Name: 매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 학습하세요 FINGR 방법을 사용하여 Drosophila 중추신경계에서 조직 특이적 Gal4 발현을 정밀하게 제어하는 기술입니다. 이 방법은 신경 회로 매핑과 행동 연구에 활용됩니다.

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우리는 TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS,이 연구를 지원하는 NSF에서 오클라호마 대학 (BZ)을하고 그랜트 (IOS - 1025556, BZ 및 RAB에)에서 내부 자금 감사드립니다. NIH 그랜트 (BZ에 RO1 NS060878가) 부분 RAB를 지원. RAB는이 연구의 초기 단계를 지원하는 브랜다 이스 대학에 수여 NIH NRSA (T32 NS07292) 교육 부여, 그리고 브랜다 이스에서 제프리 홀에게 수여 NIH 그랜트 (RO1 GM21473), 인정한다. 우리는이 프로젝트에 대한 그의 지속적인 encouragements에 대한 제프리 홀 주셔서 감사합니다. 우리는 욕조 P&gt; Gal80&gt; 변형으로 우리를 제공할 박사 크리스틴 스콧 감사합니다.

1. Drosophila 종자 <ol><li> Gal4 드라이버 : photoreceptor 세포의 Gal4을 표현 GMR - Gal4. </li><li> UAS 라인 Gal4 - 표현 세포에서 신경 변성의 원인이 UAS - MJD78Q (또는 UAS - polyQ). Gal4 - 표현 세포에 GFP를 표현 UAS - GFP. </li><li> FLP 라인 photoreceptors과 뇌 영역의 하위 집합에서 FLP을 표현 어이 - FLP. FLP의 두 사본 (FLP - IRES - FLP)를 포함하는 확장기 - 트랩 라인 아르 동부 표준시 - FLPx2 라인. 우리는 누구의 표현 패턴이 특징으로 아직 아르 ~ 1000 동부 표준시 - FLP 행 (봄 외., 2010), 생성했습니다. 여기, 우리는 애벌레와 어른 비행 중추 신경계 (CNS)에서 선택한 동부 표준시 - FLPx2의 표현 패턴의 특성을 설명합니다. </li><li> FLP 기자 yw, 굴지 P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS - GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997)를 통해 동부 표준시 - FLPx2의 표현 패턴을보고 굴지 P&gt; Gal4;&gt; CD2의 FLP - 중재 recombinational 절단시 UAS - GFP. </li><li> 두 보완 Gal80 - 변환 도구 터브 P&gt; Gal80&gt; (고든 &amp; 스콧 2009 년), constitutively 강력한 tubulin 프로 모터에 의해 구동 모든 조직에서 Gal80을 표현 플립 아웃 구축. FLP - 중재 재조합시&gt; Gal80가 정신이 나갔죠하고 Gal80 표현은에 종료 동부 표준시 - FLPx2 - 표현 티슈합니다. 터브 P&gt;&gt; Gal80 (봄 외., 2010), 그만 정상적인 조건 하에서 Gal80을 표현하지 않는 구조, 기능 플립. Gal80 표현에만있는 tubulin 프로 모터에 의해 설정되어 동부 표준시 - FLPx2 - 표현 FLP가&gt; 중지를 팅겨주는군요 및 Gal80에서 화나게하는 조직합니다. </li><li> 화합물 눈을 FLP 활동을 테스트하기 위해 날아 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P&gt;&gt; 타락한 있습니다 Gal80 (봄 외, 2010). 그리고 depigmented 눈을를 중지합니다. 에서 FLP - 표현 photoreceptor 세포를 polyQ 표현은 Gal80 플립에 따라 해제되어 있습니다. GMR - Gal4, UAS - polyQ; (. 봄 외, 2010) 욕조 P&gt; Gal80&gt; 정상적인 눈을 있습니다. 에서 FLP - 표현 photoreceptor 세포를 polyQ 표현은 Gal80 플립 아웃 다음에 설정되어 있습니다. </li></ol> 2. 시약 인산 버퍼 호수 (PBS, 1X), 산도 7.4. PFA, EM 등급 (CAT # 15710, 전자 현미경 과학, 하트, PA) 16 %에서 PBS에 희석 4 % paraformaldehyde (PFA) 0.1 % 트리톤 X - 100 (시그마)를 포함 PBT, 1XPBS 안티 Elav (mAb, 9F8A9; 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와 대학교), 얼룩 Drosophila의 모든 뉴런. 안티 Repo (mAb 8D12; 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와 대학교)은 Drosophila의 얼룩 glial 세포를. 마우스 이차 항체에 대한 알렉사 594 치킨 (Invitrogen) 3. 향상제 - 트랩 FLPx2 라인의 표현 패턴을 (* 중요한 단계) 매핑 <ol><li> , yw에서 처녀의 여자를 수집 굴지 P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS - GFP 라인 및 개별 동부 표준시 - FLPx2 라인의 남성을 교차. 전자 동부 표준시 - FLP의 조직 표현 GFP 기자로서의 역할을합니다. </li><li> * 3 차 instar F1의 애벌레를 방황하고 해부하다, 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 세척, 얼음 4퍼센트 PFA 1 시간 동안 수정, CNS (즉, 뇌 및 복부 신경 코드, VNC) 및 신체 벽을 유지하여 다음 PBT와 배 씻는다. 해부 <ol><li> 제 3 instar F1의 애벌레를 방황하고 제거하고 깨끗한 Sylgard 요리 (35mm Sylgard의 2g 가득 X 10mm 페트리 접시 - 혼합 지침에 따라 제조)로 그들을 놓으십시오. <ol><li> 페인트와 음식 부스러기를 제거 </li></ol></li><li> 애벌레를 마취하기 전에 얼음을 얼음처럼 차가운 1XPBS과 장소로 접시를 채우기 </li><li> 포셉 한 쌍의있는 유충의 입 갈고리를 잡고 포셉 또 한 쌍의와 연장 앞쪽에 공기 구멍 근처 및 사후 끝 부분 표피 껍질 표피를 잡아. CNS는 침샘, 직감하고, imaginal 디스크와 함께 후크 입안에 첨부됩니다. </li><li> 초과 조직과 CNS를 둘러싼 imaginal 디스크를 제거합니다. </li><li> PBS - 채워진 3 잘 pyrex 접시에 CNS를 전송합니다. <ol><li> siliconized P200 피펫 팁은 조직을 건조하지 않도록하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 얼음 4퍼센트 PFA 200 μl 1 시간 동안 수정. <ol><li> CNS 완전히 PFA에 빠져들 있는지 확인하십시오. <ol><li> CNS가 수레 경우, 일반적으로 CNS가 제대로 주변 조직에서 청소 아니라는 것을 제안합니다. </li></ol></li></ol></li><li> PBT와 배 세척 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 씻으십시오. </li></ol></li><li> * 성인 F1의 파리의 CNS를 해부하다. <ol><li> CO 2와 함께 파리를 마취 또는 10 분 동안 얼음에 빈 유리병 안에 들어있는 파리를 놓으십시오. </li><li> 플레이스 성인 30 초위한 얼음에 95 % EtOH - 가득한 유리 그릇에 난다. </li><li> 얼음 유리 접시를 가득 1XPBS에 성인 파리를 전송합니다. <ol><li> 잔류 EtOH를 제거하는 차가운 1X PBS로 3 배 와시 </li></ol></li><li> 35mm Sylga에 파리 플레이스차 요리는 얼음처럼 차가운 1X PBS로 가득 </li><li> 최대 직면하고있는 복부 측면을 놓고 복부를 통해 (minutiens 핀 0.1 mm) 미드웨이를 작은 곤충 펜을를 삽입합니다. <ol><li> 포셉 한 켤레를 사용하면 다리의 기반을 잡고 포셉 또 한 쌍의와 다리를 제거합니다. </li></ol></li><li> 머리 표피를 제거 <ol><li> 포셉 한 쌍의와 코를 잡았지만, 눈 아래와 파리 머리의 등 부분의 중간 라인으로 표피 껍질 다른 장소. </li><li> 다른 시선을 잡고 반대쪽에 남아있는 표피를 제거합니다. </li><li> 날카로운 집게 및 / 또는 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 머리를 주변 tracheal 조직을 제거 <ol><li> 기관의 부적 절한 청소 GFP 발현을 방해하고, 자동 형광 강한의 결과, 그리고 두뇌 고치는 동안 부동하실 수 있습니다 </li></ol></li></ol></li><li> VNC의 해부 <ol><li> 흉부 표피를 제거 <ol><li> 제 3의 preepisternum 양쪽 두 개의 집게 (즉, 뒷다리의 기반을 잡아)은 장소, 흉부의 사후 끝에 시작. </li><li> 부드럽게, 멀리 복부 정중선 라인에서 표피를 분리하면 목 기지에 도달할 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 부드럽게 VNC를 노출 흉부 표피의 두 반쪽을 확산 </li></ol></li><li> 다음 흉부에서 복부를 제거합니다. 두 번째 다리 기지에서 흉부를 잡아 포셉 한 켤레를 사용하는 동안, 제 1 회 복부 sternite 근처의 복부를 움켜 포셉의 다른 쌍을 사용하여 복부를 당겨. </li><li> 주변 흉부 조직에서 VNC를 제거하려면 다음과 같이하십시오. 포셉 한 쌍의과 멀리 포셉 부드러운 눈물 흉부 시체의 대부분의 다른 쌍의과 상박 골의 영역을 잡아. </li><li> 이 시점에서 자궁 결합 (목) 주변 결합 조직의 고리가 있어야합니다. 이 집게를 사용하면 분리 반지를 눈물. </li><li> VNC를 둘러싼 초과 가슴 조직을 제거 </li></ol></li><li> 얼음 1X PBS를 포함하는 9 - 잘 Pyrex 요리에 두뇌와 VNC를 전송 <ol><li> siliconized P200 피펫 팁은 조직을 건조하지 않도록하는 데 사용할 수 있습니다 </li></ol></li></ol></li><li> * 얼음 4% PFA 1 시간 동안 성인 CNS를 고정하고 PBT와 얼음처럼 차가운 PBS와 배로 배 세척. </li><li> 4 성인 CNS 준비 또는 애벌레 CNS와 신체 벽을 품어 ° C 중 뉴런 (안티 - Elav, 1시 10분) 또는 glia (anti-Repo. 1시 10분)에 항체와 하룻밤. PBT와 5 배 준비를 씻으십시오. </li><li> 2 시간을 위해 실내 온도에서 마우스 보조 항체 (1:100)에 대한 알렉사 594 닭고기와 성인이나 애벌레 준비 부화하고, PBS로 준비를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드에있는 애벌레 또는 성인 CNS를 탑재합니다. CNS의 자연 형태를 유지하려면, 커버 슬립을 중단하는 미니 다리로 슬라이드에 O - 모양의 플라스틱 반지를 (일반 강화 라벨, 에이버리 데니슨, Office 제품, 브레아, CA)을 사용합니다. </li><li> 형광 현미경으로 GFP 및 Elav (또는 Repo) 표현을 패턴에 대한 준비를 검사합니다. </li></ol> 4. photoreceptors의 탄압 Gal4 두 개의 상호 보완적인 Gal80 - 변환 도구의 응용 <ol><li> 욕조를 통해 P를 Gal80를 틀지&gt; Gal80&gt; (그림 5A). <ol><li> 욕조 P&gt; Gal80&gt; 라인, GMR - Gal4, UAS - polyQ에서 수컷를 수집합니다. 복합 눈이 파리에서 정상 있습니다. </li><li> 어이 - FLP의 처녀와 친구. </li><li> F1 파리를 수집하고 눈 표현형을 확인합니다. </li></ol></li><li> 를 통해 욕조에 Gal80도 틀지 P&gt;&gt; Gal80 (그림 5B)를 중지합니다. <ol><li> GMR - Gal4, UAS - polyQ를 수집, 욕조 P는&gt;&gt; Gal80 남성 파리를 중지하고 안과 표현형을 확인합니다. 타락한 참고 이러한 파리의 depigmented 눈이 야생 유형 종자 (캔턴 - S)에 비해 </li><li> 어이 - FLP의 처녀와 메이트; </li><li> F1 파리를 수집하고 눈 표현형을 확인합니다. </li></ol></li><li> 선택 동부 표준시 - FLPx2 photoreceptor 세포의 표현과 함께 라인 </li></ol> 단계 4.1 및 4.2는 동부 표준시 - FLPx2 라인을 사용하여 반복 수 photoreceptor 세포의 일부에서 표현 FLP 것을. 또는, 두 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P&gt; 중지&gt; Gal80 파리 또는 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P&gt; Gal80&gt; 파리는 선 스크린 개별 동부 표준시 - FLPx2 라인을 넘어 수 표현 photoreceptor 세포에서 FLP. 가치 동부 표준시 - FLPx2 라인은 그 것을 집합 또는 단일 photoreceptor 세포 (그림 6)에서만 익스프레스 FLP. 5. 대표 결과 특정 동부 표준시 - FLPx2 라인의 표현 패턴은 쉽게 검사하고 yw, 굴지 P 사이의 십자가에서 파생된 F1 유충이나 파리 성충에 설명되어 있습니다&gt; CD2&gt; Gal4, UAS - GFP의 처녀 및 ET - FLPx2 남성 (그림 1) . 일반적으로 3-5는 해부와 FLP 표현 패턴 (봄 외., 2010)의 재현성을 결정하기 위해 검사하는 F1 동물의 복제합니다. <st cns flpx2 flp glial>(그림 3 및 4)을 사용하여 분석하실 수 있습니다. </st> 그림 7에 표시된 결과는 Gal80 플립 기능의 효과를 설명하고 Gal4 다음 FLP - 중재 재조합의 교차 억압 시스템을 아웃 플립. 욕조 P&gt; 중지&gt; Gal80 구조는 Gal80의 새는 표현 (photoreceptors의 균일한 변성과 depigmentation 기준) 가지고 표시되지 않으며 아직은 주체할에 eyFLP의 도움으로 Gal80도 틀지 100 % 효과가 GMR을 Gal4 및 정상 모습 (그림의 7A)로 시선을 복원합니다. 반대로, 욕조 P는&gt; Gal80가&gt; 완전히 이전 eyFLP의 도입에 GMR - Gal4을 represses. GMR - Gal4 드라이브 UAS - polyQ 표현은 depigmented 눈 (그림의 7B) 타락한 및 선도, Gal80를 플립 아웃 다음. 이 예제에서, 우리는 photoreceptor '회로'를지도로 판 - photorecetor의 FLP를 사용하지만 행동 결과를 검사하지 않았다. behaviorally 관련 Gal4 라인과 유사한 방법을 사용하여, 우리는 파리 성충의 날개 확장 (봄 외., 2010) 규제 CCAP - Gal4 회로의 일부를 매핑. 우리는 FINGR 방법은 행동의 연결을 바탕으로 우리의 이해를 돕고에 도움이 될 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. . 동부 표준시 - FLPx2 라인의 표현 패턴을 검토 동부 표준시 - FLPx2 라인에서 FLP 표현 패턴하기 (파란 타원) 동부 표준시 - FLPx2 남성 (상단 왼쪽) 굴지 P&gt; CD2로&gt; Gal4를 건너에 의해 결정 수 있으며, UAS - GFP 처녀 (오른쪽 위). 유비 쿼터스 굴지 P 부모의 여성에서&gt; Gal4 표현은 FRT (회색 삼각형)의 어귀 CD2 시퀀스의 삽입에 의해 방해합니다. F1 자손에서 FLP는 엑사이스 CD2 순서를&gt; Gal4는 UAS - GFP 발현을 드라이브에 굴지 P을 허용합니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 애벌레와 어른이 중추 신경계에 동부 표준시 - FLPx2 라인 표현 패턴. 이러한 이미지는 짝짓기 yw, 굴지 P에서 생산되는 자식의 해부 CNS를 (뇌 및 복부 신경 코드, VNC) 묘사&gt; CD2&gt; Gal4, 동부 표준시 - 173A FLPx2 라인 UAS - GFP 부모. &gt; CD2&gt; 카세트를 recombining하여 FLP는 굴지 P&gt; GAL4 표현 (UAS - GFP의 결과의 표현)가 활성화됩니다. 따라서 GFP 패턴 FLP - 표현 세포를보고합니다. 패널 B는 라인 173A의 성인 표현식 패턴을 보여주는 반면, 패널은 애벌레 FLP 표현 패턴을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 동부 표준시 - FLPx2 라인 # 688A에 flippase을 표현 세포 유형의 특성화. A, 동부 표준시 - FLPx2 라인 # 688A와 GFP Flippase보고 라인 사이에 십자가에서 안티 REPO 물들일 고정 F1 제 3 instar의 유충의 합성 이미지. 3 차 instar의 유충에서 VNC의 뒷부분 끝에서 가져온 BD, 높은 배율 (자이스 혈구 계획 - 고차 색지움 63x 오일) 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 동부 표준시 - FLPx2 라인의 버섯 신체 내의 세포 유형의 특성화 # 150. AC, 안티 REPO 물들일 고정 F1 세번째 instar의 유충에서 버섯 신체의 높은 배율 이미지 (63x 기름 침지). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. Gal80 플립 -와 플립 아웃 전략의 삽화. 플립 아웃 전략 A., tubulin 모터 구동 Gal80 (터브 P&gt; Gal80&gt;) GMR - Gal4의 억압과 야생 타입 눈 표현형 (레드 아이)의 결과, constitutively 활성화됩니다. 이 억압은 Gal80 아웃 (중, 빨간색) 플립 및 GMR - Gal4가 UAS - polyQ 표현을 운전하실 수 있습니다 FLP (보라색)의 도입에 의해 제거됩니다. photoreceptor 세포 변성이 결과를 (눈에 흰색 점의 그림). B. 이전 전략의 상호에서 tubulin 모터 구동 Gal80 표현은 "중지"코돈 어귀 FRT (회색 삼각형)으로 중단됩니다. Gal80의 부재에서 GMR - Gal4은 photoreceptors로의 연결을 퇴보를 (눈에 흰색 점의 그림)의 원인 UAS - polyQ에 바인딩합니다. GMR - Gal4, UAS - polyQ 횡단하여, 욕조 P&gt;를 photoreceptor 세포에서 FLP을 표현 처녀 암컷, FLP (보라색)과&gt; GAL80 남성은 "그만하세요"코돈 (중간을 절개, FRT 사이트에서 재조합을 catalyze 중단됩니다, 적색), 따라서 Gal80 표현과 GMR - Gal4의 억압에 대한 수 있도록합니다. 이것은 (W의 부족에 의해 그림 photoreceptor 세포의 neurodegeneration을 보유눈에 하이트 점). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 동부 표준시 - FLPx2 라인에게 # 688A를 사용하여 밖으로 Gal80도 틀지에서 FINGR 방법의 응용 프로그램 동부 표준시 - FLPx2 라인 사이의 교차 GMR - Gal4, UAS - polyQ에 # 688A 처녀에서 F1 자손;. tubP&gt; GAL80 남성. 눈 ommatidia의 한가운데에 색소의 부족 라인 # 688A에서 FLP 표현을 나타냅니다. 이 분야에서 GMR - Gal4의 Gal80 진압은 Gal4가 UAS - polyQ 운전 있도록 안심했습니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. photoreceptors에서 Gal4을 교차에 또는 밖 Gal80도 틀지에서 FINGR 방법의 응용 프로그램입니다. A. 욕조 P&gt;&gt; Gal80 플립의 시스템 FLP 종속적인 방식으로 GAL4 표현을 제한 중지합니다. 년 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P가&gt; 중지&gt; GAL80 파리, photoreceptor 세포가 퇴화하고 depigmented 아르 (왼쪽 날아). eyFLP의 도입에 따라, Gal80가 차례로 표현 polyQ를 끄고는 다음과 같이 정상적인 눈을 가진 파리 (오른쪽 플라이)를 생산 GMR - Gal4의 모든 억압의 결과로, photoreceptor 세포에 표현된다. B. 욕조 P&gt; Gal80&gt; 플립은 아웃 시스템이 욕조로 반대 방식으로 작동 P&gt; 중지&gt; Gal80 플립 - 인 시스템입니다. 터브 P는&gt; Gal80은&gt; constitutively GAL4을 represses하고 polyQ의 표현 (일반 눈으로, 파리 왼쪽) 표시되지 않습니다. eyFLP의 도입에 따라, Gal80는 GMR - Gal4의 억제을 덜어하고 표현 polyQ 켜기, photoreceptor 세포에서 밖으로 뒤집혀 있습니다. 이것은 퇴화하고 depigmented 눈 (오른쪽 플라이)와 파리가 발생합니다.

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</ol>

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Gal4/UAS 시스템은 널리 성공적으로 다양한 생물 학적 연구 Drosophilists (; 뒤피, 2002 년 브랜드 &amp; Perrimon, 1993)에 의해 사용되고 있습니다. 날짜하려면, 파리 사회는 모터 구동 및 확장기 - 트랩 Gal4 라인의 수천을 생성했다. FINGR 방법의 가장 큰 장점은 그것이 가능 상당히 Drosophila 연구 Gal4의 파워를 확장하고, Gal4/UAS 시스템과 호환된다는 점입니다. FINGR 방법 중 하나는 중요한 응용 프로그램 Gal4/Gal80 교차로를 통해 동작을 기본 조정할 신경 회로입니다. 이러한 행동은 포함할 수 있지만 학습 및 메모리, 구애, 수면, 그리고 circadian 리듬에 제한되지 않습니다. FINGR 방법은 또한 알츠하이머와 같은 neurodegenerative 질병 인간, 루게릭병 (ALS), 그리고 파킨슨병의 질병을 모델링 neurodegeneration하는 경향이있는 중요한 신경을지도하는 데 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 중재 코카인, 알코올 및 기타 물질 중독에 중요한 신경이나 신경 회로의 foci는 FINGR 방법을 사용하여 매핑 수 있습니다. 신경 회로 및 동작의 시간적 통제하기 위해 FINGR 메서드와 함께 사용할 수 있으며, 이것은 조건부 Gal4s가 (.. 로마 외, 2001 Osterwalder 외, 2001)을 언급해야합니다. 온도에 민감한 Gal80 (Gal80 TS, 맥과이어 외., 2003)을 사용하여 Gal80 - 변환 도구의 수정 생산할 수 욕조 P&gt; 중지&gt; Gal80 TS 또는 욕조 P&gt; Gal80 TS&gt; 회로 조작에서 추가 관자놀이 flexibilities을 추가. 신경계 외에도 FINGR 방법은 날개 또는 다리인지 여부 세포의 하위 집합에 Gal4 표현을 제한하기 위해 동일하게 적용됩니다. 동부 표준시 - FLPx2 라인 MARCM (리 &amp; 루오, 1999)를 포함하여 FRT / FLP 기반 clonal 분석 (쑤 &amp; 루빈, 1993)에 관심이 모든 Drosophila의 생물학을위한 귀중한 자원 것입니다. 또한 일부 동부 표준시 - FLPx2 라인 재현성 클론을 생산 및 반복 형태학의 및 행동 분석을위한 heatshock - FLP를 대체할 수있는 것으로 예상된다. 향상제 - 트랩 Gal4 라인과 마찬가지로, 대부분의 동부 표준시 - FLPx2 라인 하나의 관심의 세포에 구체적으로 표현하지 않을 수 있습니다. 대부분의 라인은 관심의 세포에 잘 다른 세포 또는 조직에서 FLP을 표현합니다. 그러나, Gal4 및 ET - FLPx2 모두의 &#39;조직 특이성&#39;의 부족은 오랫동안 자신의 겹치는 영역이 특정 실험을 위해 바람직으로 FINGR 방법에 대한 주요 관심사되지 않습니다. FINGR는 세련된 하나에이 &#39;확장&#39;시스템을 설정하도록 설계되었습니다. 이러한 프로토콜에 설명된 방법은 오히려 표준이며 재현성해야합니다. 자기의주의를 필요로하는 주요 경계의 단계는 정착액의 선택 및 사용하고 있습니다. 그들은 GFP 신호를 끄지 때문에 PFA 이외 Fixatives은 피해야한다. 우리는 또한 해부 접시는 FLP 표현이 안정적으로 GFP에 의해보고되지 않습니다 가능성을 피하기 위해 PFA와 고정을 위해 사용해서는 안된다는 지적했습니다.

매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 flippase의 표현의 응용 drosophila cns

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Gal4 / UAS 바이너리 방식은 Drosophila의 유전자와 신경 회로 조작을위한 강력한입니다. 대부분의 신경 생물학 연구하지만, Gal4 표현은 거의 행동 설치 했어요와 회로의 정확한 상관 관계에 대한 충분한 조직을 특정하지 않습니다. 이 주요 장애물을 극복하기 위해, 우리는 최근 관심의 조직에 더 제한 Gal4 표현을 달성하기 FINGR 방법을 개발했습니다. FLP / FRT - 중재 Gal80 변환 도구 2) 세트,, 전통 Gal4/UAS 제도 1) 3) 확장기 트랩 FLP (동부 표준시 - FLP) : FINGR 방법은 세 가지 요소가 있습니다. Gal4은 관심의 주요 신경 회로를 정의하는 데 사용됩니다. 와 Gal4을 벗긴 껍질 UAS - 효과기 등 UAS - MJD78Q 또는 UAS시 TS로 비행 동작의 변경으로 나타나신 차례에의 연결을 활동을 규제. 추가로 같은 UAS - GFP, 특정 동작에 관련된 신경 회로와 같은 UAS - 기자는 동시에 형태학의 분석을 위해 매핑 수 있습니다. 욕조 P&gt; Gal80&gt; ( &#39;아웃 플립&#39;)와 욕조 P&gt;&gt; Gal80 ( &#39;플립 안에&#39;) 중지. 광범위한 표현과 Gal4 라인의 경우, Gal4 표현 두 보완 Gal80 - 변환 도구를 사용하여 제한할 수 있습니다 마지막으로, 조사는 조직에 특정한 동부 표준시 - FLP의 도움으로, 각각 Gal80을 켜거나 끌 수 있습니다. 에서 플립 모드, Gal80가 Gal4 및 ET - FLP가 교차하는 곳에 Gal4 표현을 주체할 수 있습니다. 플립 아웃 모드에서는, Gal80 안에 Gal4와 FLP 중복 세포에 Gal4 탄압을 완화합니다. 두 접근 방법은 Gal4 정의 회로에서 세포의 수를 제한을 사용하지만, 반대 패턴 인치 FINGR 방법은 Gal4 플라이 사회에서 라인과 전통 clonal 분석과 신경 회로 매핑에 대한 높은 다용도의 광대한 수집과 호환됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 선택 동부 표준시 - FLPx2 라인과 photoreceptor 세포에서 FINGR 방법의 효과에 FLP 표현 패턴 매핑을 보여줍니다. FINGR 방법의 원리는 또한 Gal4/UAS, Gal80 및 FLP / FRT를 사용하는 다른 유전자 모델 생물에 적용해야합니다.

우리는 조직에 특정한 FLP는 Gal80 표현식 패턴을 결정 수 있도록 Flippase 유도된 교차 Gal80/Gal4 억압 (FINGR) 메서드를 설명합니다. 어디서나 Gal4 및 FLP의 중복은 Gal4 표현은 켜져 있습니다 (Gal80가 정신이 나갔죠) 또는 해제 (Gal80가 뒤집혀). FINGR 방법은 clonal 분석과 신경 회로 매핑을위한 다목적 있습니다.

매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

Gal4/UAS 이진법은 초파리의 유전자 및 신경 회로 조작에 있어 매우 강력한 방법입니다. 하지만 대부분의 신경생물학 연구에서 Gal4는...

다음 실험의 전반적인 목표는 GAL4 발현을 조직 특이적 lipase와 GAL80 전환 도구를 사용하여 정교화하는 것입니다. 이는 enhancer trap Philippe 형질전환 초파리 라인 집단을 생성하고, 각 라인에서 lipase의 CNS 발현 패턴을 결정함으로써 달성됩니다. GFP 리포터 면역화학법과 GFP 리포트를 사용하여 글리아(glia) 발현과 신경세포 발현을 구분함으로써, 관심 있는 ET flip 라인의 GAL4 발현을 GAL80 전환 도구가 포함된 자손 초파리의 발현과 교차시킬 수 있습니다.클론 분석은 눈과 같은 조직에서 GAL4 발현의 정밀화를 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 엔핸서 트랩 기반 라인을 GAL80 전환 도구와 함께 사용하여 초파리 연구 커뮤니티에서 이미 사용 가능한 방대한 GAL4 라인 모음을 신속하게 활용할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 개념은 제브라피시와 같이 GAL4 UAS 시스템이 도입된 다른 모델 생물로 확장될 수 있습니다.이 방법은 행동의 기저가 되는 신경 회로를 매핑하는 데 있어 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜은 광수용기 세포의 일부 집합에서 flip base의 사용법을 보여주지만, 이 교차 방법은 비신경 조직을 포함한 다른 조직의 분석에도 적용될 수 있습니다. 더 많은 enhancer trap lipase 라인이 특성화됨에 따라 더욱 유용해질 것입니다.GAL4/UAS 시스템은 초파리 생물학자들이 널리 사용하는 중요한 기술입니다. 대부분의 GAL4 라인의 한 가지 주의점은 발현 범위가 너무 넓어 flp-out 방법을 이용한 뇌 행동 매핑에 사용하기 어렵다는 것입니다. ET-flip 트랜스젠을 사용하여 GAL4 발현 라인의 발현 범위를 부분적으로 제한하기 전에는 관심 있는 특정 영역에서 GAL4 발현을 미세하게 조정하는 것이 불가능합니다.우선, CNS에서 flip a의 발현을 시각화하기 위해 후기 발달 단계의 유충과 성체에서 ET flip x two 트랜스진의 발현 패턴을 파악하는 것이 유용합니다. 관심 대상인 ET t flip X two 트랜스진을 가진 수컷과, 자손을 통해 et flip 발현을 확인할 수 있는 GFP 리포터를 가진 처녀 암컷을 교배시킵니다. 해부를 위해 방랑하는 3령 F1 유충을 수집합니다. 유충들을 깨끗한 S guard dish에 옮기고 붓으로 이물질을 제거한 후, 1x PBS로 dish를 한 번 헹굽니다.이제 디쉬에 얼음처럼 차가운 1× PBS를 채워 유충을 마취시킨 후, 유충의 CNS에 접근하기 위해 핀셋으로 입 갈고리(mouth hook)를 잡습니다. 앞쪽으로 뻗어 나온 구형 큐티클 근처를 잡고 뒤로 벗겨냅니다. CNS는 다른 일부 구조물과 함께 입 갈고리에 부착된 상태로 유지됩니다.이제 핀셋을 사용하여 CNS를 해부하면서 CNS 주변의 모든 불필요한 구조물들을 제거합니다. 제거한 구조물들은 PBS가 채워진 3구 Pyrex dish에 각각 옮겨 담습니다. 모든 CNS 해부가 완료되면, 얼음 위에서 200 µL의 4% PFA에 완전히 담가 고정합니다.CNS가 떠오른다면 주변 조직이 완전히 제거되지 않은 것입니다. 이러한 경우, 핀셋을 사용하여 CNS를 고정액에 다시 담가 15분간 고정하고, ice cold PBS로 3회 세척한 후 ice cold PBT로 다시 3회 세척하십시오. 이제 조직을 이미지화하거나 항체로 라벨링할 수 있으며, 또는 추후 사용을 위해 4 °C의 PBT에 보관할 수 있습니다.유충 제작에 사용된 동일한 교배군으로부터 해부 전 F1 성체를 수집합니다. 큐티클 표면의 왁스를 제거하기 위해 파리 5~10마리를 차갑게 식힌 95% ethanol에 30초 동안 담급니다. 에탄올을 제거하기 위해 성체를 ice cold 1x PBS로 3ครั้ง 세척하고, 세 번째 세척 후 성체 한 마리를 ice cold 1x PBS가 채워진 35 millimeter sil guard dish로 옮겨 해부를 준비합니다.복부 쪽이 위로 향하게 놓고 복부 중앙에 미니언 핀(minion pin)을 꽂습니다. 핀셋을 사용하여 다리를 제거함으로써 해부를 시작합니다. 그런 다음 지지대에 머리를 고정하고, 눈 아래쪽에서 머리 꼭대기 방향으로 큐티클을 벗겨내어 머리 큐티클을 제거합니다.날카로운 핀셋을 사용하여 조심스럽게 뇌 주변의 track 조직을 제거하십시오. track 조직은 강한 자가형광을 띠며 고정 과정 중 뇌를 떠오르게 하기 때문입니다. 뇌는 성체 CNS의 일부일 뿐입니다. 나머지 부분은 흉부의 복측 신경삭(ventral nervous cord, VNC)이며, 이 또한 함께 적출해야 합니다.먼저, 뒷다리 기부를 고정하고 흉부 큐티클을 목 기부까지 조심스럽게 벗겨내어 제거합니다. 둘째, VNC를 노출시키기 위해 흉부 큐티클의 양쪽 절반을 부드럽게 벌립니다. 셋째, 두 번째 다리 기부를 고정하고 첫 번째 복부 마디 근처에서 복부를 당겨 흉부로부터 분리합니다.넷째, 상완 부위를 고정한 후 VNC 주변의 조직을 조심스럽게 떼어내어 VNC를 세척합니다. 경추 결합 조직을 둘러싸고 있는 결합 조직 고리를 떼어내고, 뇌를 수집하면서 계속해서 과잉 조직을 제거합니다. 그리고 뇌와 VNC를 한 쌍씩 얼음 위에 보관된 냉각된 1× PBS가 채워진 9-well Pyrex 디쉬로 옮깁니다.성체 조직을 고정하려면 4% PFA에 담가 얼음 위에서 15분 동안 둡니다. 이후 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척하고, 이어서 PBT로 3회 세척합니다. 이제 조직은 이미지 촬영이나 항체 표지를 통해 형질전환 유전자 발현을 정확하게 분석할 준비가 되었습니다.참조 체계를 제공하기 위해 신경세포 또는 교세포 마커로 CNS를 라벨링하는 것이 유용합니다. 먼저 조직을 신경세포 또는 교세포 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 준비물을 PBT로 5회 세척한 후 형광 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양이 끝나면 항체의 광퇴색을 방지하기 위해 플레이트를 호일로 감싸십시오.PBS로 시료를 세척하고, 슬라이드에 시료를 통째로 마운트합니다. 커버슬립에 의해 조직이 눌리는 것을 방지하기 위해 OSHA 플라스틱 링을 사용하십시오. 이제 형광 현미경 하에서 GFP 및 LL 발현 패턴을 조사할 수 있도록 신경계 준비가 완료되었습니다.일반적으로 flip 발현 패턴의 재현성을 확인하기 위해 3~5개의 반복 시료를 검사합니다. flip, a 라인의 flip 발현 패턴은 다른 외래 유전자와 함께 사용하여 GAL 4 억제제인 GAL 80의 발현 방식을 변경하는 데 사용될 수 있습니다. GAL 80 억제제 발현을 변경하는 것은 변화를 유도하는 효과적인 방법입니다.GAL4 발현에서 한 가지 방법은 transgene GAL80 발현을 통해 GAL4 발현을 제거하는 것이며, GAL80 발현은 그렇지 않으면 눈 전체에서 퇴행을 유도하는 GAL4를 불활성화합니다. 여기서는 ET flip 라인 hash 6 88 A를 사용하여 F1 자손의 광수용체 일부에서 GAL80 전환 도구의 효과를 평가하고, 눈의 표현형을 부모 계통의 눈 표현형과 비교합니다. 눈의 기형이나 탈색이 나타나면 flip 발현 패턴이 광수용체에 존재하며 GAL80 flipout이 성공했음을 확인하는 것입니다.상호 보완적인 비중복 전략은 동일한 관심 flip 라인을 사용하여 GAL 80 발현을 flip-in 시키는 것입니다. 이 전략은 다른 방법과 매우 유사하지만, 이제 F1 자손에서 ID 색소 침착과 퇴행이 억제됩니다. flip X two에서 확인하십시오.광수용체 발현. CNS 해부법을 숙달하면 적절히 수행했을 때 성체는 약 5분, 유충은 1분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 성체와 Libre C 및 Ss 모두에서 기관(trachea)과 주변 조직을 제거하기 위해 날카로운 핀셋을 사용하는 것이 중요합니다. 해부 시에는 고정제가 없는 접시를 사용해야 합니다. 현재 무작위 클론을 생성하기 위해 Heat shock flip 방식이 사용되고 있습니다.반면, enhancer trap flip을 이용하면 재현 가능한 클론을 생성할 수 있어 형태학적 및 행동 분석이 더 용이해집니다. finger 방법의 또 다른 장점은 추가적인 anan trap flip 기반 라인 및 다른 gal 라인을 사용하여 GAL four 발현 패턴을 더욱 제한할 수 있다는 점입니다. tubulin stop GAL 80 구성의 단점은 LAG four 및 U-A-S-K-I-R와 같은 특정 GA four와 UAS 이펙터의 조합이 초파리를 사멸시키기 때문에 서로 호환되지 않는다는 것입니다.이 문제는 UAS Shiri Ts와 같은 조건부 UAS 이펙터를 사용하여 쉽게 해결할 수 있으며, 이를 통해 예상대로 제한 온도에서 행동을 관찰할 수 있습니다. 모든 인핸서 트랩 리파아제 라인이 유용한 수준의 높은 리파아제를 발현하는 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고, 여기서 설명한 핑거 기법은 초파리 연구자들이 발달 회로 또는 행동에 대한 모자이크 분석을 정교화할 수 있는 새로운 접근법을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

학습하세요 FINGR 방법을 사용하여 Drosophila 중추신경계에서 조직 특이적 Gal4 발현을 정밀하게 제어하는 기술입니다. 이 방법은 신경 회로 매핑과 행동 연구에 활용됩니다.

매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

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