Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

다음 실험의 전반적인 목적은 게놈 DNA의 특정 유전자 좌위 내에서 5-메틸사이토신과 5-하이드록시에틸사이토신을 분석하고 정량화하는 것입니다. 이는 5-하이드록시에틸사이토신의 하이드록실기를 게이팅하여, 절단 가능한 MSP1 사이트를 절단 불가능한 사이트로 변환함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 게놈 DNA를 제한 효소인 MSP1과 HPA2로 소화시키며, 이들 효소의 서로 다른 메틸화 민감도를 이용하여 글루코스 관련 5-하이드록시에틸사이토신 사이트를 식별합니다.

다음으로, 해당 유전자좌를 조사하기 위해 PCR을 수행합니다. 분석 결과, 특정 유전자좌에서 5-hydroxyethyl cytosine이 존재함이 확인되었습니다. QPCR을 사용하여 5-methyl cytosine과 5-hydroxyethyl cytosine의 양을 정량할 수 있습니다.

이 기술이 비설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing)과 같은 다른 방법보다 갖는 주요 장점은 5-메틸사이토신(5-methylcytosine)과 5-하이드록시에틸사이토신(5-hydroxyethylcytosine)을 구분할 수 있다는 점입니다. 오늘 실험을 수행할 사람은 New England Biolabs에서 이 키트의 주요 개발자로 참여한 Romas Vice Villa Romas입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, 서면 절차에 설명된 대로 B Sea 뇌 조직에서 게놈 DNA를 정제하십시오. 1.5 mL 반응 튜브에 게놈 DNA, UDP-glucose, NEB 버퍼 4, 그리고 총 부피가 310 µL가 되도록 충분한 nuclease-free water를 혼합하십시오.

이 반응 혼합물을 각각 155 µL씩 두 개의 튜브에 나누어 담습니다. 그런 다음 한 개의 튜브에 30 units 또는 3 µL의 T4 beta glucosyltransferase를 첨가합니다. 피펫팅을 통해 조심스럽게 섞어줍니다.

두 번째 튜브는 대조군 반응이므로 T4 BGT를 추가하지 말고, 대신 3 µL의 물을 반드시 추가하십시오. 두 튜브를 37 °C에서 12~18시간 동안 배양하며, 이 과정 동안 BGT가 시료 내 5-hydroxyethylcytosine 그룹의 하이드록실기에 글루코스를 추가합니다. 제한 효소 소화를 시작하려면, 반응 혼합물 50 µL를 1번부터 3번까지 표시된 세 개의 0.2 mL PCR 스트립 튜브에 각각 분주하십시오.

그 다음, 4번부터 6번까지 표시된 세 개의 PCR 스트립 튜브에 대조군 혼합액을 50 µL씩 분주합니다. msp 100 units를 1번과 4번 튜브에 각각 첨가합니다. 이어서, HPA 2 50 units를 2번과 5번 튜브에 첨가하고 피펫으로 부드럽게 섞어줍니다.

3번과 6번 튜브는 대조군이므로 아무것도 첨가하지 마십시오. 6개의 튜브 모두를 37 °C에서 최소 4시간 동안 배양하십시오. 그다음 각 튜브에 1 µL의 proteinase K를 넣고 40 °C에서 30분 동안 배양하십시오.

마지막으로 95°C에서 10분 동안 배양하여 proteinase K를 불활성화합니다. 이 절차는 endpoint PCR용 NEB LongAmp Taq을 사용하여 시연되었습니다. 하지만 다른 PCR 시약과 절차를 사용하여 얼음 위에 놓인 0.2 mL PCR 반응 튜브에서 대체 수행할 수 있습니다.

5 x long amp TAC 반응 버퍼, dNTPs, 정방향 및 역방향 프라이머, 이전에 얻은 템플릿 DNA, long AMP TDNA 폴리머라제와 최종 부피 50 µL가 되도록 충분한 nuclease-free water를 첨가합니다. 반응물을 부드럽게 혼합하고, 필요한 경우 짧게 원심 분리하여 모든 액체를 튜브 바닥으로 모읍니다. PCR 튜브를 얼음에서 94 °C로 예열된 블록이 있는 서모사이클러로 옮기고, 일반적인 3단계 PCR 사이클링 프로그램을 시작합니다.

94 °C에서 30초 동안 1회의 초기 변성 단계를 거친 후, 94 °C에서 15초 동안 변성, 55 ~ 65 °C에서 30초 동안 어닐링, 그리고 65 °C에서 20초 또는 kb당 50초 동안 신장하는 과정을 30회 반복해야 합니다. 그 후 65 °C에서 5분 동안 1회의 최종 신장 단계를 수행합니다. 5-methylcytosine과 5-hydroxymethylcytosine의 양을 정량하기 위해 실시간 PCR을 수행할 수도 있습니다.

구체적인 정보는 nb. com에서 제공하는 제품 설명서를 참조하시기 바랍니다. endpoint PCR 및 real-time PCR을 사용하여 Locus 12의 five hydroxyethyl aine 양을 비교하였으며, 뇌, 간, 심장, 비장을 포함한 네 가지 서로 다른 마우스 BSY 조직 샘플을 분석하였습니다.

비교 목적으로 제시된 endpoint PCR 샘플의 박스 표시된 젤 레인에서 5-hydroxyethyl cytosine의 변이가 뚜렷하게 나타납니다. Real-time PCR 데이터는 절단되지 않은 DNA를 기준으로 표준화되었으며, 카피 수를 결정하기 위해 표준 곡선이 사용되었습니다. 샘플의 카피 수를 소화되지 않은 대조군의 카피 수로 나누어 샘플을 표준화하였습니다.

여기에서 노란색 막대를 비교함으로써 5-hydroxyethyl cytosine의 변화를 확인할 수 있습니다. 해당 기술 수행 시 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 모든 효소 반응이 완전히 완료되는 것이 매우 중요합니다. BGT의 경우, 모든 DNA 부위를 분리할 수 있도록 하룻밤 동안 반응을 진행하는 것이 중요합니다. MspI 및 HpaII의 경우, 반응이 완전히 끝날 수 있도록 최소 4시간 동안 반응을 진행하는 것이 중요합니다.

마지막으로, 대조군 반응을 병행하여 수행할 수 있도록 DNA 대조군과 프라이머 대조군을 제공합니다.