Name: 자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 학습하세요 LIMACS 기법을 이용하여 지질 소포-중재 동질 크로마토그래피로 단백질-지질 상호작용을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기법은 세포 내 생리학적 환경에서 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 NIH 보조금 R01NS046835과 R01AG034389, 그리고 천 부여 6FY08 - 322 3 월 지원했다. 특별한 당신이 맥을 기술에 그녀의 통찰력과 함께 엄청난 도움을 부인 엘리 노어 브라운 (Miltenyi Biotec, 오번, CA)에 전념합니다 감사합니다. Miltenyi은 아낌없이 무료로 실험의 시연에 사용되는 자료를 제공하고 있습니다. 또 세포 라인을 표현 PKCζ을 생성 박사 ​​Guanghu 왕 (조지아 / 조지아 보건 과학 대학, 오거 스타의 메디컬 칼리지, GA)에 감사드립니다. 조지아 / 조지아 보건 과학 대학 (박사 린 메이의 지도자의 임기 미만)의 의료 대학에서 분자 의학 연구소에 의해 지원도 인정받고 있습니다.

1. 소개 자기 - 활성화된 셀 정렬 (LIMACS) 기법을 사용하여 지질 소포 - 중재 친화 크로마 토그래피는 ceramide - 관련 단백질 단지가 1-3 분리하기 위해 연구실에서 개발되었습니다. 원래, 지질 vesicles는 vesicles과 관련된 단백질을 분리하는 자기 입자 - 복합 Annexin V를 (phosphatidylserine 고도로 affine)를 사용하여 Mac 용 허용 ceramide와 phosphatidylserine의되었다. 이 ceramide - 연결된 극성 복잡하고 세포에서 ceramide 결합 단백질의 분리의 체외의 reconstitution에 3 lysates 위해 우리는 LIMACS 기술을 사용해 왔습니다. LIMACS은 vesicles (예 : glycolipid - specifc lectins 또는 지질 항체)의 절연 다른 상호 작용 파트너를 사용하여 수정할 수 있습니다. 2. 실험 절차 지질 Vesicles 및 aPKCBinding Assays의 준비 <ol><li> 지질 vesicles은 phosphatidylserine (105 μg)과 대형 리포좀 준비 1,4-7에 대한 변경 절차는 다음과 C16 - ceramide (85 μg)의 몰 금액의 건조 혼합물에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 지질 혼합물은 다음 resuspended 50 MM 트리스 / HCL (산도 7.5) 150 MM NaCl로 구성된 소포 버퍼 100 μl 1 H에 대한 sonicated 수 있습니다. </li><li> 0.1 MM MnCl 2 보충 소포 버퍼 300 μl를 추가 후, 샘플 4 20 분 12,000 μ의 g ° C.에 centrifuged 아르 </li><li> 펠렛은 (대형 지질 vesicles) 소포 버퍼 100 μl에 resuspended 37 1 H에 대한 Vybrant CM - diI ​​1 nmol와 incubated 있습니다 ° C가 맥 분리 후 소포 분획을 시각화합니다. Vybrant CM - diI ​​특별히 지질 세포막에 통합 빨간색 형광 염료이다. </li><li> 세제없는 세포 lysate은 원심 분리에 의해 막의 파편의 제거 다음 hypotonic 버퍼 (프로 테아제와 인산 가수 분해 효소 억제제 10 MM 트리스 / HCL (산도 7.0)) 300 μl에 sonication / 세포의 균질로 준비가되어 있습니다. 1 H 100,000 XG에서 원심 분리 단계는 phosphatidylserine를 포함하는 내생 세포막과 세포 lysate의 오염을 방지하기 위해 추가되어야합니다. </li><li> 삭제 lysate은 지질 소포의 정지에 추가하고, 혼합물은 4 ° C. 2 H에 대한 incubated입니다 </li><li> 반응 혼합물은 20x Annexin V 구속력 버퍼와 Annexin V에 복합 자기 구슬을 포함하는 솔루션을 50 μl 20 μl로 보충됩니다 4 1 H ° C.위한 인큐베이션 다음 </li><li> 맥스는 제조 업체 (Miltenyi Biotec (주)) 프로토콜에 따라 수행됩니다. 지질 vesicles의 존재와 수량은 microplate 형광 판독기를 사용하여 흐름 통해 용출 분수에 Vybrant CM - diI의 형광을 모니터링에 의해 결정됩니다. </li><li> 기공을 갖는 지질의 금액과 형광 강도 사이의 선형 상관 관계 소포 - 바운드 Vybrant CM - diI는 Annexin V - 기반 Mac에 적용된 지질 혼합물의 양적 고성능 박막 크로마 토그래피 (HPTLC)에 의해 확인됩니다. </li><li> ceramide / phosphatidylserine vesicles에 aPKC 또는 다른 단백질의 바인딩 반응의 특이성은 ° C 부화하기 전에 4 개의 1 H에 대한 세포 lysate를 부화 방지 PKCζ 토끼 polyclonal 항체의 1 μg을 사용하여 항체의 경쟁 분석에 의해 확인 지질은 vesicles. </li><li> 맥스 eluate에서 ceramide / phosphatidylserine vesicles에 바인딩 단백질은 SDS - PAGE와 immunoblotting으로 분석됩니다. </li></ol> 체외 지질 - 단백질 복합 극성에 <ol><li> 지질 - 단백질 극성 복합 체외의 reconstitution의는 이전 섹션에서 설명한대로 LIMACS 과정을 수행합니다. 간단한, phosphatidylserine (420 μg)과 C16 - ceramide (107 μg)에서 유기 용매의 건조이다. </li><li> 말린 lipids은 소포 버퍼 500 μl (; 150 MM NaCl 50 MM 트리스 / HCL, 산도 7.5)에서 sonication 아래 resuspended 있습니다. </li><li> 10 MM MnCl2, Vybrant CM - diI ​​1 μl, 그리고 PKCζ 500 NG (인간 재조합)의 다섯 μl가 추가되고 반응 혼합물은 4 60 분 undergentle의 교반을 incubated 있습니다 ° C. </li><li> Vybrant CM - diI ​​묻은 phosphatidylserine / ceramide vesicles 4에서 60 분 ° C.에 대한 12,000 XG에서 원심 분리하여 회수 아르 </li><li> 펠렛 (분홍색)을 100 μl 트리스 버퍼에 resuspended 및 γS - GTP (100 μm의), GDP (1 ㎜), GST - Par6 (100 NG) 또는 GST - Cdc42 (500 NG)과 보완 및 추가 3 incubated입니다 4 H ° C (관심 재조합 단백질의 다른 조합이 여기에 사용할 수 있습니다.) </li><li> Annexin V - 버퍼 (20x 재고 솔루션 5 μl)와 Annexin V - 복합 자석 구슬이 (50 μl) 추가하고 반응 혼합물은 4에서 다른 30 ​​분 ° C.에 대한 부드러운 교반하에 incubated 아르 </li><li> Annexin V - 맥스는 이전에 설명한대로 공급 업체의 프로토콜을 다음과 수행됩니다. </li> 용출 분획 (1 ML)는 강수량의 도움으로 순수 ovalbumin 10 μg로 보충합니다. 단백질은 위셀 - 플러그의 석출에 의해 집중하고 이전 8 설명된대로 SDS-PAGE/immunoblotting 의해 분석됩니다. <li> eluted 지질 vesicles의 금액은 위셀 플러그의 침전 반응의 유기적 (클로로포름 / 메탄올) 단계에서 Vybrant CM - diI ​​(분홍색)의 검출에 의해 계량입니다. 분석 단백질의 양은 지질 vesicles 동등한 양의에 정상화됩니다. </li></ol> 3. 검색 결과 LIMACS의 PKCζ - EGFP의 정화와 ceramide 바인딩 도메인 C20ζ - EGFP 전체 길이를 표현 MDCK 세포의 세제 무료 lysate PKCζ C - 말기 녹색 형광 단백질 (FLζ - EGFP) 또는 PKCζ (C20ζ - EGFP)의 C ​​- 말단에서 ceramide 바인딩 도메인에 연결된 것은 같은 phosphatidylserine / ceramide vesicles와 incubated되었습니다 실험 절차에 설명되어 있습니다. 맥에서 열 용출 후, 단백질은 immunoblotting 및 eluted 단백질 2의 검출에 대한 PKCζ와 EGFP에 대한 항체를 사용하여 분석했다. <img src="/files/ftp_upload/2657/2657fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. LIMACS EGFP - 라벨 PKCζ과 C - 말단 조각 C20ζ phosphatidylserine / ceramide vesicles를 사용합니다. 실험 절차 섹션에 설명된대로 EGFP (구속력 제어 등), 전체 길이 PKCζ - EGFP 또는 ceramide 바인딩, C - 말단 조각 C20ζ - EGFP을 표현 MDCK 세포의 세제 무료 lysates은 phosphatidylserine / ceramide의 vesicles와 incubated되었습니다 . LIMACS을 사용한 후, 단백질은 SDS 샘플 버퍼 eluted되었으며 SDS - PAGE로 분석 및 immunoblotting. 왼쪽 패널은 EGFP는 Annexin V - 연결된 자석 구슬로 유지 vesicles에 바인딩 않았 것으로 나타났습니다. 중간과 오른쪽 패널은 전체 길이 PKCζ - EGFP와 C20ζ - EGFP 인해 ceramide에 바인딩 유지했다. 보여줍니다

<ol><li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li>
<li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li>
<li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li>
<li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+C%2816%29-ceramide+between+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li>
<li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+%28and+sociology%29+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Symp%22%5BJournal%5D)">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li>
<li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

지질과 결합 단백질 간의 특정 상호 작용을 테스트하려면 것은 세포막의 lipids의 포함에 의해 방해합니다. 세포막은 여러 lipids과 단백질의 혼합물로 구성되어 있으며, 그것은 지질 microdomains이나 보트로 구성됩니다. 단백질 직접 지질에 바인딩 또는 유일한 microdomain 구조에 풍부한 경우 따라서 microdomains 및 단백질의 공동 정화 명확하게 구별 수 없습니다. 이러한 지질 ELISAs 또는 Plasmon 공명 분광법으로 표면에 코팅 정의 lipids를 사용하는 다른 방법은 바인딩 단백질과 특정 지질의 상호 작용을 감지할 수 .. 그러나, 생리학 관련 멤브레인 환경에서 표면 (예를 들어, Plasmon 공명 분광법을위한) 지질 vesicles 또는 liposomes로 코팅되어야한다를이 상호 작용을 결정합니다. 우리는이 이전 방법의 대안으로 소설 지질 소포 바인딩 분석을 개발했습니다. 참신는 Annexin V - 복합 자석 구슬과 지질 vesicl...

Annexin V - 복합 자성 구슬과 맥을 마이크로와 minicolumns은 Miltenyi Biotec, 주식 회사 (오번, CA)에 의해 제공되었다. 모든 lipids은 최고 순도되었으며 아반티 폴라 Lipids (엘라 베스터, AL)에서 얻은.

자기 활성 셀 정렬 (limacs)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

lipids 대부분의 정화 절차에 접근할 그러므로 세포 점막에 포함된하고 있기 때문에 지질 단백질 상호 작용의 분석 어렵습니다. 대안으로, lipids은 지질 엘리사와 Plasmon 공명 분광법을 위해 사용되는 평면 표면에 코팅하실 수 있습니다. 그러나, 표면 코팅 lipids은 지질 바인딩 속성에 대해 중요한 수있는, microdomain 구조를 형성하지 않습니다. 또한, 이러한 방법들은 목표 lipids에 바인딩 단백질의 대용량의 정화를 위해 허용하지 않습니다. 지질 단백질 상호 작용을 테스트 이러한 한계를 극복하고 지질 바인딩 단백질을 정화하기 위해 우리는 자기가 활성화된 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 친화 크로마 토그래피를 칭했다 소설 방법을 개발했습니다. 이 방법에서는 지질 vesicles는 Annexin V Mac 용 앵커 지질로 대상 지질 및 phosphatidylserine와 준비가되어 있습니다. Phosphatidylserine는 단백질 Annexin V. phosphatidylserine 함유 지질 vesicles는 자성 비즈에 바인딩됩니다 Annexin V에 복합 자기 구슬을 사용하여 높은 친화력을 보여주는 유비 쿼터스 세포막의 인지질이다. 지질 vesicles이 lysate 세포와 incubated 경우 대상 지질에 바인딩 단백질도 비즈에 바인딩되며, 맥을 사용하는 공동 정화 수 있습니다. 이 방법은 테스트하는 데 사용할 수있는 재조합 단백질은 reconstitute 대상 지질에 바인딩 단백질 컴플렉스를하는 경우. 우리는 sphingolipid ceramide와 공동 정화 전립선 apoptosis 반응 4 (파 4), ceramide - 관련 aPKC에 바인딩 단백질 비정형 PKC (aPKC)의 상호 작용을 표시하기 위해이 방법을 사용했습니다. 우리는 또한 세포 극성과 관련된 단백질 Par6 및 Cdc42와 재조합 aPKC의 ceramide - 연결된 복합 reconstitution이 방법을 사용했습니다. 지질 vesicles가 sphingo 또는 phospholipids의 다양한 준비할 수 있기 때문에 LIMACS은 세포막의 밀접하게 유사한 지질 환경에서 지질 - 단백질 상호 작용에 대한 다양한 테스트를 제공합니다. 추가 지질 단백질 단지는 지질 바인딩 단백질 지질 vesicles 공동 정화의​​ proteomics 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다.

우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

지질-단백질 상호작용 분석은 지질이 세포막에 내장되어 있어 대부분의 정제 과정으로 접근하기 어렵기 때문에 까다롭습니다.

본 실험은 지질 결합 단백질을 식별하고, 지질 소포의 정의된 막 환경에서 지질-단백질 상호작용을 분석하기 위해 설계되었습니다. 세포 균질액의 지질 결합 단백질을 갓 조제한 포스파티딜세린 및 세라마이드 지질 소포와 함께 배양합니다. 이후 반응 혼합물에 Xin V 접합 자성 비드를 첨가하여 지질 소포와 결합된 단백질을 자성 비드에 고정시킵니다. 다음으로, 자기 활성 세포 분리법(magnetic activated cell sorting)을 통해 단백질-지질 소포를 정제합니다.지질 결합 단백질의 입증된 결과를 확인하려면, SDS page Western blotting을 사용하여 MDCK 세포에서 발현된 내인성 및 재조합 비정형 PKC와 특정 세라마이드 결합 도메인의 lyx 정제를 보여주십시오. ELISA 또는 표면 결합과 같은 표면 플라스몬 공명 분광법과 같은 기존 방법과 비교하여 이 새로운 기술의 주요 장점은 지질-단백질 상호작용이 막과 유사한 환경에서 이루어지며, 결합 단백질을 정제하고 분석할 수 있다는 점입니다. 이러한 질환에서는 생리적인 지질-단백질 상호작용이 손상되기 때문에, 이 기술의 활용 가능성은 지질 관련 질환의 치료 및 진단으로 확장됩니다.이러한 질병 중 일부는 단백질 표적이 알려지지 않아 확인이 필요합니다. 지질 기반 치료제를 설계하려면, 먼저 100 µL의 sical 완충액 내에 등몰량의 phosphatidyl serine과 C 16 ceramide 혼합물을 건조시켜 준비한 지질 SLE로부터 시작하십시오. 0.1 mM manganese chloride가 첨가된 300 µL의 sical 완충액을 넣은 후 1시간 동안 초음파 처리하십시오. 시료를 4 °C에서 12,000 ×g로 20분 동안 원심 분리한 다음, 거대 지질 소포 펠릿을 100 µL의 sical 완충액에 재현탁하십시오. 1 nM의 vibrant cm DII 형광 염료를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 max 분리 후 SLE 분획의 시각화를 용이하게 하십시오. 원심 분리를 통해 vibrant cm dai로 염색된 phosphate, syrian ceramide SLE의 분홍색 펠릿을 회수하여 100 µL의 tris 완충액에 재현탁하십시오.다음으로, 계면활성제가 없는 세포 용해물을 준비하기 위해 10 mM tris, hydrogen chloride, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제가 포함된 300 µL의 고장성 완충액에서 세포를

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