환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

이 절차의 전반적인 목표는 토양 또는 분뇨 샘플의 추출물에서 효소 가수분해 유기 인을 분류하는 것입니다. 이는 먼저 수산화나트륨 EDTA 용액으로 샘플을 추출하고 추출물의 pH를 조정함으로써 수행됩니다. 그런 다음 이러한 조정된 추출물을 두 가지 다른 효소 용액으로 배양합니다.

96웰 플레이트에서 마지막 단계는 몰리브덴 블루 비색법을 사용하여 효소 방출 오르토인산염을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 대부분의 천연 오르토인산염 모노 에스테르 인 및 디아스터 인 형태는 효소 가수분해 방법에 의한 오르토인산염의 차등 방출을 기반으로 토양 또는 분뇨 샘플로 분류할 수 있습니다. 이 방법은 모든 표준 실험실에서 저렴하게 수행할 수 있습니다.

인 31 핵 자기 공명 분광법(nucle magnetic resonance spectroscopy)과 같은 기존 방법에 비해 가장 큰 장점은 천연 토양 효소가 미래에 유기 완두콩 화합물에서 오르토인산염을 방출할 가능성을 측정할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법으로 얻은 데이터는 토양 비옥도 또는 토양이 유해한 양의 조류 사용 가능한 오르토인산염을 방출할 가능성을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. 0.25몰 수산화나트륨 용액 30ml를 50ml 원추형 튜브에 있는 2g의 습식 또는 건조된 샘플에 추가합니다.

실온에서 16시간 동안 교반하며 배양합니다. 샘플을 30분 동안 G 3000회 원심분리한 다음 이미 아세테이트 버퍼가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 100마이크로리터를 옮깁니다. 조정된 샘플의 총 부피는 1ml이고 pH는 5.0입니다.

pH 5의 갓 준비된 0.1몰 아세트산나트륨 10밀리리터에 산 인산가수분해효소 1밀리리터당 0.5단위를 포함하는 두 개의 원액을 준비합니다. 이제 페니실리움 유자(Penicillium Citron)에서 추출한 재구성된 동결건조된 뉴클레아제 NP를 10밀리리터 튜브의 10밀리리터 튜브 중 하나에 첨가하여 최종 농도 2.5 단위 NP를 1밀리리터당 1회 부드럽게 여러 번 반전시켜 혼합하고 30분 동안 3000배 G에서 두 효소 용액을 원심분리합니다. 보정 곡선을 구성하려면 먼저 1.5ml 원심분리 튜브에 1ml의 1밀리리터 인산칼륨 원액을 추가하고 7개의 0.5ml 시리얼 희석을 수행하여 첫 번째 튜브를 버리고 최종 희석 범위가 20al에서 0.625nm 인이되도록 합니다.

이제 ORTHOPHOSPHATE 표준물질을 A행의 0 NM 오르토인산염으로 시작하여 H행의 20nm 오르토인산염으로 끝나는 플레이트의 마지막 두 열로 10열의 처음 3개 웰로 전송합니다. 40마이크로리터 PP와 GP 효소 용액을 컬럼 10의 다음 3개 웰에 추가합니다. 40마이크로리터 PP와 GP 및 NP 1개의 효소 용액을 추가합니다.

마지막으로, 40마이크로리터의 100밀리몰 아세테이트 완충액을 6개의 웰 모두에 추가합니다. 이제 열 10의 처음 6개 웰 각각에는 다음 두 웰에 80마이크로리터의 용액이 포함되어야 합니다. 10M 포도당, 6개의 인산염 및 40마이크로리터 PP를 함유한 40마이크로리터의 아세트산나트륨 용액과 GP 효소 용액을 추가합니다.

테스트 중인 각 샘플에 대해 모든 샘플을 분배한 후 40마이크로리터의 pH 조정 샘플 추출물을 최대 8개 행의 웰 1에서 9개까지 분배합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 PP와 GP 효소 용액을 1-3열에, PP와 GP와 NP 1을 4-6열에 분배하고, 0.1몰 아세트산나트륨 완충액을 7-9열에 분배합니다. 이 단계를 신속하게 수행하여 모든 샘플이 동일한 배양 시간을 갖도록 합니다.

96웰 플레이트를 뚜껑으로 덮고 시료, 효소 용액, 대조군 및 검량선을 탈이온수에서 섭씨 37도에서 정확히 1시간 동안 배양합니다. 4개의 스톡 솔루션 용액 각각을 50ml씩 준비합니다. A는 멀티 채널 피펫을 사용하여 매일 신속하게 준비해야 합니다.

25마이크로리터의 SDS, 100마이크로리터의 용액, 20마이크로리터의 용액 B, 50마이크로리터의 용액 C를 96의 모든 웰에 추가합니다. 웰 플레이트는 플레이트를 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 스프레드시트 애플리케이션을 사용하여 T 조정 가능한 마이크로플레이트 리더에서 850나노미터의 흡광도를 측정합니다.

먼저, x축에 0에서 20나노몰의 인으로 무기 인 보정 곡선을 플로팅하고 Y축에 중복 흡광도 측정 평균을 표시하고, 선형 회귀를 수행하고, 최적선의 방정식을 찾습니다. 다음으로, 1열에서 3열까지의 값을 평균화한 다음 보정 곡선을 데이터 세트에 적용하여 배경 무기 인을 계산합니다. 다음으로, 가수분해된 인 모노 에스테르에서 파생된 인을 측정하려면 4열에서 6열까지 3배의 샘플 값을 평균화하고 대조 효소 용액과 배경 무기 인을 뺍니다.

그런 다음 가수분해된 인의 인 함량을 계산하기 위해 DER은 7열에서 9열까지 3배 샘플 값의 평균을 구하고 4열에서 6열까지 대조군 효소 용액과 배경 무기 인, 가수분해된 모노 에스테르 인을 뺍니다. 일반적인 96웰 플레이트는 8개의 샘플과 검량선에 대한 결과를 보여줍니다. 컨트롤은 열 10에 있습니다.

1-3열과 4-6열 사이의 색상 강도 증가는 가수분해된 모노 에스테르 화합물 때문이며, 4-6열과 7-9열 사이의 인 화합물은 가수분해된 디아 eter 인 화합물 때문입니다. 여기서 고처리량 효소 가수분해 방법을 사용하여 버몬트 토양 샘플의 0.25몰 수산화나트륨 0.05몰 EDTA 추출물에서 인 등급의 분포를 성공적으로 분석했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 효소 가수분해를 사용하여 토양 또는 분뇨 추출물에서 천연 오르토인산염, 모노 에스테르 및 디아스터 완두콩 화합물을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 환경 화학 및 영양 관리 분야의 연구자들이 토양 또는 분뇨 시스템에서 유기 P 거동을 탐구할 수 있는 길을 닦는 데 도움이 될 수 있습니다.