환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

본 절차의 전반적인 목표는 토양 또는 퇴비 시료 추출액 내의 효소 가수분해 유기 인을 분류하는 것입니다. 이는 먼저 수산화나트륨 EDTA 용액으로 시료를 추출하고 추출액의 pH를 조정한 후, 이렇게 조정된 추출액을 두 가지 서로 다른 효소 용액과 함께 배양함으로써 수행됩니다.

96-웰 플레이트에서 마지막 단계는 몰리브덴 블루比색법을 사용하여 효소에 의해 방출된 정인산염을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 효소 가수분해법에 의한 정인산염의 차등적 방출을 기반으로 토양 또는 퇴비 시료 내 대부분의 천연 정인산염 모노에스테르 인 및 디에스테르 인 형태를 분류할 수 있습니다. 이 방법은 모든 표준 실험실에서 저렴한 비용으로 수행할 수 있습니다.

인 31 핵자기공명 분광법(phosphorus 31 nuclear magnetic resonance spectroscopy)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주된 장점은, 향후 천연 토양 효소가 유기 완두콩 화합물로부터 정인산염(orthophosphate)을 방출할 수 있는 잠재력을 측정할 수 있다는 점입니다. 따라서 이 방법을 통해 얻은 데이터는 토양 비옥도나 토양이 조류가 이용 가능한 유해한 양의 정인산염을 방출할 잠재력을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. 50 mL 원심분리관에 2 g의 습식 또는 건조 시료를 넣고 0.25 M 수산화나트륨 용액 30 mL를 추가하십시오.

실온에서 16시간 동안 교반하며 배양합니다. 샘플을 3000 ×g에서 30분 동안 원심분리한 후, 아세테이트 완충액이 미리 들어 있는 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 100 µL를 옮깁니다. 조정된 샘플의 총 부피는 1 mL이며 pH는 5.0입니다.

신선하게 제조한 0.1 M sodium acetate (pH 5) 10 mL에 acid phosphatase가 0.5 units/mL 함유된 스톡 용액 두 개를 준비합니다. 이제 acid phosphatase 스톡 용액이 담긴 10 mL 튜브 중 하나에 Penicillium Citron 유래의 재구성된 동결건조 nuclease NP1을 최종 농도가 2.5 units/mL가 되도록 첨가하고, 튜브를 여러 번 뒤집어 가며 부드럽게 혼합합니다. 두 효소 용액을 3000 ×g에서 30분 동안 원심분리합니다. 검정 곡선을 작성하기 위해, 먼저 1.5 mL 원심분리 튜브에 1 mM potassium phosphate 스톡 용액 1 mL를 넣고 0.5 mL씩 7회 연속 희석을 수행합니다. 이때 첫 번째 튜브는 폐기하여 최종 희석 범위가 20 µM에서 0.625 nM phosphorus가 되도록 합니다.

이제 ORTHOPHOSPHATE 표준 용액을 플레이트의 마지막 두 열로 옮깁니다. A행의 0 NM orthophosphate부터 시작하여 10번 열의 처음 세 웰에 20 nm orthophosphate가 들어가도록 H행까지 순서대로 분주합니다. 10번 열의 다음 세 웰에는 40 µL의 PP 및 GP 효소 용액을 첨가합니다. 이어서 40 µL의 PP, GP 및 NP 단일 효소 용액을 첨가합니다.

마지막으로, 6개의 모든 웰에 100 millimolar 아세테이트 완충액 40 µL를 추가합니다. 이제 10번 열의 처음 6개 웰에는 각각 80 µL의 용액이 들어 있어야 하며, 이는 다음 두 웰로 이어집니다. 10 M glucose와 six phosphate를 함유한 소듐 아세테이트 용액 40 µL와 PP 및 GP 효소 용액 40 µL를 추가합니다.

테스트할 각 시료에 대해, 모든 시료의 분배가 완료된 후 pH가 조정된 시료 추출물 40 µL를 최대 8개 행의 1번부터 9번 웰에 분배합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 1~3번 열에는 PP 및 GP 효소 용액을, 4~6번 열에는 PP, GP 및 NP 1을, 7~9번 열에는 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액을 분배합니다. 모든 시료가 동일한 배양 시간을 가질 수 있도록 이 단계를 신속하게 수행하십시오.

96-웰 플레이트를 덮개로 덮고 시료, 효소 용액, 대조군 및 검량선 시료를 탈이온수가 담긴 37 °C 환경에서 정확히 1시간 동안 배양합니다. 4가지 표준 용액을 각각 50 mL씩 준비합니다. 용액 A는 멀티채널 피펫을 사용하여 매일 신속하게 준비해야 합니다.

96웰 플레이트의 모든 웰에 SDS 25 µL, 용액 A 100 µL, 용액 B 20 µL, 그리고 용액 C 50 µL를 추가합니다. 플레이트를 덮고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 스프레드시트 프로그램을 사용하여 임의의 튜닝 가능한 마이크로플레이트 리더기로 850 nm에서 흡광도를 측정합니다.

먼저, x축에 0에서 20 nanomoles phosphorus를, y축에 두 번 반복 측정한 흡광도의 평균값을 설정하여 무기 인산 표준 곡선을 작성하고, 선형 회귀 분석을 수행하여 최적 적합선의 방정식을 구합니다. 다음으로, 1열부터 3열까지의 값들을 평균한 후, 이 데이터 세트에 표준 곡선을 적용하여 배경 무기 인산 농도를 계산합니다. 이어서 가수분해된 인산 모노에스테르 유래 인 함량을 결정하기 위해, 4열부터 6열까지의 3반복 시료 값들을 평균하고, 여기서 대조군 효소 용액 값과 배경 무기 인산 농도를 뺍니다.

그 다음, 가수분해된 인으로부터 인 함량을 계산하기 위해, DER은 7열에서 9열까지의 3반복 시료 값의 평균을 구한 뒤, 4열에서 6열까지의 대조군 효소 용액 값, 배경 무기 인 값, 그리고 가수분해된 모노에스테르 인 값을 뺍니다. 전형적인 96-well 플레이트에는 8개 시료의 결과와 검정 곡선이 표시됩니다. 대조군은 10열에 있습니다.

1번에서 3번 컬럼, 그리고 4번에서 6번 컬럼 사이의 색 강도 증가는 가수분해된 모노에스테르 인 화합물 때문이며, 4번에서 6번 컬럼과 7번에서 9번 컬럼 사이의 증가는 가수분해된 디에스테르 인 화합물 때문입니다. 본 연구에서는 고처리량 효소 가수분해 방법을 사용하여 버몬트 토양 샘플의 0.25 molar 수산화나트륨 및 0.05 molar EDTA 추출액 내 인 클래스의 분포를 성공적으로 분석하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 효소 가수분해를 이용하여 토양 또는 퇴비 추출액 내의 천연 오르토인산염, 모노에스테르 및 디에스테르 인 화합물을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 환경 화학 및 영양분 관리 분야의 연구자들이 토양 또는 가축 분뇨 시스템에서의 유기 P 거동을 탐구하는 길을 열어주는 데 도움이 될 수 있습니다.