막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

트립토판 형광으로 막 단백질 폴딩의 깁스 자유 에너지를 얻기 위해이 동영상 기사 세부 실험 절차.

다음 실험의 전반적인 목표는 막 단백질 접힘과 관련된 열역학을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 작은 LAR 소포를 조립하여 막 단백질에 접히는 환경을 제공함으로써 달성됩니다. 일단 구성되면 소포는 단백질과 체계적으로 다양한 농도의 요소를 포함하는 샘플을 준비하는 데 사용됩니다.

다음으로, 각 샘플의 트립토판 형광 스펙트럼을 측정합니다.막 단백질 풀림 곡선을 생성하는 데 필요한 데이터를 수집하기 위해 트립토판 형광 스펙트럼에서 생성된 풀림 곡선을 기반으로 막 단백질 풀림의 Gibbs 자유 에너지를 얻을 수 있는 방법을 보여주는 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Judy Kim입니다. 저는 샌디에이고에 있는 캘리포니아 대학교의 조교수입니다.

여러분이 곧 보게 될 방법은 막 단백질의 중요한 특성을 보여줍니다. 구체적으로, 접혀 지질 이중층에 삽입된 단백질의 안정성을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 제 이름은 다이애나 오팅거(Diana Ottinger)이고, 샌디에이고 UC 화학과 대학원생입니다.

오늘은 대표적인 막 단백질에서 이 방법을 시연해 보겠습니다. 그러나, 이 기술은 일반적이며 막 관련 펩타이드 및 용해성 단백질과 같은 다른 생물학적 시스템에 적용될 수 있습니다. 시작하겠습니다.

이 프로토콜을 시작하기 전에 DME 오일 1개, SN 글리세롤, 포스포콜린 또는 DMPC 3개, 클로로포름 및 Eloqua의 지질을 깨끗한 유리 바이알에 넣는 용액을 구입하십시오. 바이알 수량당 20mg의 경우 각 바이알에 질소 가스 층을 추가하여 지질 산화를 방지하고 바이알을 밀봉합니다. 클로로포름 20mg의 지질이 들어 있는 단일 바이알이 각 실험에 사용됩니다.

스톡 소포 용액을 준비하려면 먼저 용매가 남지 않을 때까지 테플론 격막과 바늘을 사용하여 바이알의 내용물을 질소 가스 흐름에서 1시간 동안 건조시키는 것으로 시작합니다. 건조된 지질에 20밀리몰의 인산칼륨 완충액 1ml, pH 7.3을 첨가하고 수조기에 약 30초 동안 매달아 둡니다. 생성된 흐린 현탁액을 원뿔형 바닥 피펫이 있는 플라스틱 15ml 튜브로 옮깁니다.

원래 지질이 들어있는 빈 유리 바이알에 1 밀리리터의 인산염 완충액을 추가하고 초음파 처리를 반복합니다. 결과 현탁액을 동일한 15ml 튜브에 추가합니다. 이 과정을 총 4회 반복하여 최종 부피 4ml와 지질 농도 ml당 5mg을 얻습니다.

지질 소포 현탁액을 따뜻한 수조에 넣고 초음파 에이터 마이크로 팁을 사용하여 50% 듀티 사이클에서 1시간 동안 초음파 처리합니다. 수조는 지질 용액이 너무 뜨거워지는 것을 방지하고 수성 지질 용액의 온도를 이중층 상 이상으로 유지하는 역할을 합니다. 초음파 처리 중 전이 온도.

0.22 미크론 주사기 필터를 통해 SONICATED 용액을 여과하여 에이터 팁에서 이물질을 제거하고 여과 된 용액이 섭씨 37도에서 밤새 평형을 이루도록합니다. 초기 형광 풀림을 위해 샘플을 준비하려면 20 밀리몰 인산염 완충액에 10몰 요소의 스톡 용액과 20 밀리몰 인산염의 스톡 버퍼 용액을 만듭니다. 서면 프로토콜에 따라 요소 농도는 굴절계로 굴절률을 측정하고 알려진 값과 비교하여 실험적으로 결정해야 합니다.

다음으로, 8 몰 요소, 20 밀리몰 인산염 완충액에 약 200 마이크로몰 단백질 농도로 풀린 단백질의 원액을 준비합니다. 이 비디오에서는 막 단백질 OPA A를 사용하여 형광 연구를 위한 프로토콜 샘플이 적절한 부피의 스톡 단백질 지질 용액 스톡 10 몰 요소 용액과 스톡 인산염 버퍼를 결합하여 약 4개의 마이크로몰 단백질, 밀리리터당 1밀리그램 및 0-8개의 몰 요소를 포함하는 샘플을 1몰 단위로 만들어 총 부피 200마이크로리터를 생성합니다. 블랭크 샘플도 같은 방식으로 만들어집니다.

그러나 4마이크로리터의 8몰 요소 용액이 단백질을 대체합니다. 이러한 블랭크는 단백질의 형광 스펙트럼에 나타나는 산란 및 배경 신호를 빼기 위해 만들어집니다. 단백질 샘플을 형광 스펙트럼을 측정하기 전에 최소 2시간 동안 섭씨 37도의 블랭크에서 배양합니다.

완전히 접히도록 하려면 측정 1시간 전에 형광계를 켜십시오. 멤브레인 단백질은 일반적으로 온도가 이중층 상전이 온도보다 높을 때만 합성 지질로 접힙니다. 따라서 DMPC의 경우 형광계의 시료 홀더 온도를 섭씨 30도로 설정합니다.

정상 상태 형광계에서 형광 실험을 설정하고 블랭크에서 각 샘플의 트립토판 형광을 측정합니다. 여기 파장은 티로신 잔류물의 여기와 305에서 500나노미터에서 수집된 방출을 피하기 위해 290나노미터로 설정해야 합니다. 3나노미터의 입구 및 출구 대역 패스를 사용합니다.

파장 증가 및 통합 시간은 신호 대 잡음비에 맞게 최적화할 수 있습니다. 파장 증가 및 통합 시간의 일반적인 값은 각각 단계당 1나노미터 및 단계당 0.5초입니다. 시료 200마이크로리터를 마이크로 부피에 피펫으로 주입하고, 160마이크로리터 용량의 실리카 Q Vet을 융합하고, qve를 기계의 qve 홀더에 넣습니다.

마지막으로, 형광 측정은 형광 스펙트럼의 XY 데이터 시트를 Igor Pro, MATLAB Origin 또는 Excel과 같은 소프트웨어에 로드하기 시작할 수 있습니다. 이 시연을 위해 Igor Pro를 사용하여 요소 및 지질 소포 배경을 제거하고, 블랭크 샘플의 형광 스펙트럼에 S 스케일러를 곱하고, 단백질 지질 용액의 원시 형광 스펙트럼에서 이를 뺍니다. 해당 요소 농도에서 보정된 스펙트럼에서 최대 형광 또는 lambda max의 파장을 표로 만듭니다.

각 요소 농도에 대해. 완전히 풀린 막 단백질의 일반적인 값은 350나노미터입니다. 접힌 단백질의 분자 밀도는 약 330나노미터이지만, lambda max 값의 범위를 lambda max 값과 unfolded population의 fraction of unfolded population의 상관 관계를 나타내는 0 대 1 사이의 범위로 변환하여 표로 된 파장을 fraction unfolded로 변환합니다.

그런 다음 요소 농도에 대한 풀린 단백질의 분율을 플로팅합니다. 풀린 분획 F 대 요소 농도 C의 플롯은 단백질이 접힘 또는 풀림 상태로 존재할 수 있다고 가정하는 방정식에 적합할 수 있습니다. 계수 M은 변성 및 농도에 대한 자유 에너지의 변화율에 해당하고, CM은 접힌 모집단이 펼쳐진 모집단과 동일한 중간점 요소 농도에 해당합니다.

R은 기체 법칙 상수이고 T는 온도입니다. 켈빈에서. 피팅 절차는 계수 m과 cm에 대한 값을 산출합니다.

이러한 계수를 곱하여 델타 G, 즉 요소가 없을 때 펼쳐지는 Gibbs 자유 에너지를 결정합니다. 설명된 풀림 곡선은 람다 최대에서 가장 큰 변화를 일으키는 요소 농도의 범위를 나타냅니다. 이 범위는 일반적으로 작으며 대부분의 풀림은 풀림의 자유 에너지를 정확하게 결정하기 위해 이 작은 범위 내에서 발생합니다.

이 영역에서 추가 샘플을 분석하여 최적화된 임대 제곱 피팅에 필요한 많은 데이터 포인트가 포함된 플롯을 얻어야 합니다. 예를 들어, 단백질이 2몰에서 4몰 사이로 풀리는 경우 이러한 요소 농도 사이에 0.2몰 단위로 샘플을 만들어 풀림 곡선에서 이 중요한 영역의 모양을 보다 정확하게 나타낼 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 최소 0.5 어금니 단계와 0.2 moer 단계마다 블랭크를 포함해야 합니다.

이 플롯에서 얻은 풀림의 자유 에너지는 원래 풀림 곡선에서 얻은 것과 약간 다를 수 있지만 표시된 더 정확한 값을 반영합니다. 다음은 단일 트립토판 잔기를 포함하는 대표적인 막 단백질 om a의 트립토판 형광 스펙트럼입니다. 블랭크의 원시 형광 스펙트럼은 프로토콜에 설명된 대로 단백질의 원시 형광 스펙트럼에서 차감되어 보정된 스펙트럼을 생성합니다.

수많은 요소 농도에 대한 막 단백질의 보정된 트립토판 형광 스펙트럼은 설명된 방법에서 여기에 나와 있습니다. 이 시연에서는 단백질이 접히거나 풀리고 안정적인 상태가 없다는 가정 하에 풀림 곡선이 생성되었습니다. 파라미터 M은 풀림 시 용매에 노출되는 폴리펩타이드의 양을 반영하는 반면, CM은 접힌 개체군과 풀린 개체군의 동일한 개체군을 달성하는 데 필요한 변성 및 농도를 설명하는 중요한 값입니다.

CM과 M의 값이 크면 단백질이 안정적임을 나타냅니다. 풀림의 Gibbs 자유 에너지는 이 절차에 따라 OPA a에 대해 몰당 6.2kg 칼로리로 계산되었습니다. 열, pH 및 기타 화학 물질 Dena와 같은 다른 풀림 방법을 사용하여 단백질 접힘의 열역학에 대한 유사한 정보를 제공할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 접힌 상태와 펴진 상태의 다양한 형광 특성을 기반으로 단백질의 안정성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또는 선택한 분석 도구에 관계없이 방법이 단백질 확인에 대해 보고하는 한 원형, 희미한 것과 같은 다른 방법을 사용하여 풀림 곡선을 생성할 수도 있습니다. 곡선을 펼치는 방법은 다재다능하며 광범위한 멤브레인 및 용해성 단백질에 적용할 수 있습니다.