)를 놓으십시오. 그 후 부드럽게 동물의 다리를 제지하는 데 사용되는 점토 상대로 좌우 주변 가장자리를 눌러 플랫폼을 (이것은 나중에 이동하지 않도록) 안정화. </li><li> 챔버 내부의 펙튼 또는 pectines을 신중하게 배치하기 위해 미세하게 밀고 집게를 사용하십시오. 특히 집게를 사용하여 pectinal 척추 함께 펙튼을 보유하고 부드럽게 커버 유리 아래에서 펙튼을 지참 접착제 플랫폼 바닥에 그것을 낮추십시오. 조심스럽게 pectinal 척추에 압력을 적용하여 펙튼 - 투 - 테이프 본드를 설정합니다. </li><li> 이제 플랫폼의 취소 왁스칠 가장자리에 녹인 왁스를 (우리가 사전에 가열 금속 주걱을 사용하여)이 적용됩니다. 목적은 펙튼 확보하고 완벽하게 미래의 광유 소개 챔버 묶으을 두 배입니다. 너무는 뜨겁다 왁스와 펙튼 손상을 수 있습니다 것처럼, 동물의 펙튼 위에 왁스를 적용할 때주의를 사용합니다. </li><li> 펙튼 챔버 공사가 완료되었습니다. 다음 두 꼬리 세그먼트 사이에 은색 철사를 삽입하여 동물의 hemolymph와 무관심 전극 연결을 설정합니다. </li></ol> 2. 동시 세포외 녹화 및 화학적 자극 <ol><li> 우리는 다른 이유 중 (고정 위치에 즉, 동물성 조정), 수, 세포, 팁 - 녹음을 수행하기 전에 동물 24 H를 준비하는 시간을 지정하게되면 특정 (sensillum -에 따라 다름) 팁 - 직경의 자극제의 pipettes합니다. 우리는 이러한 사양을 달성 micropipette의 풀러를 사용합니다. 이상적으로, pipettes의 직경은 sensillar의 기공 직경보다 ≈ 2 μm의 큰 것입니다. 우리는 각 동물에 대해 적절하게 우리 micropipette 사양을 조정합니다. </li><li> 녹음하기 전에 1 H, 우리는 석유에서 펙튼을 잠수함이 잠수, pectinal 실로 광유 5 μl를 추가합니다. 그렇다면, 우리는 장거리 목표와 에피 조명 일을 가진 고성능 현미경, 아래 동물을 위치. </li><li> 화학적 페그 sensilla을 촉진하기 위해, 우리는 석유 매체를 통해 수성 tastants (예 : 구연산과 소금) 소개합니다. 첫째, 우리는 자극의 피펫에 자극제를 주입하는 micropipette 필러를 사용합니다. 참고 : 모든 자극제 솔루션은 전기 전도성에 대한 전해질을 포함해야합니다. </li><li> 다음 micromanipulator (녹화 장비)에 흥분제의 피펫을 위치 후, 흥분제의 피펫의 무딘 오픈 엔드에 기록 전극을 삽입합니다. 금속 전극과 전해 흥분제 솔루션 사이의 접촉을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 일단 준비는 전기 오일 매체 통해 sensillar의 구멍에 피펫 단순히 낮은 (무관심 전극을 통해) 접지입니다. pectinal sensillum 당 화학 자극의 기간은 많은 서른로 분 거리로 작은로 두 번째 다를 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 피펫마다 여러 펙스 (&gt; 30)을 샘플 수 있습니다. 흥분제의 피펫는 분 파편들로 가득 찼어되고있는 경우, 단순히 새로운 않는 피펫에 대한 막힌 피펫을 교환. </li></ol> 3. 실험의 여러 일 동안 동물 준비 <ol><li> 동물이 확장 기간 동안 사용할 수있다면, 우리는 pectinal 챔버를 재사용하고 각 레코딩 세션에 대해 미네랄 오일 드롭을 대체하는 것이 좋습니다. 특정 일의 레코딩 세션이 완료되면 설정 녹음에서 동물을 제거하고 미네랄 오일 세척을 수행합니다. </li><li> Specifically, 실로 미네랄 오일의 다른 드롭 (5 μl)을 추가하고 모든 기름을 제거합니다. 이것은 레코딩 세션 동안 피펫 밖으로 유출 있습니다 잔여 자극의 존재를 최소화하는 데 도움이됩니다. </li><li> 다음 세션 전에, 앞에서 설명한 것처럼 기름 한 방울을 추가합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 적어도 3시 1분의 N 비율 : (특정 앰프 예를 들어, 하드웨어 등 디지타이징) 사용 녹음 장비에 따라 대표적인 결과는 S와 세포외 기록이다. 그것은 극지 (물 기준) 화학 tastants 8를 전달하기위한 매체를 제공하는 등 미네랄 오일 챔버의 성공적인 건설은 개인 sensilla에 화학 자극을 분리 필요합니다. 전혀 너무 작은 기름이나 없음이있다면, 흥분제 솔루션은 화학 자극 8 장기간, 통제 한판 승부를 일으킬 가능성이 그 이웃 sensilla에 기록된 sensillum에서 전염됩니다.

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</ol>

우리는 이전에 두 저널, 놀턴 및 Gaffin (2009)와 놀턴 및 Gaffin (보도)에 이러한 방법을 발표했습니다.

위의 프로토콜 electrophysiological 연구 사막 초원 전갈 (Paruroctonus utahensis)를 준비하는 방법을 설명합니다. 특히, 우리는 석유에 따라 pectinal chemosensory 뉴런의 제어 세포 끝 - 녹음을위한 챔버를 빌드하는 방법을 보여줍니다. 기름과 물을 혼합하지 않기 때문에, 그것은 화학 자극 (물 기반 각성제)를 단일 sensilla로 분리 수 있습니다. 그것은 스트레스를해야한다는 P. utahensis는 비교적 작은 동물 (≈ 2.5-5 ㎝)이며 큰 동물이 프로토콜을 적용하면 여러 크기와 같은 동물의 플랫폼, 챔버의 크기 조정, 그리고 적용 기름 양을 요구할 수 있습니다. 우리는 물을 기반의 화학 자극의 전달 제어에 필요한 석유의 최소 금액을 테스트하기 위해 파일럿 연구를 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 pectinal sensilla 8 시간 기준 신경 활동에 기름의 영향을 찾을 수 없습니다. 이것은 이전 chemoresponsiveness를 평가하기 위해,뿐만 아니라 다른 모델 시스템을위한 확인하여야한다. 이 방법은 감각 분야에서 sensilla 간의 chemoresponse 상호 작용 효과에 대해 테스트하는 다른 방법과 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 한 sensillum에서 끝 - 기록 (석유 이하)이 가능합니다 같은 우리 이웃 sensillum 9 시부터베이스 레코드 (텅스텐 전극을 통해). 이러한 녹음 구성은 기본 - 기록 sensillum의 신경 활동에 영향을 미치는 지 여부를 화학적으로 한 sensillum을 자극하지 평가하기 위해 사용할 수 있습니다. 지금까지 아무도 전갈 pectinal sensilla이 테스트를하지 있으며, 그것뿐만 아니라 다른 chemosensory 시스템을위한 열린 질문 유지됩니다. 요약하면, 우리는 석유 진보 arthropod 맛보기의 신경 기초로 electrophysiological 조사의 범위를 아래의 팁 - 녹음 방법을 생각합니다. 이 원고에서는, 우리는이 방법에 대한 동물을 준비 프로토콜을 제공하고, 우리는 주변 감각 신경 시스템의 진학 확고한 기반을 제공합니다 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>Lift-N-Press 탭</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16082</td><td>양면 접착제</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G</td><td>마이크로피펫 필러</td></tr><tr><td>표준 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-6</td><td>유리 피펫</td></tr><tr><td>Micr&amp;#8211;lectrode 홀더</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3SBW10</td><td></td></tr></tbody></table>

전갈 페그 sensilla의 전기 생리학

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

우리는 electrophysiologically 짧은 감각 sensilla 3,4 PEG - 같은 조사에 대한 기존의 팁 - 녹음 기술의 1,2의 수정을 설명합니다. 모든 전갈의 중간 복부 표면의 밀도 분야가 pectines라는 두 개의 부속, 메카 및 chemosensory 말뚝 sensilla 5,6입니다. 이러한 sensilla의 chemoresponsiveness 평가하기위한 한 가지 방법은 휘발성 odorant이 감각 필드 5,7에 소개로 extracellularly sensillum 내에서 신경 활동을 기록을위한 텅스텐 전극을 사용합니다. 이 방법의 제한 속도가 느린 데이터 수집 및 통제 흥분제 소개 및 페그 분야에서 제거를 포함합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 각각의 말뚝 sensilla 8,9 물을 기반 tastants를 제공하는을 통해 매체로 무극 성 미네랄 오일을 사용하는 새로운 팁 - 녹화 기술을 개발했습니다. 우리는 성공적으로 구연산 초산, 에탄올, 그리고 소금에 sensillar의 chemoresponses를 얻는이 방법을 적용했습니다. 여기 우리는 이러한 연구 9 실험 프로토콜을 설명합니다. 우리는이 새로운 방법은 곤충 10, 11, 갑각류 12 포함한 다른 arthropod chemosensory 시스템의 응답 특성을 공부하는 데 유용할 수 있습니다 생각합니다.

이 문서는 광유에 따라 세포, 팁 - 녹음을 통해 개별 sensilla에 화학 자극을 분리에 대한 electrophysiological 방법을 설명합니다.

전갈 페그 Sensilla의 전기 생리학

우리는 짧은 못 모양의 감각 털(sensilla)을 전기생리학적으로 조사하기 위해 기존의 팁 기록법(tip-recording technique)1,2을 수정한 방법을 설명합니다. ...

본 절차의 전반적인 목표는 전갈 빗빗살(pectin)에 있는 개별 화학감각 털(peg illa)의 화학감각 생리학을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 전갈의 복측이 위로 향하도록 유리 슬라이드 위에 고정합니다. 모델링 점토를 사용하여 설정을 마친 후, 빗빗살을 맞춤 제작된 오일 충전 챔버에 담그고 화학 자극제가 채워진 전극을 제작합니다.화학 감각 반응은 빗살 모양의 감각기관(pecten)에 있는 개별 illa에서 기록되며, 이는 궁극적으로 수성 화학 자극제에 대해 유사한 반응 프로필을 생성합니다. 저희는 휘발성 자극제를 기공 위로 불어넣으면서 illa의 기저부에서 기록을 수행했습니다. 팁 기록법(tip recording technique)의 주요 장점은 주변 기관의 활동에 영향을 주지 않고 하나의 빗살 기관(pecten)에만 자극을 국한시킬 수 있다는 점입니다.이 방법은 화학 감각 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 왜 동물들은 화학 물질 검출 및 인지에 그토록 많은 반복적인 섬모(cilia)를 사용하는가 하는 점입니다. 전갈은 연구하기에 가장 안전한 동물처럼 보이지 않을 수도 있지만, 모든 종이 위험하거나 다루기 어려운 것은 아닙니다. 예를 들어, 사막 초원 전갈은 길이가 4~5cm에 불과하며 실험실에서 유지 관리가 쉽고, 적절하게 다룰 경우 거의 쏘지 않습니다.침에 쏘이면, 독소가 감각 뉴런을 인위적으로 자극하며 이 중 일부는 통증 정보를 전달합니다. 이러한 감각은 보통 약 15분 후에 가라앉습니다. 전갈은 강인한 피실험체이므로 여러 날 동안 실험을 견딜 수 있으며, 흔히 원래의 서식지로 되돌려 보내집니다.전갈을 고정하는 실험을 완료한 후, 전갈을 미리 냉각시킨 유리 용기에 넣으십시오. 그다음 전갈이 들어 있는 용기를 최소 2분 동안 냉동 환경에 두고, 전갈이 움직이지 않으면 냉동고에서 꺼내십시오. 이제 고정된 전갈의 복부 쪽이 위로 향하도록 현미경 슬라이드 위에 놓으십시오.가소성 점토를 사용하여 독침 꼬리 다리와 pedi pals를 고정합니다. 전갈의 빗살기관(pectins)은 성기관 근처에 위치한 한 쌍의 빗 모양 구조물로, 이 동물들만이 가진 고유한 특징입니다. 빗살기관을 동물로부터 제거하지 않고 단일 빗살기관을 수용할 수 있는 챔버를 만들어야 합니다.먼저, 약 5mm x 18mm 크기로 자른 유리 커버 슬립 위에 펙틴을 올릴 수 있는 플랫폼을 만듭니다. 일반적으로 이 정도 크기가 적당합니다. 둘째, 플랫폼에 양면 테이프를 붙이고 필요에 따라 테이프를 크기에 맞게 다듬습니다.셋째, 핫플레이트를 사용하여 유리 용기에 100% 비즈왁스 칩을 넣고 녹입니다. 이제 플랫폼의 네 모서리 중 세 곳을 녹은 비즈왁스에 3~4 mm 깊이로 담급니다. 냉각된 왁스는 챔버를 형성하는 벽 역할을 합니다.이제 플랫폼의 고정되지 않은 모서리를 동물의 흉근 삽입 지점 바로 뒤쪽에 배치하십시오. 미세 팁 포셉을 사용하여 플랫폼의 좌우 주변부 모서리를 동물의 다리를 고정하는 데 사용된 점토에 가볍게 눌러 플랫폼을 고정합니다. 흉근 가시를 따라 빗살(pectin) 중 하나를 조심스럽게 잡고, 커버 글라스 아래에서 천천히 끌어내어 접착제가 도포된 플랫폼 바닥 위로 내립니다.펙탈 스파인(pectal spine)에 조심스럽게 압력을 가하여 펙틴을 고정합니다. 미리 가열한 금속 스패튤라를 사용하여 플랫폼의 접합되지 않은 가장자리에 녹인 왁스를 도포함으로써 챔버를 완성합니다. 이제 동물이 전기생리학적 기록을 수행하기 위한 준비가 거의 완료되었습니다.이제 무차별 전극(indifferent electrode)을 연결하기에 적절한 시점입니다. 은선을 전갈의 혈림프 내 두 꼬리 마디 사이에 삽입하십시오. 동물 몸 밖으로 나온 전선의 일부를 점토로 눌러 고정하고, 증폭기에 닿을 수 있도록 충분한 길이를 남겨두십시오.이제 기록을 수행하기 전, 표본이 안정될 수 있도록 최소 한 시간 동안 그대로 둡니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 센서 기공 직경보다 내경이 약 2µm 더 큰 피펫을 제작하십시오. 센서 기공 직경은 개체마다 다를 수 있습니다. 기록 시작 한 시간 전에 펙틴 챔버에 5µL의 미네랄 오일을 채웁니다.그런 다음, 화학적으로 peg illa를 자극하기 위해 작동 거리(working distance)가 긴 대물렌즈와 에피 조명(epi illumination)이 장착된 고배율 현미경 아래에 동물을 배치합니다. 전해질 용액과 혼합된 수성 미각 자극제를 자극제 피펫에 채웁니다. 마이크로 피펫 필러를 사용하여 자극제를 채운 피펫을 마이크로 조작기에 연결합니다.이제 기록 전극을 자극 피펫의 열린 끝부분에 삽입하십시오. 금속 전극과 전해질 자극 용액 사이의 접촉을 확인하는 것이 중요합니다. 기록 전극과 무차별 전극의 리드선을 차동 증폭기에 연결하십시오.증폭기는 전기적 활동을 시각화하기 위해 오실로스코프에 연결되고, 전기적 변화를 청각적으로 감지하기 위해 스피커에 연결됩니다. 이제 기록을 위한 준비가 완료되었습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 센서 구멍 위로 조심스럽게 내립니다.피펫 전해질과 펙 센서(peg sens) 내의 액체 사이에 전기적 접촉이 이루어지면 더 높은 주파수로의 변화가 들릴 것입니다. 이 때 신경 활동 전위의 뚜렷한 팝핑 소리(popping) 또한 들릴 수 있습니다. 개별 센서당 화학적 자극의 지속 시간은 최대 30분에서 최소 1초까지 다양할 수 있습니다.일반적으로 피펫 하나로 30개 이상의 핀(peg)을 샘플링할 수 있습니다. 막힌 피펫은 깨끗한 피펫으로 교체하십시오. 피펫은 준비하기가 쉽고 막히는 일이 흔하므로, 항상 여분의 피펫을 준비해 두십시오.미네랄 오일을 교체하기 전까지 한 번의 기록 세션 동안 단일 개체로부터 수 시간 동안 기록하는 것이 가능합니다. 단일 개체를 기록 장치에 고정하여 며칠에 걸쳐 여러 번의 기록 세션 동안 유지할 수 있습니다. 후속 세션에서는 흉강 챔버를 재사용하되, 미네랄 오일은 교체하십시오.피펫을 사용하여 기존의 오일을 모두 제거한 후 새로운 오일 한 방울을 추가하십시오. 이는 기록 세션 동안 자극제 피펫에서 누출되었을 수 있는 잔류 자극제의 영향을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 다음은 서로 다른 자극제에 대한 대표적인 팁 기록 결과입니다.이 트레이스는 0.01 molar potassium chloride에 대한 비교적 일관된 반응을 보여줍니다. 이 펙(peg)은 0.1 molar citric acid에 대해 훨씬 더 강렬하게 반응을 시작했다가 1초 미만의 짧은 시간 내에 강도가 점차 감소하며, 이후 빈도가 줄어드는 양상을 보입니다. 30% ethanol에 대한 전형적인 반응의 경우, 0.1 molar citric acid와 같은 동일한 자극제에 대한 서로 다른 센서 반응의 팁 기록을 비교했을 때, 트레이스는 짧은 비활성 간격 사이에 여러 개의 스파이크가 나타나는 버스트 형태를 보여줍니다.반응들이 매우 유사합니다. 이 절차를 수행할 때, 오일 매질과 섞이지 않아 한 번에 하나의 융모(lum)를 화학적으로 자극할 수 있는 수성 자극제로 피펫을 채워야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 미네랄 오일을 매질로 사용하여 전갈의 빗살(pectin)에 있는 개별 CIN을 조절하며 자극하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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신경과학

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빈대는 더듬이 후각 감각에 있는 후각 수용체 뉴런에 의존하여 환경의 기호화학 물질을 감지합니다. 단일 센실럼 기록을 활용하여 기호화학 물질에 대한 빈대 반응을 평가하고 관련된 코딩 프로세스를 탐구하는 방법을 보여줍니다.

Semiochemicals에 침대 버그의 후각 신경 세포 응답을 감지하기 위해 단일 ​​Sensillum 기록을 사용하여

이 종이에 곤충 mouthparts의 palps sensilla basiconica에서 단일 sensillum 기록에 대 한 상세 하 고 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

메뚜기 벨 Sensilla Basiconica에 대 한 단일 Sensillum 녹음

곤충 센실라의 초구조를 관찰하기 위해, 스캐닝 및 투과 전자 현미경(SEM 및 TEM) 시료 준비 프로토콜을 각각 연구에서 발표되었다. Tween 20은 SEM에서 샘플 변형을 피하기 위해 고정식에 첨가되었습니다.

목공 딱정벌레의 부속물을 위한 주사 및 투과 전자 현미경의 시료 제조 방법

드물게 사용되는 전기생리학적 기록 방법인 염기 기록은 기존의 기록 방법으로는 검사할 수 없는 맛 코딩의 특징을 분석할 수 있습니다. 또한 염기 기록을 통해 기존의 전기생리학적 방법으로는 연구할 수 없는 소수성 자극에 대한 맛 반응을 분석할 수 있습니다.

염기 기록: 초파리에서 미각 뉴런의 반응을 분석하는 기법

이 연구는 동기식 ECG 기록과 함께 생체 내 칼슘 이미징을 위해 마취된 마우스의 T-DRG를 노출시키는 외과적 조작을 제시합니다. 이 방법은 말초 전기 신경 자극 및 흉부 내장 기관 입력뿐만 아니라 1차 감각 수준에서의 상호 작용을 연구하기 위한 최첨단 도구입니다.

말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

배우세요 전갈 페그 Sensilla의 전기 생리학 연구 방법을 통해 화학 감각 반응을 기록하는 기술을 익히세요. 미네랄 오일 챔버와 미세 전극을 사용하여 개별 감각기의 활동을 정밀하게 측정할 수 있습니다.

전갈 페그 Sensilla의 전기 생리학

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