자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

본 실험은 지질 결합 단백질을 식별하고, 지질 단백질 상호작용을 특정 막 환경에서 분석하기 위해 설계되었습니다. 세포 균질액의 지질 섬 단백질을 인지질 세린과 세라마이드로 갓 제조한 지질 소포와 함께 배양합니다. 이후 반응 혼합물에 Xin V 접합 자성 비드를 첨가하여 지질 소포와 결합된 단백질을 자성 비드에 고정합니다. 다음으로, 자성 활성화 세포 분류법(magnetic activated cell sorting)을 통해 단백질-지질 소포를 정제합니다.

지질 결합 단백질의 입증된 결과를 확인하기 위해, SDS page Western blotting을 사용하여 MDCK 세포에서 발현된 내인성 및 재조합 비정형 PKC와 특정 세라마이드 결합 도메인의 lyx 정제를 보여줍니다. Eliza나 표면 결합과 같은 표면 플라즈몬 공명 분광법 등 기존 방법과 비교했을 때 이 새로운 기술의 주요 장점은 지질-단백질 상호작용이 막과 유사한 환경에서 이루어지며, 결합 단백질을 정제하고 분석할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 응용 가능성은 지질과 관련된 질환의 치료 및 진단으로 확장되는데, 이는 이러한 질환에서 생리적인 지질-단백질 상호작용이 손상되기 때문입니다.

이러한 질환 중 일부는 단백질 표적이 알려지지 않아 이를 식별해야 합니다. 지질 기반 치료제를 설계하려면, 먼저 100 µL의 sical 버퍼에 등몰량의 phosphatidyl serine과 C 16 ceramide 건조 혼합물로 준비한 lipid sles에서 시작하십시오. 0.1 mM manganese chloride가 첨가된 300 µL의 iCal 버퍼를 넣고 1시간 동안 초음파 처리하십시오. 시료를 4 °C에서 12,000 ×g로 20분 동안 원심 분리한 후, 대형 지질 소포 펠릿을 100 µL의 sical 버퍼에 재부유시킵니다. 1 nM의 vibrant cm DII 형광 염료를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 mag 분리 후 SLE 분획의 시각화를 용이하게 합니다. 원심 분리를 통해 vibrant cm dai로 염색된 phosphate, a Syrian ceramide sles의 분홍색 펠릿을 회수하고 100 µL의 tris 버퍼에 재부유시킵니다.

다음으로, 계면활성제가 없는 세포 용해물을 준비하기 위해 10 millimolar tris, hydrogen chloride 및 프로테아제와 포스파타아제 억제제가 포함된 300 microliters의 고장성 완충액에서 세포를 초음파 처리한 후 원심분리합니다. 막 잔해를 제거하기 위해, 이제 맑은 세포 용해물을 지질 물리적 현탁액에 첨가하고 혼합물을 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 세포 용해물에는 포스파테린을 포함하는 내인성 막이 포함되어 있을 수 있으므로, 추가적인 원심분리 단계를 통해 용해물에서 이러한 막을 제거하는 것이 권장됩니다.

반응 혼합물에 XNV 결합 버퍼 20 µL와 XNV가 접합된 자성 비드 용액 50 µL를 첨가하여 4 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 자성 활성화 세포 분리(MACS)를 수행합니다. 다음으로, 항체 경쟁 분석에서 지질의 존재 여부와 양을 결정하기 위해 마이크로플레이트 형광 리더를 사용하여 통과액 및 용출 분획의 vibrant CM DII 형광을 모니터링합니다. A PKC의 세라마이드 포스포세린 소포 결합 반응의 특이성을 검증하기 위해, 1 µg의 anti P KC Zeta 토끼 다클론 항체를 세포 용해물과 함께 4 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 지질 소포와 함께 배양합니다.

in vitro 지질 단백질 극성 복합체 재구성을 위한 최대 용출액 내 세라마이드 인산세린 결합 단백질의 SDS page 및 면역 블로팅 분석을 계속합니다. 앞서 보여준 것과 같이 vibrant cm DII로 염색된 인산세린 세라마이드 소포의 분홍색 펠렛 준비 단계부터 시작하여, 100 µM gamma S GT P, 1 mM GDP 및 목적 재조합 단백질 혼합물이 첨가된 100 µL tri 버퍼에 소포를 재현탁합니다. 그다지 반응물을 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 다음으로, 20 x stock solution X in V 버퍼 5 µL와 X in V 접합 자성 비드 50 µL를 추가합니다.

혼합물을 4°C에서 약하게 교반하며 30분 동안 더 배양합니다. 침전을 촉진하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 NX NV 자기 활성 세포 분리를 계속 수행합니다. 용출 분획에 10 µg의 순수 e albumin을 보충합니다.

Weyl flue 침전을 통해 단백질을 농축합니다. 하층은 vibrant cm dii가 농축된 클로로포름 메탄올로 구성됩니다. 갈색의 중간층에는 마그네틱 비즈와 침전된 단백질이 포함되어 있습니다.

Weyl-flu 반응의 유기 클로로포름-메탄올 상에서 분홍색으로 강하게 발색되는 cm dii를 검출하여 ellu 지질 소포를 정량하십시오. 샘플 간 단백질 양을 표준화하기 위해 동일한 양의 지질 소포를 사용하고, SDS page 및 면역 블로팅으로 분석하십시오.

녹색 형광 단백질 또는 세라마이드 결합 도메인이 C-말단에 연결된 전체 길이의 PKC Zetta를 발현하는 MDCK 세포의 계면활성제 제거 용해물입니다. PKC Zetta의 C-말단은 인산화 세린과 함께 배양되었습니다.

Max 컬럼 용출 후 세라마이드 소포 내의 단백질을 면역 블로팅으로 분석하였습니다. 세라마이드 결합 단편 C 20 Zeta, EGFP 및 전체 길이의 P KC Zeta가 Max 컬럼의 용출액(EIT)에서 회수되었으며, 이는 lyx 과정의 특이성과 효율성과 일치합니다. 인산화된 시리아 세라마이드 소포에 결합하지 않는 음성 대조군인 EGFP는 용출액(eit)에서 검출되지 않았습니다.

Linx를 SDS page, western blotting 또는 proteomics 분석과 같은 다른 방법과 병행하여 사용할 경우, 지질 결합 단백질 복합체에 어떤 단백질이 포함되어 있는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 개발 이후, LabX는 단일 지질 연구 분야의 연구자들이 신경 줄기 세포 및 상피 세포에서 세라마이드로 유도된 apoptosis와 세포 극성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.