Name: 막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 학습하세요 막 단백질 폴딩의 열역학을 형광 분광학으로 측정하는 방법을. 트립토판 형광과 LAR 소포를 활용하여 Gibbs 자유 에너지를 정량 분석하는 실험 기법입니다.

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우리는 그녀의 데이터를 사용하기 위해 베이징 우 감사합니다. 이 작품은 JEK에 NSF 경력 보너스에 의해 지원되었다

1. 막 단백질 폴딩에 대한 ~ 50 나노미터 직경 소형 Unilamellar Vesicles (포드 SUV)의 준비 <ol><li> 1,2 - dimyristoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (DMPC) 클로로포름에 lipids의 솔루션은 스토리지를위한 유리병 수량 당 20 밀리그램에서 구입한 깨끗한 유리 튜브에 aliquotted입니다. 질소 가스 층은 지질 산화를 방지하기 위해 각 유리병에 추가하고, 유리병은 뚜껑과 parafilm과 함께 봉인하고 있습니다. 튜브는 사용 전까지 -20 ° C의 냉동고에 저장됩니다. </li><li> 클로로포름 20 MG의 지질의 나누어지는를 포함 하나의 약병은 각 실험에 사용됩니다. 유리병의 내용은없이 용매 남아 때까지 1 시간 동안 질소 가스의 흐름을 사용하여 건조합니다. </li><li> 말린 lipids 20 MM의 칼륨 인산 버퍼 1 ML에 resuspended 아르 ~ 30 초 동안 물 목욕 sonicator를 사용하여 (산도 = 7.3). 정지 지방질의이 솔루션은 흐림 나타납니다, 그리고 원뿔 바닥과 플라스틱 15 ML 튜브로 전송됩니다. 인산염 버퍼의 또 다른 한 ML의 나누어지는 원래 지질을 포함 빈 유리관에 추가하고, sonication이 반복되며 솔루션은 다음 같은 15 ML 튜브에 추가됩니다. 튜브의 마지막 볼륨이 재고 소포 솔루션 5 MG / ML의 지질 농도의 결과, 4 ML 때까지이 과정은 4 회 총 반복됩니다. </li><li> 지질 소포 솔루션의 4 ML 볼륨에 배치됩니다 따뜻한 (~ 30 ° C) 물 목욕, 및 50 % 듀티 사이클에서 1 시간 ultrasonicator의 microtip를 사용하여 sonicated. 물 목욕의 목적은 두 가지입니다. 첫째, 그것은 때문에 sonication 프로세스의 너무 뜨거운되는에서 지질 솔루션을 방지할 수 있습니다. 둘째, 따뜻한 목욕은 수성 지질 솔루션의 온도가 sonication 동안 이중층 위상 전이 온도 이상 유지 보장, DMPC 들어,이 전이 온도는 ~ 23 ° C. </li><li> sonicated 솔루션은 sonicator 팁에서 파편을 제거하고 필터링 솔루션은 37 하룻밤 equilibrated입니다 필터 0.22 μm의 주사기 ° C. 통해 전달된다 </li></ol> 2. 초기 형광 펼쳐 곡선에 대한 샘플 준비 <ol><li> 20 MM의 인산 버퍼 (산도 7.3) 10 M의 요소의 주식 솔루션은 이루어집니다. 이 요소의 많은 수량이 솔루션에서 중요한 볼륨을 차지하고 있기 때문에 물이 고체 (아니라 그 반대)에 추가하는 것이 중요합니다. 이 요소 솔루션은 깨끗하고, 빈 병 solutes를 추가하고 의도한 최종 볼륨에 물을 추가하여 만들 수 있습니다. 이 솔루션은 물 목욕이나 용질을 용해하는 감동과 함께 뜨거운 접시에 온난 화를 요구할 수 있습니다. 요소는 흡습이므로, 우레아 주식 솔루션의 실제 농도는 굴절률을 사용하여 결정한다 1. </li><li> 20 MM 인산 (산도 7.3)의 주식 버퍼 솔루션은 이루어집니다. </li><li> 의 주식 솔루션은 단백질이 준비가되어 펼쳐진 거죠. 이 주식 단백질 솔루션 8 M의 요소, 20 MM 인산 버퍼에서 ~ 200 μm의 단백질의 농도가 있어야합니다. </li><li> 형광 연구에 대한 샘플은 다음과 같은 방법으로 준비하고 있습니다. 재고 단백질의 적절한 볼륨 (섹션 2.3), 주식 지질 솔루션 (5 MG / ML 지질, 제 1 항), 주식 10 M의 요소 솔루션 (섹션 2.1), 주식 인산 버퍼 (섹션 2.2)은 ~ 4를 포함하는 샘플을 만들어 결합 μm의 단백질, 1 MG / ML 지질, 1 M의 단위 0-8 M의 요소. 각 샘플의 총 부피는 200 μL입니다. 예를 들어 스프레드 시트 (표 1) 목록의 볼륨이 200 μm의 주식 단백질 솔루션을 사용하는 데 필요한 것이 포함되어 있습니다. </li><li> 빈 샘플 섹션 2.4에서 설명한대로 만들어진, 그러나, 단백질이 추가되지 않습니다. 다른 구성 요소의 농도 섹션 2.4들에게 동일하므로 단백질 대신에, 8 M의 요소 솔루션 4 μL를 추가할 수 있습니다. 이러한 공백은 산란과 단백질의 형광 스펙트럼에 나타나는 다른 배경 신호를 빼야하는 데 사용됩니다. </li><li> 섹션 2.4와 2.5의 샘플이 완성 접는와 평형을 보장하기 위해 형광 스펙트럼 측정하기 전에 최소한 2 시간 동안 37 ° C에서 부화 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 형광 스펙트럼 측정 각각의 샘플 및 빈의 트립토판의 형광은 정상 상태 fluorometer를 사용하여 측정됩니다. 형광 스펙트럼은 티로신 잔류물의 여기를 피하기 위해 290 nm의 파장의 여기로 기록된하고, 305-500 nm의에서 스캔해야합니다. 일반 입구와 출구 밴드는 3 NM입니다. 파장 단위 및 통합 시간은 신호 대 잡음 비율에 대해 최적화할 수 있습니다. 파장 단위 및 통합 시간에 대한 일반적인 값은 1 NM / 단계 각각 0.5 초 / 단계입니다. 막은 온도가 이중층 위상 전이 온도 이상의 경우에만 합성 lipids에 일반적으로 배 단백질. 따라서, DMPC의 경우, 시료의 온도는 30 일정 열립니다 ° C.를 160 μL 용량 microvolume 융합 실리카 쿠베트는이 전직에 활용periments. 4. 펼쳐 막 단백질의 깁스 자유 에너지의 초기 전개 곡선 및 견적 생성 <ol><li> XY의 데이터 세트의 형태로 형광 스펙트럼은 같은 이고르 프로, Matlab, 유래, 또는 Excel과 같은 소프트웨어에로드됩니다. </li><li> 요소 및 지질 소포 배경에서 신호가 다음 절차를 사용하여 빼서해야합니다 지질 vesicles 및 요소의 특정 농도의 존재에있는 단백질의 A = 원시 형광 스펙트럼 스펙트럼. 스펙트럼 B 지질 vesicles와 같은 요소 농도를 포함 해당 빈 샘플의 형광 스펙트럼 = 원료 것과 스펙트럼에서, 어떤 단백질이 비어 샘플에 없습니다. 수정된 스펙트럼 = 스펙트럼 - C * 스펙트럼 B. C가 1.0으로 일반적으로 동일 스칼라입니다. 어떤 경우에는, C 때문에 원인이 산란 문제 이하 1.0보다 큰 이상 또는 ~ 305-320 nm의 영역에 가까운 빼기 이하. </li><li> 최대 형광, λ 최대의 파장은 각 요소 농도에 대한 수정 스펙트럼에서 tabulated 있습니다. 완벽에 대한 일반적인 가치는 접힌 단백질의 그 ~ 330 nm의 상태에서 막 단백질 350 NM입니다 펼쳐진 거죠. Tabulated 파장가 펼쳐졌 인구의 분율에 λ 최대의 가치를 상호 연관시킬 1.0 범위 0.0에 λ 최대 값 (~ 350 nm의로 ~ 330)의 범위를 변환하여 펼쳐 분수로 변환됩니다. 예를 들면, 330 nm의 최대의 λ 값이 0.0에 해당하는 350 nm의 1.0에 해당하고, 340 nm의이 분수의 관점에서 0.5에 해당 펼쳐진 거죠. 펼쳐 단백질의이 분수는 다음 요소 농도 역모를 꾸몄다입니다. 위에서 언급한 바와 같이, 요소의 농도는 굴절률을 측정하여 실험적으로 결정되어야합니다. </li><li> 우리는 단백질이 두 가지 상태 중 하나에 존재 할 수 있다고 가정합니다 : 접으면 또는 펼쳐진 거죠. 분수의 줄거리는 F, 펼쳐, 대 요소의 농도, C는 방정식에 맞게 수 : 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="방정식 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 2"> 계수 m은 denaturant 농도와 관련하여 자유 에너지의 변화의 속도에 해당하고, C M은 접힌 인구가 펼쳐 인구와 동일되는 미드의 요소 농도에 해당합니다. 이 값은 R은 (0.001987 kcal / 몰 • K) 가스 법률 상수입니다. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 최소 제곱 피팅에서 얻은 피팅 변수이며, T는 (303 K) 온도입니다. </li><li> 맞지에서 얻은 계수는 요소의 부재에서 펼쳐의 깁스 자유 에너지 (kcal / 몰) 결정하기 위해 활용됩니다 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="방정식 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 3"> . </li></ol> 5. 펼쳐의 깁스 자유 에너지의보다 정확한 측정 곡선을 펼쳐 최적화. <ol><li> 위에서 설명한 펼쳐 커브가 λ 최대의 가장 큰 변화를 일으키는 요소의 농도의 범위를 나타낸다. 이 범위는 일반적으로 소형이며, 전개의 대부분이 작은 범위 내에서 발생합니다. 펼쳐의 자유 에너지를 정확하게 결정하기 위해 추가 샘플은 최적화된 최소 제곱 피팅에 필요한 많은 데이터 포인트를 포함하는 음모를 얻기 위해이 지역에서 분석하고 있습니다. 보다 정확하게 펼쳐 곡선이 중요한 지역의 모양을 나타내기 위해 0.2 M의 증가 4 M의 요소 - 단백질 2 및 4 M의 요소 사이에 펼쳐집니다 예를 들어, 샘플 2가 포함되어있다는 사실을 만들 수 있습니다. 그것은 각 요소의 농도에서 빈 스펙트럼을 측정하기 위해 필요하지 않습니다, 그것은 모든 ~ 0.5 M 단계 빈 스펙트럼을 측정하기 충분하다. </li><li> 이 음모를 얻은 펼쳐의 자유 에너지는 원래의 전개 곡선에서 얻은 것과 약간 다를 수 있지만,보다 정확한 가치를 반영 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : <table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> 마지막 [요소], M </td><td> 재고 단백질 (μL) </td><td> 재고 지질 (μL) </td><td> 재고 10 M 우레아 (μL) </td><td> 주식 버퍼 (μL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0.16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> 표 1. 형광 샘플을하기 위해 필요한 재고 솔루션 볼륨 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 단일 트립토판 성분을 포함하고 ~ 5 μm의 대표 막 단백질의 트립토판 형광 스펙트럼. 단백질의 (A) 생 형광 스펙트럼 (스펙트럼 4.2에서) 빈의 (B) 생 형광 스펙트럼은 (4.2에서 스펙트럼 B) (C) 4.2에서 스펙트럼을 교정. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 다양한 요소의 농도에 대한 그림 1에서 막 단백질의 트립토판 형광 스펙트럼을 교정. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 4.4 방정식에 맞게으로 그림 2에있는 데이터에서 얻은 곡선을 펼쳐. 깁스 자유 에너지는 섹션 4.5에 따라 계산됩니다.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
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<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

현재 프로토콜은 트립토판 잔류물을 포함하는 막 - 관련 단백질과 펩티드의 곡선을 펼쳐의 생성을 설명합니다. 여기, 그것은 트립토판의 형광이 단백질이 접힌 및 합성 지질 vesicles에 삽입하거나, 용액에 펼쳐진 여부를 반영하는 것으로 간주됩니다. 이러한 두 상태 폴딩 및 denaturant 농도와 자유 에너지의 선형 의존성과 같은 추가 가정은, 현재의 보고서에서 만들어집니다,. 다른 방정식에서 이러한 가정의 결과의 수정 2 실험 프로토콜은 쉽게 다른 spectroscopic observables을 활용하는 수정할 수 있습니다, 이러한 원형 dichroism, 흡수, 또는 불순물 염료의 형광 3뿐만 아니라 겔 전기 영동으로 4. 또한, 같은 음이온 lipids 같은 guanidinium, 산성 솔루션, 또는 온도뿐만 아니라 대체 lipids / vesicles와 같은 다른 denaturants,, 대형 unilamellar vesicles, 또는 micelles는 마지...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>인산수소칼륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소칼륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

막 단백질 접힘은 기본적인 건강 관련 모두 의미있는 새로운 주제입니다. 세포의 underlies 단백질이 유비 쿼터스 가족의 접는 종합 학습에 대한 필요성의 막 단백질의 풍부. 또한, misfolded 단백질과 관련된 질병의 특징 우리의 방위 능력에 대한 발전은 단백질 폴딩의 분야에서 상당한 실험 및 이론적인 노력을 동기 있습니다. 이 중요한 분야에서 급속한 진전은 불행하게도 막 단백질과 접는 메커니즘의 복잡과 관련된 고유의 도전에 의해 방해합니다. 여기, 우리는 E. 대표 일체형 멤브레인 단백질에 대한, denaturant, Δ G ° H 2 O의 부재에서 펼쳐의 깁스 자유 에너지의 열역학적 특성을 측정하기위한 실험 절차를 설명합니다 대장균. 이 프로토콜은 denaturant 농도의 함수로 접힌 및 펼쳐진 상태의 평형 인구를 결정하기 위해 형광 분광법의 응용 프로그램에 초점을 맞추고 있습니다. 합성 지질 vesicles뿐 아니라 데이터 분석 절차의 주요 단계의 준비를 위해 실험적인 고려 사항이 강조 표시됩니다. 이 기술은 다양한이며 온도와 산도,뿐만 아니라 lipids과 micelles의 다양한 환​​경을 포함하여 접는 denaturant의 종류와 추구있을 수 있습니다. 현재 프로토콜은 아래에 설명되어 기준 집합을 충족하는 막이나 가용성 단백질에 일반 수있는 하나입니다.

트립토판 형광으로 막 단백질 폴딩의 깁스 자유 에너지를 얻기 위해이 동영상 기사 세부 실험 절차.

막 단백질 접힘은 기초 과학 및 보건 의료 측면 모두에서 중요한 의미를 갖는 최신 연구 주제입니다. 세포 내 막 단백질의 풍부함은...

다음 실험의 전반적인 목표는 막 단백질 접힘과 관련된 열역학을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 막 단백질의 접힘 환경을 제공하기 위해 작은 LAR 소포를 조립함으로써 달성됩니다. 소포가 구성되면, 이를 사용하여 단백질과 체계적으로 농도를 변화시킨 urea를 포함하는 시료를 준비합니다.다음으로, 각 시료의 트립토판 형광 스펙트럼을 측정합니다. 막 단백질 언폴딩 곡선을 생성하는 데 필요한 데이터를 수집하기 위해, 트립토판 형광 스펙트럼으로 생성된 언폴딩 곡선을 기반으로 막 단백질 언폴딩의 깁스 자유 에너지를 구하는 방법을 보여주는 결과들을 얻습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스의 조교수 쥬디 킴입니다.지금부터 시청하실 방법은 막단백질의 중요한 특성을 밝혀냅니다. 구체적으로, 지질 이중층에 접혀 삽입된 단백질의 안정성을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 uc, San Diego 화학과의 대학원생 Diana Ottinger입니다.오늘은 대표적인 막 단백질을 사용하여 이 방법을 시연하겠습니다. 하지만 이 기술은 일반적인 방법이므로 막 결합 펩타이드나 수용성 단백질과 같은 다른 생물학적 시스템에도 적용할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.본 프로토콜을 시작하기 전에, DME-PC, SN-글리세롤-3-포스포콜린 또는 DMPC 지질의 클로로포름 용액을 깨끗한 유리 바이알에 분주하여 구매하십시오. 바이알당 20 mg의 양으로 분주하며, 지질 산화를 방지하기 위해 각 바이알에 질소 가스 층을 추가하고 밀봉합니다. 각 실험에는 클로로포름에 녹아 있는 20 mg의 지질이 포함된 단일 바이알이 사용됩니다.스탁 소포(vesicle) 용액을 준비하려면, 먼저 테플론 격막(septum)과 바늘을 사용하여 용매가 남지 않을 때까지 질소 가스 흐름 하에 바이알의 내용물을 1시간 동안 건조합니다. 건조된 지질에 pH 7.3의 20 millimolar 인산칼륨 완충액 1 milliliter를 첨가하고 항온수조에서 약 30초 동안 재현탁합니다. 생성된 탁한 현탁액을 원뿔형 바닥 파이펫이 있는 플라스틱 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.지질이 원래 들어있던 빈 유리 바이알에 인산 완충액 1 mL를 추가로 넣고 초음파 처리를 반복합니다. 생성된 현탁액을 동일한 15 mL 튜브에 추가합니다. 이 과정을 총 4회 반복하여 최종 부피 4 mL, 지질 농도 5 mg/mL를 얻습니다.지질 소포 현탁액을 온수조에 넣고, 초음파 처리기 마이크로 팁을 사용하여 50% 듀티 사이클로 1시간 동안 초음파 처리합니다. 온수조는 지질 용액이 과열되는 것을 방지하며, 수성 지질 용액의 온도를 초음파 처리 중의 이중층 상전이 온도보다 높게 유지하는 역할을 합니다.초음파 처리된 용액을 0.22 micron 시린지 필터로 여과하여 ator 팁에서 나온 찌꺼기를 제거하고, 여과된 용액이 37 °C에서 하룻밤 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 초기 형광 언폴딩을 위한 샘플을 준비하려면, 20 millimolar 인산염 완충액에 10 molar urea를 녹여 스톡 용액을 만들고, 20 millimolar 인산염 스톡 완충액을 준비합니다. 서면 프로토콜에 따라, urea 농도는 굴절계를 사용하여 굴절률을 측정하고 기지 값과 비교하여 실험적으로 결정해야 합니다.다음으로, 8 M urea, 20 mM 인산염 완충액 내에서 단백질 농도가 약 200 µM인 변성 단백질 스톡 용액을 준비합니다. 본 영상에서는 막 단백질 OPA A를 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 형광 연구용 샘플은 스톡 단백질, 스톡 지질 용액, 스톡 10 M urea 용액 및 스톡 인산염 완충액을 적절한 부피로 혼합하여 준비하며, 최종 부피 200 µL 내에 단백질 약 4 µM, 지질 1 mg/mL, 그리고 0 M에서 8 M까지 1 M 간격의 urea가 포함되도록 합니다. 공시료(Blank samples) 역시 동일한 방식으로 제조합니다.단, 단백질 대신 8 M urea 용액 4 µL를 대체하여 넣습니다. 이러한 공시료(blank)는 단백질의 형광 스펙트럼에 나타나는 산란 및 배경 신호를 제거하기 위해 제작합니다. 형광 스펙트럼을 측정하기 전, 단백질 시료와 공시료를 37 °C에서 최소 2시간 동안 배양하십시오.완전한 폴딩을 보장하기 위해 측정 1시간 전에 형광 광도계를 켜십시오. 막 단백질은 일반적으로 온도가 이중층 상전이 온도보다 높을 때에만 합성 지질 내에서 폴딩됩니다. 따라서 DMPC의 경우, 형광 광도계 내 샘플 홀더의 온도를 30 °C로 설정합니다.정상 상태 형광 광도계(steady state fluorimeter)에서 형광 실험을 설정하고, 블랭크 상태에서 각 샘플의 트립토판 형광을 측정합니다. 티로신 잔기의 여기를 방지하기 위해 여기 파장은 290 nanometers로 설정하고, 방출 파장은 305에서 500 nanometers 범위에서 수집합니다. 입사 및 출사 밴드패스(band pass)는 3 nanometers로 설정하십시오.신호 대 잡음비를 위해 파장 증분과 적분 시간을 최적화할 수 있습니다. 파장 증분과 적분 시간의 일반적인 값은 각각 단계당 1 nm 및 단계당 0.5 s입니다. 160 µL 용량의 마이크로 볼륨 융해 석영 Q Vet에 샘플 200 µL를 피펫팅하고, Q Vet을 장치의 Q Vet 홀더에 넣으십시오.마지막으로, 형광 스펙트럼의 XY 데이터 시트를 Igor Pro, MATLAB origin 또는 Excel과 같은 소프트웨어에 로드하여 형광 측정을 시작할 수 있습니다. 본 시연에서는 Igor Pro를 사용하여 요소 및 지질 소포 배경을 제거하고, 공시료(blank sample)의 형광 스펙트럼에 S 스케일러를 곱한 후, 이를 단백질 지질 용액의 가공되지 않은 형광 스펙트럼에서 뺍니다. 해당 요소 농도에서 보정된 스펙트럼으로부터 최대 형광 파장 또는 lambda max를 표로 작성하십시오.각 요소를 위한 urea 농도별 분석입니다. 완전히 변성된 막 단백질의 전형적인 값은 350 nanometers입니다. 접힌 단백질의 값은 약 330 nanometers이며, lambda max 값의 범위를 0에서 1 사이의 범위로 변환하여 표의 파장 값을 변성 분율로 환산함으로써 lambda max 값을 변성된 집단의 분율과 상관시킵니다.그런 다음, urea 농도에 따른 단백질의 변성 분율을 도식화합니다. 변성 분율 F와 urea 농도 C의 관계도는 단백질이 접힘 상태 또는 변성 상태로 존재할 수 있다고 가정하는 방정식에 대입하여 피팅할 수 있습니다. 계수 M은 변성제 농도에 따른 자유 에너지의 변화율에 해당하며, CM은 접힘 상태의 집단과 변성 상태의 집단이 동일해지는 중간 urea 농도를 나타냅니다.R은 기체 상수이며, T는 켈빈 단위의 온도입니다. 피팅 절차를 통해 계수 m과 cm의 값을 얻습니다.이 계수들을 곱하여 요소(urea)가 없을 때의 언폴딩 깁스 자유 에너지인 delta G를 결정합니다. 위에서 설명한 언폴딩 곡선은 lambda max에 가장 큰 변화를 일으키는 요소 농도 범위를 나타냅니다. 언폴딩 자유 에너지를 정밀하게 결정하기 위해, 일반적으로 이 범위는 좁으며 대부분의 언폴딩이 이 작은 범위 내에서 일어납니다.최적의 최소제곱법 피팅(least squares fitting)에 필요한 충분한 데이터 포인트를 확보하기 위해 이 영역에서 추가 시료를 분석해야 합니다. 예를 들어, 단백질이 2M에서 4M 사이에서 풀리는 경우, 언폴딩 곡선(unfolding curve)의 이 중요한 영역의 형태를 더 정확하게 밝히기 위해 해당 urea 농도 범위 내에서 0.2M 간격으로 시료를 준비할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 적어도 0.5M 단계마다, 그리고 가급적 0.2M 단계마다 블랭크(blank)를 포함해야 합니다.이 플롯에서 얻은 언폴딩(unfolding) 자유 에너지는 원래의 언폴딩 곡선에서 얻은 값과 약간 다를 수 있으나, 표시된 더 정밀한 값을 반영합니다. 여기 단일 트립토판 잔기를 포함하는 대표적인 막 단백질 om a의 트립토판 형광 스펙트럼이 있습니다. 프로토콜에 설명된 대로 단백질의 원시 형광 스펙트럼에서 공시료(blank)의 원시 형광 스펙트럼을 감하여 보정된 스펙트럼을 얻었습니다.설명된 방법에 따라 다양한 urea 농도에서 측정된 막 단백질의 보정된 트립토판 형광 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다. 본 시연에서는 단백질이 접혀 있거나 펼쳐져 있으며, 중간의 안정적인 상태는 없다는 가정하에 언폴딩 곡선을 생성하였습니다. 파라미터 M은 언폴딩 시 용매에 노출되는 폴리펩타이드의 양을 나타내며, CM은 접힌 상태와 펼쳐진 상태의 개체수가 동일해지기 위해 필요한 변성제 농도를 나타내는 중요한 값입니다.CM과 M의 값이 클수록 단백질이 안정함을 나타냅니다. 이 절차를 따랐을 때 OPA $\alpha$의 언폴딩 깁스 자유 에너지는 6.2 kilo calories per mole로 계산되었습니다. 열, pH 및 기타 화학적 변성제와 같은 다른 언폴딩 방법들을 사용하여 단백질 폴딩의 열역학에 관한 유사한 정보를 얻을 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 접힘 상태와 펼침 상태의 서로 다른 형광 특성을 기반으로 단백질의 안정성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또는, 선택하는 분석 도구와 관계없이 단백질의 구조적 변화를 보고할 수 있는 방법이라면 원편광 이색성(circular dichroism)과 같은 다른 방법을 사용하여 펼침 곡선을 생성할 수도 있습니다. 펼침 곡선법은 다각적으로 활용 가능하며, 광범위한 막 단백질 및 수용성 단백질에 적용될 수 있습니다.

thermodynamics-membrane-protein-folding-measured-fluorescence

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

이 비디오는 단백질 호모올리고머화를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(FFS) 기술을 보여줍니다. 샘플의 형광 표지된 단백질은 FFS를 사용하여 단백질 올리고머화를 연구할 때 에이전트를 사용하여 이합체화됩니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질이 작은 관찰 부피 안팎으로 이동할 때 단백질의 올리고머 상태를 결정하기 위해 형광 분자의 밝기 변동 분석을 수행합니다.

단백질 호모올리고머화(Homo-Oligomerization)를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

단백질 기능의 주요 단계, 특히 골격 구조 변화와 양성자 전달 반응은 종종 마이크로초에서 밀리초 사이의 시간 척도에서 발생합니다. 이러한 역학 과정은 시간 분해 단계 스캔 푸리에 변환 적외선 분광법으로 연구할 수 있으며, 특히 빛에 의해 기능이 트리거되는 단백질의 경우 연구할 수 있습니다.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

시차 주사 형광 측정법은 단백질과의 상호 작용을 위해 작은 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 여기에서는 이러한 분석을 확장하여 작은 분자와 단백질 파트너 사이의 해리 상수를 추정하는 간단한 방법을 제시합니다.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

본 프로토콜은 다운스트림 기능 및 구조 분석을 위한 품질을 평가하기 위해 막 단백질에 대해 형광 크기 배제 크로마토그래피(FSEC)를 수행하는 절차를 설명합니다. 세제 가용화 및 세제가 없는 조건에서 여러 G-단백질 결합 수용체(GPCR)에 대해 수집된 대표적인 FSEC 결과가 제시됩니다.

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

학습하세요 막 단백질 폴딩의 열역학을 형광 분광학으로 측정하는 방법을. 트립토판 형광과 LAR 소포를 활용하여 Gibbs 자유 에너지를 정량 분석하는 실험 기법입니다.

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

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