매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

다음 실험의 전반적인 목표는 GAL 80 변환 도구와 함께 조직 특이적 리파아제를 사용하여 GAL 4 발현을 정제하는 것입니다. 이는 인핸서 트랩 Philippe 형질전환 플라이 라인의 컬렉션을 생성하고 각 라인에서 리파아제의 CNS 발현 패턴을 결정함으로써 달성됩니다. GFP 리포터를 사용하여 면역화학 및 GFP 보고서는 GL을 뉴런 발현과 구별하여 자손에서 GAL 80 변환 도구를 포함하는 파리를 가로질러 관심 라인에서 GAL 4개의 발현을 교차시킬 수 있습니다.

클론 분석은 눈과 같은 GAL 4 발현의 정제를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 GAL 80 변환 도구와 함께 인핸서 트랙 플레이 기반 라인을 플라이 커뮤니티에서 이미 사용할 수 있는 GAL four alliance의 빠른 컬렉션과 함께 사용할 수 있다는 것입니다. 또한 이 개념은 제브라피시와 같은 다른 GALI 4가지 UAS 신흥 모델 유기체로 확장될 수 있습니다.

이 방법은 행동의 기저에 있는 신경 회로를 매핑하는 데 있어 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 광수용체 세포의 하위 집합에서 플립 베이스(flip base)를 사용하는 것을 보여주지만, 교차법은 비신경 조직을 포함한 다른 조직의 분석에 적용할 수 있습니다. 더 많은 인핸서 트랩 리파아제 라인이 특성화됩니다.

통풍 4 미국은 파리 생물학자들이 널리 사용하는 중요한 기술입니다. 대부분의 GAL 4개 라인에 대한 한 가지 주의 사항은 손가락 방법을 사용하여 뇌 행동 매핑에 사용하기에는 너무 광범위하게 표현된다는 것입니다. 관심 티셔츠에서 GAL 4 발현을 미세 조정할 수 없습니다.ET 플립 전이유전자를 사용하여 GAL 4 발현 라인의 발현을 부분적으로 제한하기 전에.

먼저 용암 발달 후기 단계에서 ET 플립 x 두 개의 전이유전자의 발현 패턴을 알고 성인에서 플립 a의 발현을 시각화하는 것이 도움이 됩니다.CNS에서 ET t 플립 X 관심 유전자 2개를 가진 수컷과 처녀 암컷 사이의 교배를 설정하여 자손의 et 플립 발현을 위한 GFP 기자를 보유하고 있습니다. 해부를 위해 떠돌이 세 번째 instar F1 유충을 수집합니다. 깨끗한 S 가드 접시에 넣고 페인트 브러시로 이물질을 제거하고 접시를 PBS로 한 번 헹굽니다.

이제 접시에 얼음을 차갑게 채우고 PBS를 한 번 마취하여 유충을 마취시키고 용암의 CNS에 접근하고 한 쌍의 집게로 입 고리를 잡습니다. 확장된 전방 구형 근처의 큐티클을 잡고 다시 벗겨냅니다. CNS는 다른 구조와 함께 입 고리에 부착된 상태로 유지됩니다.

이제 겸자로 중추신경계를 해부할 때 중추신경계를 둘러싼 모든 과도한 구조를 제거합니다. PBS로 채워진 쓰리 월드 파이렉스 접시에 개별적으로 옮깁니다. 모든 CNS가 절개되면 얼음에 4%PFA 200마이크로리터에 완전히 담가 고정합니다.

CNS가 떠 있는 경우, 주변 조직이 모두 완전히 청소되지 않은 것입니다. 이 경우 집게를 사용하여 15분 동안 고정한 후 중추신경계가 고정액에 다시 담그고 얼음처럼 차가운 PB S3로 조직을 세척한 다음 얼음처럼 차가운 PBT로 조직을 3회 더 세척합니다. 이제 조직은 항체에 의해 이미지화 또는 라벨링되거나 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 4도의 PBT에 보관할 준비가 되었습니다.

유충이 해부 전에 F1 성체를 수집하도록 하는 데 사용된 것과 동일한 십자가의 염색. 5-10마리의 파리를 물에 담그고 95% 에탄올을 30초 동안 냉각시켜 큐티클 표면의 왁스를 제거합니다. 에탄올을 제거하려면 성인을 얼음처럼 차갑게 한 번 PBS로 세 번 씻고 세 번째 세척 후 그 중 하나를 얼음처럼 차가운 1 배 PBS로 채워진 35mm 실 가드 접시에 옮겨 성인이 해부 할 수 있도록 준비합니다.

복부 쪽이 위로 향하게 놓고 복부 중간에 미니언 핀을 삽입합니다. 집게를 사용하여 다리를 제거하여 해부를 시작합니다. 그런 다음 소품에 머리를 고정하고 동시에 눈 아래에서 머리 위쪽으로 큐티클을 벗겨내어 머리 큐티클을 제거합니다.

날카로운 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌를 둘러싼 조직을 추적하면 조직이 강한 자가형광을 가지고 있고 고정하는 동안 뇌가 떠오르기 때문에 추적하십시오. 뇌는 성인 중추신경계의 일부일 뿐입니다. 다른 부분은 흉부의 복부 신삭 또는 VNC이며 또한 절개해야 합니다.

먼저 뒷다리 기저부에 파리를 고정하고 흉부 큐티클을 목 아래까지 부드럽게 당겨 흉부 큐티클을 제거합니다. 둘째, VNC를 노출시키기 위해 흉부 큐티클의 두 반쪽을 부드럽게 펴십시오. 셋째, 두 번째 다리의 기저부에 고정하고 첫 번째 복부 교반 밤 근처에서 복부를 당겨 흉부에서 복부를 제거합니다.

넷째, 상완골 부위를 고정하고 VNC를 둘러싼 조직을 부드럽게 떼어내어 VNC를 청소합니다. 경추 결합 고리를 둘러싼 결합 조직의 고리를 찢어내고 뇌를 수집하면서 과도한 조직을 계속 제거합니다. 그리고 VNC는 얼음에 보관된 냉장 PBS로 채워진 9개의 세계 파이렉스 접시에 배로 옮깁니다.

성체 조직을 고치려면 얼음에 4% PFA에 15분 동안 담그십시오. 목욕 후에는 얼음처럼 차가운 PBS 세척 3회와 PBT 세척 3회를 실시합니다. 이제 조직을 이미징하거나 항체에 의해 라벨링하여 이식유전자 발현을 정확하게 분석할 준비가 되었습니다.

CNS를 뉴런(neuronal) 또는 신경교세포(glial) 마커로 라벨링하여 기준틀을 제공하는 것이 유용하며, 다음날 뉴런 또는 신경교세포에 대한 항체로 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 조직을 배양하는 것으로 시작합니다. PBT로 제제를 5회 세척하고 형광 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝났을 때 항체의 광표백을 방지하기 위해 플레이트와 호일을 감쌉니다.

PBS로 준비물을 씻고 준비물을 슬라이드에 전체적으로 장착합니다. 커버 슬립에 의해 조직이 찌그러지는 것을 방지하기 위해 OSHA 플라스틱 링을 사용하십시오. 이제 신경계는 형광 현미경으로 GFP 및 LL 발현 패턴을 검사할 준비가 되었습니다.

일반적으로 flip 발현 패턴의 재현성을 결정하기 위해 3-5번의 반복실험을 검사합니다. flip, a line은 다른 transgenes와 함께 사용하여 GAL four repressor GAL 80의 발현 방식을 변경할 수 있습니다. GAL 80 억제자 발현을 변경하는 것은 변화를 위한 효과적인 방법입니다.

GAL 4 발현에서 한 가지 방법은 GAL 80 발현을 뒤집어 GAL 80 발현이 GAL 4를 비활성화하여 눈 전체의 눈 퇴화를 유발하는 것입니다. ET 플립 라인 해시 6 88 A는 여기에서 F1 자손의 광수용체 하위 집합에서 GAL 80 변환 도구의 효과를 평가하고 눈 표현형을 부모 균주의 눈 표현형과 비교하는 데 사용됩니다. 눈의 기형 또는 탈색의 징후는 플립 발현 패턴이 광수용체에 존재하며 GAL 80 플립아웃이 성공적이었음을 확인합니다.

무료로, 중복되지 않는 전략은 동일한 관심 대칭 이동 선을 사용하여 GAL 80 표현식을 대칭 이동하는 것입니다. 이 전략은 다른 전략과 매우 유사하지만 이제 F1 자손의 ID 색소 침착 및 변성이 억제됩니다. 플립 X 2.

광수용체(photoreceptor)를 발현하는 방법을 숙달하면 중추신경계(CNS)를 해부할 수 있는데, 제대로 시행된다면 성체의 경우 약 5분, 유충의 경우 1분 안에 해부할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 날카로운 집게를 사용하여 성인과 Libre C를 둘러싼 기관과 조직을 제거하는 것이 중요하며 해부를 위해 고정 Ss.It 없는 접시를 사용하는 것이 중요합니다. 히트 쇼크 플립은 현재 무작위 클론을 생성하는 데 사용됩니다.

대조적으로, 인핸서 트랩 플립을 사용하면 재현 가능한 클론을 생성할 수 있어 형태학적 및 행동 분석이 더 쉬워집니다. 손가락 방법의 또 다른 강점은 추가 anan trap flip 기반 라인 및 기타 gal 라인을 사용하여 GAL 4가지 발현 패턴을 추가로 제한할 수 있다는 것입니다. 튜불린 스톱 GAL 80 구성의 약점은 GA 4와 LAG 4 및 U-A-S-K-I-R과 같은 UAS 효과기의 특정 조합이 파리를 죽이기 때문에 호환되지 않는다는 것입니다.

이 문제는 UAS Shiri Ts와 같은 조건부 UAS 이펙터를 사용하여 쉽게 극복할 수 있으며, 이를 통해 제한적인 온도에서 동작을 검사할 수 있습니다. 모든 인핸서 트랩 리파아제 라인이 유용할 만큼 충분히 높은 수준의 리파아제를 발현하는 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고 여기에 설명된 손가락 기술은 초파리 연구자들이 발달 회로 또는 행동에 대한 모자이크 분석을 개선할 수 있는 새로운 접근 방식을 제공합니다.