자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

이 실험은 지질 결합 단백질을 확인하고 지질 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 고안되었으며, 세포 균질의 지질 SLES 단백질은 인산염, 세인 및 세라마이드에서 새로 준비된 지질 소포와 함께 배양됩니다. 그런 다음 반응 혼합물에 Xin V 복합 자성 비드를 보충하여 지질 소포와 관련된 단백질을 자성 비드에 고정합니다. 다음으로, 단백질 지질 소포는 자기 활성화 세포 분류에 의해 정제됩니다.

지질 결합 단백질이 입증된 결과를 확인하려면 SDS 페이지 웨스턴 블로팅을 사용하여 내인성 및 재조합 비정형 PKC의 lyx 정제 및 MDCK 세포에서 발현된 특정 세라마이드 결합 도메인을 표시합니다. Eliza 또는 표면 결합과 같은 플라즈마 공명 분광법과 같은 기존 방법에 비해 이 새로운 기술의 주요 장점은 막과 같은 환경에서 지질 단백질 상호 작용이 이루어지고 결합 단백질을 정제 및 분석할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 지질과 관련된 질병의 치료 및 진단으로 확장되는데, 이러한 질병에서는 생리학적 지질 단백질 상호 작용이 손상되기 때문입니다.

이러한 질병 중 일부의 경우, 단백질 표적이 알려져 있지 않으므로 식별이 필요합니다.지질 기반 치료법을 설계하려면 100마이크로리터의 sical buffer에 있는 equimolar, phosphatidyl seine 및 C 16 ceramide의 건조된 혼합물로 준비된 지질 슬레로 시작합니다. 300 마이크로 리터의 iCal 완충액을 첨가 한 후 1 시간 동안 초음파 처리하고, 0.1 밀리 몰 망간 클로라이드 원심 분리기를 보충하여 섭씨 4도에서 20 분 동안 000 G에서 샘플을 재현 한 다음 100 마이크로 리터의 sical 완충액에 큰 지질 소포 펠렛을 재현탁합니다. 생생한 cm DII 형광 염료 1나노몰을 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 최대 분리 후 SLE 분획의 시각화를 용이하게 하고, 100마이크로리터의 트리스 버퍼에서 생생한 cm 다이 염색 인산염, 시리아 세라마이드 슬레스의 분홍색 펠릿을 회수하고 Resus 지출을 합니다.

다음으로, 10 밀리몰 트리스의 고긴장 완충액 300 마이크로 리터에서 세포를 초음파 처리 하는 세제가없는 세포 용해물, 프로테아제 및 인산 가산 분해 효소 억제제 및 원심 분리기를 제조하기 위해. 막질 파편을 제거하려면 이제 지질 물리적 현탁액에 투명 세포 용해물을 추가하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 혼합물을 배양합니다. 세포 용해물은 인산 에어린이 있는 내인성 막을 포함할 수 있으므로 추가 원심분리 단계를 통해 이러한 막에서 용해물을 제거하는 것이 좋습니다.

반응 혼합물에 20마이크로리터의 XNV 결합 완충액과 50마이크로리터의 자성 비드가 포함된 용액을 보충하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 XNV 배양액에 접합하고 제조업체의 프로토콜에서 권장하는 대로 자기 활성화 세포 분류를 수행합니다. 다음으로, 항체 경쟁 분석에서 지질의 존재 및 양을 결정하기 위해 마이크로플레이트 형광 리더를 사용하여 플로우 스루 및 용리 분획에서 생생한 CM DII 형광을 모니터링합니다. 세라마이드 포스포 센 소포에 대한 A PKC의 결합 반응의 특이성을 확인하기 위해 섭씨 4도에서 1시간 동안 세포 용해물로 항 P KC Zeta 토끼 다클론 항체 1마이크로그램을 배양한 후 지질 소포로 배양합니다.

지질 단백질 극성 복합체의 시험관 내 재구성을 위한 최대 용출액에서 세라마이드 포스페이트 세린 슬레에 결합하는 단백질의 SDS 페이지 및 면역 블로팅 분석을 계속하고, 앞서 보여진 바와 같이 생생한 cm DII 염색 인산염 세리안 세라마이드 소포의 분홍색 펠릿 준비로 시작하고, reus는 100마이크로리터의 트라이 버퍼에서 소포를 현탁시키고, 100마이크로몰, 감마선, S, GT, P, 1밀리몰, GDP 및 관심 재조합 단백질의 조합이 보충됩니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 3시간 동안 반응을 배양합니다. 다음으로, 5마이크로리터의 X in V 완충액의 20 x 스톡 용액과 50 마이크로리터의 X in V 복합 자성 비드를 추가합니다.

섭씨 4도에서 30분 더 부드럽게 저어주면서 혼합물을 배양합니다. 침전을 용이하게 하기 위해 제조업체의 프로토콜에서 권장하는 대로 NX NV 자기 활성화 세포 분류를 계속 수행합니다. 10 마이크로그램의 순수 e 알부민으로 용출 분획을 보충합니다.

weyl 굴뚝 침전에 의하여 단백질을 집중시키십시오. 하단 단계는 생생한 cm dii가 풍부한 클로로포름 메탄올로 구성됩니다. 갈색을 띤 계면에는 자성 비드와 침전된 단백질이 포함되어 있습니다.

웨일 플루 반응의 유기 클로로포름 메탄올 단계에서 분홍색의 생생한 cm dii를 검출하여 ellu 지질 소포를 정량화합니다. 동일한 양의 지질 소포를 사용하여 시료 간 단백질의 양을 정규화하고 SDS 페이지별로 분석합니다. 면역 블로팅.

녹색 형광 단백질 또는 세라마이드 결합 도메인에 말단으로 연결된 전장 PKC Zetta C를 발현하는 MDCK 세포의 무세제 용해물. pkc의 C 말단에서. Zetta는 phospho seine으로 배양되었습니다.

최대 column의 elucian 후 세라마이드 소포, 단백질은 immuno blotting에 의해 분석되었습니다. 세라마이드 결합 단편 C20 Zeta, EGFP 및 전장 P KC Zeta는 lyx 절차의 특이성 및 효능과 일치하는 최대 컬럼의 EIT에서 회수되었습니다. 인산염에 결합하지 않은 음성 대조군 EGFP인 시리아 세라마이드 소포는 EIT에서 검출되지 않았습니다.

Linx가 SDS 페이지 및 웨스턴 블로팅 또는 단백질체학 분석과 같은 다른 방법으로 보완되면 어떤 단백질이 지질 결합 단백질 복합체에 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 LabX는 S 단일 지질 연구 분야의 연구자들이 신경 줄기 및 상피 세포에서 세라마이드 유도 세포사멸 및 세포 극성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.