막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

다음 실험의 전반적인 목표는 막 단백질 접힘과 관련된 열역학을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 막 단백질의 접힘 환경을 제공하기 위해 작은 LAR 소포를 조립함으로써 달성됩니다. 소포가 구성되면, 이를 사용하여 단백질과 체계적으로 농도를 변화시킨 urea를 포함하는 시료를 준비합니다.

다음으로, 각 시료의 트립토판 형광 스펙트럼을 측정합니다. 막 단백질 언폴딩 곡선을 생성하는 데 필요한 데이터를 수집하기 위해, 트립토판 형광 스펙트럼으로 생성된 언폴딩 곡선을 기반으로 막 단백질 언폴딩의 깁스 자유 에너지를 구하는 방법을 보여주는 결과들을 얻습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스의 조교수 쥬디 킴입니다.

지금부터 시청하실 방법은 막단백질의 중요한 특성을 밝혀냅니다. 구체적으로, 지질 이중층에 접혀 삽입된 단백질의 안정성을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 uc, San Diego 화학과의 대학원생 Diana Ottinger입니다.

오늘은 대표적인 막 단백질을 사용하여 이 방법을 시연하겠습니다. 하지만 이 기술은 일반적인 방법이므로 막 결합 펩타이드나 수용성 단백질과 같은 다른 생물학적 시스템에도 적용할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 프로토콜을 시작하기 전에, DME-PC, SN-글리세롤-3-포스포콜린 또는 DMPC 지질의 클로로포름 용액을 깨끗한 유리 바이알에 분주하여 구매하십시오. 바이알당 20 mg의 양으로 분주하며, 지질 산화를 방지하기 위해 각 바이알에 질소 가스 층을 추가하고 밀봉합니다. 각 실험에는 클로로포름에 녹아 있는 20 mg의 지질이 포함된 단일 바이알이 사용됩니다.

스탁 소포(vesicle) 용액을 준비하려면, 먼저 테플론 격막(septum)과 바늘을 사용하여 용매가 남지 않을 때까지 질소 가스 흐름 하에 바이알의 내용물을 1시간 동안 건조합니다. 건조된 지질에 pH 7.3의 20 millimolar 인산칼륨 완충액 1 milliliter를 첨가하고 항온수조에서 약 30초 동안 재현탁합니다. 생성된 탁한 현탁액을 원뿔형 바닥 파이펫이 있는 플라스틱 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.

지질이 원래 들어있던 빈 유리 바이알에 인산 완충액 1 mL를 추가로 넣고 초음파 처리를 반복합니다. 생성된 현탁액을 동일한 15 mL 튜브에 추가합니다. 이 과정을 총 4회 반복하여 최종 부피 4 mL, 지질 농도 5 mg/mL를 얻습니다.

지질 소포 현탁액을 온수조에 넣고, 초음파 처리기 마이크로 팁을 사용하여 50% 듀티 사이클로 1시간 동안 초음파 처리합니다. 온수조는 지질 용액이 과열되는 것을 방지하며, 수성 지질 용액의 온도를 초음파 처리 중의 이중층 상전이 온도보다 높게 유지하는 역할을 합니다.

초음파 처리된 용액을 0.22 micron 시린지 필터로 여과하여 ator 팁에서 나온 찌꺼기를 제거하고, 여과된 용액이 37 °C에서 하룻밤 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 초기 형광 언폴딩을 위한 샘플을 준비하려면, 20 millimolar 인산염 완충액에 10 molar urea를 녹여 스톡 용액을 만들고, 20 millimolar 인산염 스톡 완충액을 준비합니다. 서면 프로토콜에 따라, urea 농도는 굴절계를 사용하여 굴절률을 측정하고 기지 값과 비교하여 실험적으로 결정해야 합니다.

다음으로, 8 M urea, 20 mM 인산염 완충액 내에서 단백질 농도가 약 200 µM인 변성 단백질 스톡 용액을 준비합니다. 본 영상에서는 막 단백질 OPA A를 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 형광 연구용 샘플은 스톡 단백질, 스톡 지질 용액, 스톡 10 M urea 용액 및 스톡 인산염 완충액을 적절한 부피로 혼합하여 준비하며, 최종 부피 200 µL 내에 단백질 약 4 µM, 지질 1 mg/mL, 그리고 0 M에서 8 M까지 1 M 간격의 urea가 포함되도록 합니다. 공시료(Blank samples) 역시 동일한 방식으로 제조합니다.

단, 단백질 대신 8 M urea 용액 4 µL를 대체하여 넣습니다. 이러한 공시료(blank)는 단백질의 형광 스펙트럼에 나타나는 산란 및 배경 신호를 제거하기 위해 제작합니다. 형광 스펙트럼을 측정하기 전, 단백질 시료와 공시료를 37 °C에서 최소 2시간 동안 배양하십시오.

완전한 폴딩을 보장하기 위해 측정 1시간 전에 형광 광도계를 켜십시오. 막 단백질은 일반적으로 온도가 이중층 상전이 온도보다 높을 때에만 합성 지질 내에서 폴딩됩니다. 따라서 DMPC의 경우, 형광 광도계 내 샘플 홀더의 온도를 30 °C로 설정합니다.

정상 상태 형광 광도계(steady state fluorimeter)에서 형광 실험을 설정하고, 블랭크 상태에서 각 샘플의 트립토판 형광을 측정합니다. 티로신 잔기의 여기를 방지하기 위해 여기 파장은 290 nanometers로 설정하고, 방출 파장은 305에서 500 nanometers 범위에서 수집합니다. 입사 및 출사 밴드패스(band pass)는 3 nanometers로 설정하십시오.

신호 대 잡음비를 위해 파장 증분과 적분 시간을 최적화할 수 있습니다. 파장 증분과 적분 시간의 일반적인 값은 각각 단계당 1 nm 및 단계당 0.5 s입니다. 160 µL 용량의 마이크로 볼륨 융해 석영 Q Vet에 샘플 200 µL를 피펫팅하고, Q Vet을 장치의 Q Vet 홀더에 넣으십시오.

마지막으로, 형광 스펙트럼의 XY 데이터 시트를 Igor Pro, MATLAB origin 또는 Excel과 같은 소프트웨어에 로드하여 형광 측정을 시작할 수 있습니다. 본 시연에서는 Igor Pro를 사용하여 요소 및 지질 소포 배경을 제거하고, 공시료(blank sample)의 형광 스펙트럼에 S 스케일러를 곱한 후, 이를 단백질 지질 용액의 가공되지 않은 형광 스펙트럼에서 뺍니다. 해당 요소 농도에서 보정된 스펙트럼으로부터 최대 형광 파장 또는 lambda max를 표로 작성하십시오.

각 요소를 위한 urea 농도별 분석입니다. 완전히 변성된 막 단백질의 전형적인 값은 350 nanometers입니다. 접힌 단백질의 값은 약 330 nanometers이며, lambda max 값의 범위를 0에서 1 사이의 범위로 변환하여 표의 파장 값을 변성 분율로 환산함으로써 lambda max 값을 변성된 집단의 분율과 상관시킵니다.

그런 다음, urea 농도에 따른 단백질의 변성 분율을 도식화합니다. 변성 분율 F와 urea 농도 C의 관계도는 단백질이 접힘 상태 또는 변성 상태로 존재할 수 있다고 가정하는 방정식에 대입하여 피팅할 수 있습니다. 계수 M은 변성제 농도에 따른 자유 에너지의 변화율에 해당하며, CM은 접힘 상태의 집단과 변성 상태의 집단이 동일해지는 중간 urea 농도를 나타냅니다.

R은 기체 상수이며, T는 켈빈 단위의 온도입니다. 피팅 절차를 통해 계수 m과 cm의 값을 얻습니다.

이 계수들을 곱하여 요소(urea)가 없을 때의 언폴딩 깁스 자유 에너지인 delta G를 결정합니다. 위에서 설명한 언폴딩 곡선은 lambda max에 가장 큰 변화를 일으키는 요소 농도 범위를 나타냅니다. 언폴딩 자유 에너지를 정밀하게 결정하기 위해, 일반적으로 이 범위는 좁으며 대부분의 언폴딩이 이 작은 범위 내에서 일어납니다.

최적의 최소제곱법 피팅(least squares fitting)에 필요한 충분한 데이터 포인트를 확보하기 위해 이 영역에서 추가 시료를 분석해야 합니다. 예를 들어, 단백질이 2M에서 4M 사이에서 풀리는 경우, 언폴딩 곡선(unfolding curve)의 이 중요한 영역의 형태를 더 정확하게 밝히기 위해 해당 urea 농도 범위 내에서 0.2M 간격으로 시료를 준비할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 적어도 0.5M 단계마다, 그리고 가급적 0.2M 단계마다 블랭크(blank)를 포함해야 합니다.

이 플롯에서 얻은 언폴딩(unfolding) 자유 에너지는 원래의 언폴딩 곡선에서 얻은 값과 약간 다를 수 있으나, 표시된 더 정밀한 값을 반영합니다. 여기 단일 트립토판 잔기를 포함하는 대표적인 막 단백질 om a의 트립토판 형광 스펙트럼이 있습니다. 프로토콜에 설명된 대로 단백질의 원시 형광 스펙트럼에서 공시료(blank)의 원시 형광 스펙트럼을 감하여 보정된 스펙트럼을 얻었습니다.

설명된 방법에 따라 다양한 urea 농도에서 측정된 막 단백질의 보정된 트립토판 형광 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다. 본 시연에서는 단백질이 접혀 있거나 펼쳐져 있으며, 중간의 안정적인 상태는 없다는 가정하에 언폴딩 곡선을 생성하였습니다. 파라미터 M은 언폴딩 시 용매에 노출되는 폴리펩타이드의 양을 나타내며, CM은 접힌 상태와 펼쳐진 상태의 개체수가 동일해지기 위해 필요한 변성제 농도를 나타내는 중요한 값입니다.

CM과 M의 값이 클수록 단백질이 안정함을 나타냅니다. 이 절차를 따랐을 때 OPA $\alpha$의 언폴딩 깁스 자유 에너지는 6.2 kilo calories per mole로 계산되었습니다. 열, pH 및 기타 화학적 변성제와 같은 다른 언폴딩 방법들을 사용하여 단백질 폴딩의 열역학에 관한 유사한 정보를 얻을 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 접힘 상태와 펼침 상태의 서로 다른 형광 특성을 기반으로 단백질의 안정성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또는, 선택하는 분석 도구와 관계없이 단백질의 구조적 변화를 보고할 수 있는 방법이라면 원편광 이색성(circular dichroism)과 같은 다른 방법을 사용하여 펼침 곡선을 생성할 수도 있습니다. 펼침 곡선법은 다각적으로 활용 가능하며, 광범위한 막 단백질 및 수용성 단백질에 적용될 수 있습니다.