전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정

이 실험 절차의 전반적인 목표는 전혈 자극 분석에서 생성되는 염증성 사이토카인을 측정하는 것입니다. 먼저, 원심분리를 통해 전혈의 세포 성분을 혈장에서 분리하고, 아인 오렌지(aine orange) 염색을 사용하여 백혈구 수를 측정합니다. 다음으로, 세포를 플레이트에 분주하고 LPS로 자극한 후 TP를 처리하여 미생물 패턴 인식 수용체를 보유한 세포의 사이토카인 생성을 유도합니다. 이후 자극 시작 후 특정 시점에서 배양 상층액을 수집합니다.

마지막으로, 상층액 내 사이토카인 농도를 96웰 플레이트 멀티플렉스 분석법으로 측정합니다. 이 간단한 방법을 통해 서로 다른 기증자의 자극된 세포에서 생성된 염증성 사이토카인 농도의 변화를 빠르게 평가할 수 있습니다. 이 방법은 특히 혈액 확보 가능량이 제한적인 상황에서, 병리학적으로 항염증 반응을 보이는 환자의 I one 매개 염증성 질환을 식별하는 데 매우 유용합니다.

사이토카인 농도를 측정할 때 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 Luminex 기반 기술을 통해 적은 샘플 양만으로도 여러 사이토카인을 동시에 측정할 수 있다는 점입니다. 환자와 연령 및 성별이 일치하는 건강한 대조군으로부터 10 milliliters 이상의 정맥혈 샘플을 채취하십시오. 이때 샘플은 반드시 소듐 헤파린 Vacutainer 혈액 채취관에 수집해야 하며, EDTA 또는 기타 항응고제는 분석을 방해하므로 첨가하지 마십시오. 채취 후 가능한 한 빨리 샘플을 처리하십시오. 필요한 경우, 샘플은 어두운 조명 조건의 상온에서 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다.

혈액 샘플을 상온에서 브레이크 기능을 끈 상태로 3000 RPM으로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면, 단핵구를 포함하는 버피 코트(buffy coat) 층이 섞이지 않도록 주의하며 튜브 상단의 혈장을 제거합니다. 버피 코트와 그 아래의 적혈구 펠릿을 상온의 무혈청 RPMI 배지에 재현탁하고, 혼합물을 부드럽게 피펫팅하여 세포를 세척합니다.

그런 다음 수집 튜브의 세포를 50 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. RPMI를 사용하여 부피를 50 mL까지 채우고, 각 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 세포를 3000 RPM에서 10분 동안 한 번 더 원심 분리합니다.

그다음 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 오염 물질을 제거하고 세포에 결합된 사이토카인을 없애기 위해 이 세척 단계를 2~4회 반복합니다. 세포 세척이 완료되면 무혈청 RPMI를 사용하여 총 부피가 20 milliliters가 되도록 재현탁합니다. 세포 수를 측정하기 위해 시료와 아크리딘 오렌지를 1:1로 혼합한 용액 20 microliters를 일회용 소터 비전 챔버에 로딩합니다. 최종 농도 1 microgram per milliliter로 사용된 아크리딘 오렌지는 핵이 있는 백혈구만을 염색하므로, 적혈구와 구분하여 측정할 수 있습니다.

세포 수를 측정한 후 D 양성 세포만 계산하십시오. 샘플을 무혈청 RPMI로 재현탁하여 최종 농도가 mL당 2백만 개의 세포가 되도록 합니다. 각 샘플에 대해, 테스트할 실험 조건이 표시된 24웰 플레이트의 중복 웰(duplicate wells)에 분주하십시오.

본 실험의 조건은 무자극, LPS 단독 처리, a TP 단독 처리, 그리고 LPS와 a TP 병용 처리군으로 구성됩니다. 각 웰에 희석된 세포 1 mL를 넣고, 해당 웰에 LPS를 최종 농도 1 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 시료를 5% CO₂ 배양기에서 37 °C로 2시간 40분 동안 배양합니다. 이 초기 배양 기간이 지난 후, a TP 단독 처리군과 LPS 및 a TP 병용 처리군 웰에 a TP를 최종 농도 2 mM이 되도록 첨가합니다. 그 후 플레이트를 37 °C에서 20분 동안 추가로 배양합니다.

두 번째 배양이 완료되면, 각 웰의 세포를 미리 라벨을 붙여둔 별도의 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 상온에서 10,000 RRP M로 2분 동안 원심분리한 후, 각 튜브의 상층액을 새로 라벨을 붙인 EOR 튜브로 옮깁니다. 상층액은 즉시 사이토카인 분석에 사용하거나, IL one beta 또는 다른 사이토카인의 농도를 평가하기 위해 냉동 보관할 수 있습니다. 본 샘플의 경우, Bio Plex 200 시스템과 bio plex pro, human cytokine X plex를 사용하여 분석합니다.

제조업체의 지침에 따릅니다. 이 그림에서 정상 전혈 세포를 L-P-S-A-T-P 또는 두 자극을 함께 처리하여 자극했을 때의 IL one beta 생성 분석 결과는 LPS와 A TP를 모두 처리했을 때의 반응을 보여주며, 그 크기는 자극받는 세포 수에 따라 달라집니다. 건강한 대조군과 달리, 자가염증성 질환을 보이는 환자의 전혈 분석에서는 외부에서 a TP를 첨가하지 않고 LPS만으로 자극했을 때 IL one beta 생성이 증가하는 것이 확인됩니다. 혈액과 같은 인체 유래 체액을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 보편적 주의 원칙(universal precautions)을 준수해야 함을 잊지 마십시오.