Name: Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 학습하세요 EpiMark 키트를 활용한 5-mC와 5-hmC 정량 분석 방법으로, 효소 반응과 제한효소 소화를 통해 DNA 메틸화 패턴을 연구합니다. 이 기술은 전통적인 비설파이트 시퀀싱보다 우수한 구분 능력을 제공합니다.

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Sriharsa Pradhan, 섀넌 모리 키니, 잠시 만요 경인 친, Jurate Bitinaite, 유 청, 피에르 올리비에 Esteve, Romualdas Vaisvila, 스티븐 E. 야콥센의 연구소, UCLA. 이 작품은 부분적으로 NIH 1R44GM095209 - 01에 의해 지원되었다.

1. DNA의 Glucosylation 및 제어 반응 <ol><li> 얼음 1.5 밀리리터 반응 관에서 게놈 DNA의 50-10 마이크로 그램 (30 마이크로 그램 / 밀리리터의 최종 농도의 경우), UDP - 포도당의 12.4 microliters (80 micromolar의 최종 농도에 대한) NEBuffer 4 31 microliters를 섞어 및 최대 310 microliters nuclease - 무료 물 310 microliters로 전체 볼륨을 가지고 있습니다. </li><li> 155 microliters 각각 두 개의 튜브에이 반응 혼합물을 분리. </li><li> 어느 튜브에 T4 - β - glucosyltransferase 30 단위, 또는 3 microliters를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. 두 번째 관 제어 반응이기 때문에 대신 T4 - BGT의, 물 3 microliters를 추가합니다. </li><li> T4 - BGT이 예제에서 5 hydroxymethylcytosine 그룹의 수산기 그룹에 포도당을 추가되는 기간 동안 12 ~ 18 시간 동안 섭씨 37도에서 모두 튜브를 품어. </li></ol> 2. 제한 효소 분해 <ol><li> 레이블 세 0.2 밀리리터 PCR - 스트립 튜브 번호 3 1. 각각에 반응 혼합물의 나누어지는 50 UL. </li><li> 레이블 세 0.2 밀리리터 PCR - 스트립 튜브 번호 4-6. 각각으로 제어 혼합물의 나누어지는 50 UL. </li><li> 튜브 1 사에 MspI의 100 단위 또는 1 microliter를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. </li><li> 튜브 2와 5로 HpaII 50 단위 또는 1 microliter를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. </li><li> 그들이 통제하는 한 튜브 3 6 아무것도 추가하지 마십시오. </li><li> 최소한 4 시간 동안 섭씨 37도에서 모두 6 튜브를 품어. </li><li> 각각의 튜브에 Proteinase K 1 microliter를 추가하고 30 분 섭씨 40도에서 알을 품다. </li><li> 10 분 섭씨 95 도에 잠복기로 Proteinase K를 Inactivate. </li></ol> 3. PCR / qPCR에 의해 DNA를 분석 이 프로토콜은 잘 수행하기 위해 표시되었습니다 엔드 포인트 PCR을위한 코의 LongAmp DNA 형성 촉매를 사용합니다. 기타 PCR 프로토콜을 대체하실 수 있습니다. <ol><li> 배 LongAmp DNA 형성 촉매 반응 버퍼, 10 millimolar dNTPs, 10 micromolar 앞으로 프리머 1 microliter, 10 micromolar 리버스 프라이머 1 microliter, 템플릿 3 microliters 1.5 microliters 10 microliters : 얼음 0.2 밀리리터 PCR 반응 관에 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 이전 단계 LongAmp DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 1 microliter, 그리고 nuclease없는 물을 최대 50 microliters부터 DNA. 이러한 볼륨이 사용되는 PCR 프로토콜에 따라 변경될 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 반응을 섞는다. 필요한 경우, 빠른 스핀에 의해 튜브의 바닥에 모든 액체를 수집합니다. </li><li> 온수 뚜껑없이 thermocycler를 사용하는 경우에는 미네랄 오일 샘플을 중첩. </li><li> 섭씨 94 도까지 preheated 블록과 얼음 thermocycler로 PCR 튜브를 전송하고 자전거 프로그램을 시작합니다. 일상적인 3 단계 PCR의 경우, 15 초 동안 변성 섭씨 94도 30주기, 30 초 동안 풀림 섭씨 55-65도, 및 확장 섭씨 65도 다음에 30 초 동안 섭씨 94 도로 한 초기 변성 단계 있어야 20초 또는 킬로바이트 50 초. 이것은 5 분 섭씨 65 도에 마지막으로 확장하여 다음해야합니다. 실시간 PCR은 또한 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine의 금액을 quantitate을 수행할 수 있습니다. 구체적인 내용을 neb.com에있는 제품 매뉴얼을 참조하십시오. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 다른 마우스 Balb / C 조직 샘플에서 로커스 12 5 hydroxymethylcytosine 금액의 비교. (A), 엔드 포인트 PCR. (B), 실시간 PCR. 네 마우스 조직에서 DNA 분석했다. 비교 목적을 위해 실시간 PCR 데이터를 삭제하지 않은 DNA에 정상화되었다. 표준 곡선은 사본 번호를 결정하는 데 사용되었다. 샘플은 소화되지 않은있는 컨트롤의 복사본 번호 (없음 5)에 의해 시료 없음 1-6의 사본 번호를 나누어 정상화 수 있습니다. 박스 겔 레인 5 HMC 선물의 편차를 보여줍니다.

<ol><li>Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li>
<li>Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).</li>
<li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li>
</ol>

테드와 Romas 모두는이 문서의 저자는 코의 직원되며 Romas 테드이 키트의 개발을 감독 응용 프로그램 및 개발 부서의 이사 있기 때문에 키트의 주요 개발자입니다.

본 실험을 설정할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 것들이 있습니다. 첫째, 게놈 DNA의 glucosylation 끝까지 진행하는 것이 중요합니다. T4 - BGT의 시퀀스 특이성이 알려져 있으며 그것은 기판 시퀀스에 대한 선택의 여지가 없어 보인다되지 않습니다. 따라서, 어떤 경우에, 더 이상 부화 시간이 필요할 수 있습니다. 둘째, MspI 및 HpaII 소화 배경 신호를 방지하기 위해 완료해야합니다. 이러한 제한 효소의 경우, 우리는 4 시간 배양 시간을 권장하지만, 불완전 절단이 관찰되면 더 이상 incubations을 수행할 수 있습니다. 셋째, 입력 DNA 금액은 DNA의 20 ngs는 엔드 포인트 PCR에 사용할 수 있기 때문에, 상황에 따라 조정할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 5 - MC 5 - HMC의 부량에 대한 게놈 DNA와 병렬로 실행할 수 있습니다 공급 제어 DNA의 사용을 권장합니다.

<table><tbody><tr><td>EpiMark&amp;#8482; 5-hmC 및 5-mC 분석 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E3317</td><td></td></tr><tr><td>관심 CCGG 부위를 둘러싼 궤적 특이적 프라이머(Locus specific primers)</td><td></td><td></td><td>실험별 맞춤 제작; 사용자 제공</td></tr><tr><td>LongAmp&amp;#174; &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0323</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학 등급 증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

balb / c 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA의 hydroxymethylation은 DNA의 긴 알려진 수정이지만, 최근 epigenetic 연구의 초점이되었다. 포유 동물 DNA는 효소 predominately CPG dinucleotides의 맥락에서, 5 MC로 사이 토신 (C) 잔류물의 5 번째 탄소 위치에 수정됩니다. 5 MC 개발과 질병에 관련된 것으로 아르 효소의 Tet 가족에 의해 5 HMC에 효소 산화 의무가 있습니다. 현재, 5 - HMC의 생물 학적 역할은 완전히 이해되지 않지만 biomarker로서의 가능성 때문에 많은 관심을 생성합니다. 이것은 마우스 배아 줄기 (ES)와의 연결을 세포에서 5 hydroxymethylcytosine을 식별하는 몇 가지 획기적인 연구로 인해 발생합니다. bisulfite 시퀀싱 방법을 포함한 연구 기술, 쉽게 5 MC 5 - HMC를 구분할 수 없습니다. 몇 가지 프로토콜은 질량 분광법 분석이나 게놈 DNA의 소화 단일 nucleosides의 얇은 층 크로마 토그래피 액체 크로마 토그래피와 결합을 포함한 게놈의 5 hydroxymethylcytosine의 글로벌 양을 측정할 수 존재한다. 도트 얼룩 분석, immunofluorescence, 또는 hydroxymethylated DNA의 침전에 사용될 수 있지만, 이러한 항체가 하나의 기본 resolution.In 추가이없는 대상 5 hydroxymethylcytosine도 존재한다는 항체, 해상도는 immunoprecipitated DNA의 크기와에 대한 의존 microarray 실험이 프로브 디자인에 따라 달라집니다. 그것이 5 hydroxymethylcytosine은 epigenetic 규제의 게놈 또는 역할 존재 정확한 위치를 알 수 있기 때문에, 새로운 기술은 특정 로커스 hydroxymethylation을 식별할 수있는 필요합니다. EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 특정 loci에서 두 수정 구별을위한 솔루션을 제공합니다. EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트 5 methylcytosine 및 특정 DNA를 로커스 내에서 5 - hydroxymethylcytosine의 식별 및 quantitation를위한 간단하고 강력한 방법입니다. 이 효소 접근 방식은 간단한 3 단계 절차에서 isoschizomers MspI과 HpaII의 차동 methylation 감도를 사용합니다. 관심 게놈 DNA는 5 hydroxymethylcytosine에 포도당 moeity를 추가 T4 - BGT와 함께 처리됩니다. 이 반응은 순서대로 독립적인, 따라서 모든 5 HMC이 glucosylated됩니다; 수정되지 않은 또는 5 - MC 포함된 DNA가 영향을받지 않습니다. 이 glucosylation는 다음 제한 endonuclease는 소화옵니다. MspI 및 HpaII 같은 순서 (CCGG)를 인식하지만 다른 methylation 상태에 민감합니다. 사이 토신 차단 절단 중 언제든지 변경 (5 - MC, 5 - HMC 또는 5 GHMC) : HpaII은 완전히 수정되지 않은 사이트를 클리브스. MspI 5 - MC 5 - HMC 아니지만 5 GHMC를 인식하고 클리브스. 프로토콜의 세 번째 부분은 PCR에 의한 로커스의 심문이다. 입력 DNA의 조금은 20 NG를 사용할 수 있습니다. 실험 (glucosylated와 소화) 및 제어 (모의은 glucosylated와 소화) 관심 CCGG 사이트 (100-200 BP)를 측면 primers와 대상의 DNA 증폭이 수행됩니다. CPG 사이트 5 hydroxymethylcytosine 포함되어있는 경우 밴드가 glucosylation과 소화 후에 감지 아니지만 비 glucosylated 제어 반응 인치입니다 실시간 PCR은 hydroxymethylcytosine이 특정 사이트에 얼마나의 근사치를 제공합니다. 본 실험에서는, 우리는 엔드 포인트 PCR에 의한 마우스 Babl / C 뇌 샘플에서 5 hydroxymethylcytosine 금액을 분석합니다.

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

DNA 하이드록시메틸화는 오래전부터 알려진 DNA 변형으로, 최근 후성유전학 연구의 중심이 되었습니다. 포유류의 DNA는 효소적으로...

다음 실험의 전반적인 목적은 게놈 DNA의 특정 유전자 좌위 내에서 5-메틸사이토신과 5-하이드록시에틸사이토신을 분석하고 정량화하는 것입니다. 이는 5-하이드록시에틸사이토신의 하이드록실기를 게이팅하여, 절단 가능한 MSP1 사이트를 절단 불가능한 사이트로 변환함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 게놈 DNA를 제한 효소인 MSP1과 HPA2로 소화시키며, 이들 효소의 서로 다른 메틸화 민감도를 이용하여 글루코스 관련 5-하이드록시에틸사이토신 사이트를 식별합니다.다음으로, 해당 유전자좌를 조사하기 위해 PCR을 수행합니다. 분석 결과, 특정 유전자좌에서 5-hydroxyethyl cytosine이 존재함이 확인되었습니다. QPCR을 사용하여 5-methyl cytosine과 5-hydroxyethyl cytosine의 양을 정량할 수 있습니다.이 기술이 비설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing)과 같은 다른 방법보다 갖는 주요 장점은 5-메틸사이토신(5-methylcytosine)과 5-하이드록시에틸사이토신(5-hydroxyethylcytosine)을 구분할 수 있다는 점입니다. 오늘 실험을 수행할 사람은 New England Biolabs에서 이 키트의 주요 개발자로 참여한 Romas Vice Villa Romas입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, 서면 절차에 설명된 대로 B Sea 뇌 조직에서 게놈 DNA를 정제하십시오. 1.5 mL 반응 튜브에 게놈 DNA, UDP-glucose, NEB 버퍼 4, 그리고 총 부피가 310 µL가 되도록 충분한 nuclease-free water를 혼합하십시오.이 반응 혼합물을 각각 155 µL씩 두 개의 튜브에 나누어 담습니다. 그런 다음 한 개의 튜브에 30 units 또는 3 µL의 T4 beta glucosyltransferase를 첨가합니다. 피펫팅을 통해 조심스럽게 섞어줍니다.두 번째 튜브는 대조군 반응이므로 T4 BGT를 추가하지 말고, 대신 3 µL의 물을 반드시 추가하십시오. 두 튜브를 37 °C에서 12~18시간 동안 배양하며, 이 과정 동안 BGT가 시료 내 5-hydroxyethylcytosine 그룹의 하이드록실기에 글루코스를 추가합니다. 제한 효소 소화를 시작하려면, 반응 혼합물 50 µL를 1번부터 3번까지 표시된 세 개의 0.2 mL PCR 스트립 튜브에 각각 분주하십시오.그 다음, 4번부터 6번까지 표시된 세 개의 PCR 스트립 튜브에 대조군 혼합액을 50 µL씩 분주합니다. msp 100 units를 1번과 4번 튜브에 각각 첨가합니다. 이어서, HPA 2 50 units를 2번과 5번 튜브에 첨가하고 피펫으로 부드럽게 섞어줍니다.3번과 6번 튜브는 대조군이므로 아무것도 첨가하지 마십시오. 6개의 튜브 모두를 37 °C에서 최소 4시간 동안 배양하십시오. 그다음 각 튜브에 1 µL의 proteinase K를 넣고 40 °C에서 30분 동안 배양하십시오.마지막으로 95°C에서 10분 동안 배양하여 proteinase K를 불활성화합니다. 이 절차는 endpoint PCR용 NEB LongAmp Taq을 사용하여 시연되었습니다. 하지만 다른 PCR 시약과 절차를 사용하여 얼음 위에 놓인 0.2 mL PCR 반응 튜브에서 대체 수행할 수 있습니다.5 x long amp TAC 반응 버퍼, dNTPs, 정방향 및 역방향 프라이머, 이전에 얻은 템플릿 DNA, long AMP TDNA 폴리머라제와 최종 부피 50 µL가 되도록 충분한 nuclease-free water를 첨가합니다. 반응물을 부드럽게 혼합하고, 필요한 경우 짧게 원심 분리하여 모든 액체를 튜브 바닥으로 모읍니다. PCR 튜브를 얼음에서 94 °C로 예열된 블록이 있는 서모사이클러로 옮기고, 일반적인 3단계 PCR 사이클링 프로그램을 시작합니다.94 °C에서 30초 동안 1회의 초기 변성 단계를 거친 후, 94 °C에서 15초 동안 변성, 55 ~ 65 °C에서 30초 동안 어닐링, 그리고 65 °C에서 20초 또는 kb당 50초 동안 신장하는 과정을 30회 반복해야 합니다. 그 후 65 °C에서 5분 동안 1회의 최종 신장 단계를 수행합니다. 5-methylcytosine과 5-hydroxymethylcytosine의 양을 정량하기 위해 실시간 PCR을 수행할 수도 있습니다.구체적인 정보는 nb. com에서 제공하는 제품 설명서를 참조하시기 바랍니다. endpoint PCR 및 real-time PCR을 사용하여 Locus 12의 five hydroxyethyl aine 양을 비교하였으며, 뇌, 간, 심장, 비장을 포함한 네 가지 서로 다른 마우스 BSY 조직 샘플을 분석하였습니다.비교 목적으로 제시된 endpoint PCR 샘플의 박스 표시된 젤 레인에서 5-hydroxyethyl cytosine의 변이가 뚜렷하게 나타납니다. Real-time PCR 데이터는 절단되지 않은 DNA를 기준으로 표준화되었으며, 카피 수를 결정하기 위해 표준 곡선이 사용되었습니다. 샘플의 카피 수를 소화되지 않은 대조군의 카피 수로 나누어 샘플을 표준화하였습니다.여기에서 노란색 막대를 비교함으로써 5-hydroxyethyl cytosine의 변화를 확인할 수 있습니다. 해당 기술 수행 시 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 모든 효소 반응이 완전히 완료되는 것이 매우 중요합니다. BGT의 경우, 모든 DNA 부위를 분리할 수 있도록 하룻밤 동안 반응을 진행하는 것이 중요합니다. MspI 및 HpaII의 경우, 반응이 완전히 끝날 수 있도록 최소 4시간 동안 반응을 진행하는 것이 중요합니다.마지막으로, 대조군 반응을 병행하여 수행할 수 있도록 DNA 대조군과 프라이머 대조군을 제공합니다.

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설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

이 비디오는 나일론 멤브레인에 DNA 샘플을 블롯팅하고 단클론 항체를 사용한 후속 시각화를 통해 체외에서 인간 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 결정하는 도트 블롯 기술을 설명합니다. 이는 배양의 다양한 단계에서 연골세포의 표현형을 결정하는 데 도움이 됩니다.

DNA 메틸화 정도를 결정하기 위한 5-메틸시토신 점 블롯

이 프로토콜은 포르말린이 고정된 파라핀 내장 생검 조직에서 거대세포바이러스의 qPCR 검출을 설명하며, 이는 빠르고 민감하며 특이적이며 모호한 헤마톡실린 및 에오신 또는 면역조직화학적 염색 패턴을 해석하는 데 유용합니다.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

여기에서는 과산화효소 접합 2차 항체 및 티라미드 신호 증폭의 사용을 기반으로 5mC 산화 유도체의 공간 분포를 매핑하기 위한 민감한 면역화학적 방법을 설명합니다.

민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

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5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

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단백질 palmitate의 치료뿐만 아니라이 세포 내 단백질 인신 매매의 중요한 조절기입니다. 이것은 많은 시냅스 단백질이 palmitoylated 아르 뉴런에 특별한 관심입니다. 우리는 여러 세포 유형과 조직에 적용 할 수 있습니다 교양 뉴런에 palmitoylated 단백질을 감지하는 간단한 생화학 방법을 사용합니다.

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