Name: Immunocytochemistry : 인간 신경 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 41 s
Description: 학습하세요 인간 신경 전구 세포에서 면역세포화학법을 활용한 항원 국소화 분석 방법을. 최적화된 프로토콜로 항체 사용 효율을 높이고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.

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저자는 어린이 병원 parafilm의 얼룩 기술의 초기 교육에 대해 에모리 대학에서 hNSPC 문화와 박사 게리 Bassell를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.

1 일 : 독일어 유리 Coverslips 준비 및 심는 세포 참고 : 독일어 유리 coverslips 자주 culturing 주요 신경 줄기 세포 뉴런에 바람직합니다. 우리는 세포 접착 및 확산을 개선하기 위해 다음과 같은 청소 프로토콜을 사용합니다. coverslip 양쪽에 액체 액세스를 허용하는 작은 랙에 위치 coverslips. 첫째, 10 분 1 % Liquinox에서 품어의 coverslips는 탈이온수 3 씻는다 다음. 어떤 비누 거품이 남아도는지 확인합니다. 다음, 30 분 1M HCL에 품어 전표는 탈이온수 3 씻는다 다음. 65 드라이 coverslips ° C 하룻밤. 유리 접시와 소독을 압력솥에 coverslips을 전송. <ol><li> 조직 문화 후드에서 적절하게 크기 잘 플레이트에 살균 coverslips를 배치합니다. </li><li> 세포 유착에 대한 laminin과 외투 coverslips. 10 μg / 실온에서 5 분간 살균 물에 ML 폴리 D - 라이신 (PDL)의 부화의 coverslips. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 하루 4 시간 또는 EMEM 20 μg / ML의 laminin의 PDL과 부화 coverslips를 제거합니다. <ol><li> 참고 : Passaging 인간 신경 줄기 세포 문서 (참조 <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) 및 계산 인간 신경 줄기 세포 문서 ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / 색인 / Details.stp? ID = 262</a> hNSPCs을 resuspend하고 계산하는 방법을 알아보려면). </li></ol></li><li> 각 coverslip 함유 특정 밀도 (우리는 종종 우리가 immunostaining에 대한 도금하는 세포에 대한 세포 100,000-300,000 / ML의 초기 도금 밀도를 사용)에서 잘으로 PBS 및 종자 세포와 laminin - 코팅 coverslips 린스. </li><li> 37 플레이스 플레이트는 세포가 coverslips (보통 필요 4 시간 최소)을 준수 ° C 조직 문화와 보육을 허용합니다. </li></ol> 일 2 : 고정, Permeabilizing, 차단하고, 세포 차 항체를 추가 참고 : 우리는 세포 형태를 유지하기 위해 다음과 같은 4 % paraformaldehyde의 정착액을 사용합니다. 조리법은 paraformaldehyde이 솔루션으로 갈 수 있도록하는 산도의 변화를 포함합니다. 높은 기온이 형광을 사용하면 배경 얼룩을 높일 수 산성 개미의 생성으로 이어질 수 있기 때문에 우리는이 방법보다는 paraformaldehyde를 해산하기 위해 열을의 사용을 선호합니다. 다른 전반적인 형태 (자당)을 유지하는 데 도움이 동안 정착액 도움의 일부 구성 요소, cytoskeletal 구조 (MgCl 2 EGTA)를 보존합니다. 전지 4 % Paraformaldehyde의 정착액 <table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 시약 및 단계 </td><td> 정착액 100 ML에 대한 금액 : </td></tr><tr><td> MilliQ 물 </td><td> 75 ML </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (펌 후드에서 달다) </td><td> 4g </td></tr><tr><td> 10N NaOH는 저어 및 솔루션이 나올 때까지 dropwise 추가 </td><td> 필요에 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0.5 ML </td></tr><tr><td> 0.5 M EGTA </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 4g </td></tr><tr><td> 6N HCL, pH를 7.4로 적정하다 </td><td> 필요에 </td></tr><tr><td> MilliQ 물 </td><td> 100 ML 가져다 </td></tr><tr><td colspan="2"> 최대 1 주일 4 ° C에 보관하십시오. 37 따뜻한 ° C 사용하기 전에 </td></tr></tbody></table><ol><li> 벤치에서 미디어를 제거하고 prewarmed 정착액을 추가합니다. 5-15분 (감지하는 항원에 따라, 우리가 일반적으로 10 분 사용)을 품어. 이것을 실온에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 많은 기관들이 유해 폐기물로 paraformaldehyde를 처리 등 적절한 용기에 정착액 폐기하십시오. PBS로 세포를 3 번​​, 5 분 때마다 씻으십시오. 세포에서 솔루션을 제거하는 경우, 흡입은 세포를 건조하게 만들지 않는 것을주의하십시오. 또한, 항상 외투 그들은 너무 세포가 건조 왼쪽으로하지 않는 솔루션을 제거하기 전에 세포에 추가 반면에 다음 해결책을 가지고 있습니다. </li><li> 관심의 항원은 세포 내부, 세포막은 항체의 진입을 허용 투과하여야하는 경우. 세포를 permeabilize하기 위해 PBS에 신선한 0.3 % 트리톤 X - 100 용액을 사용하십시오. 피펫 천천히 Triton은 점성이며, 세제가 완전히 세포에 추가하기 전에 PBS에 용해되어 있는지 확인 때문입니다. PBS 5 분마다있는 세포에게 3 번 씻는 다음 5 분 세포를 Permeabilize. </li><li> 세포는 항체가 아닌 특정 바인딩을 방지하기 위해 차단 에이전트로 치료해야합니다. 우리는 차단 요원으로 (BSA) 소 혈청 알부민을 사용합니다. (이것은 용해 시간이 걸립니다 때문에 락커 또는 회전)를 차단 솔루션 PBS로 5 % BSA를 용해 만든 후 솔 필터링0.45 μm의 주사기 필터로 ution. 실온에서 1 시간 5% BSA / PBS 용액에 세포를 차단합니다. </li></ol> 1 % 안에 미리 정해진 농도 기본 항체를 (관심의 단백질에 대한 구체적인 희망되는) 희석 BSA / PBS (5 % BSA / PBS에서 희석하여 준비). 장소 parafilm 덮여 유리 접시에 기본 항체를 (25mm의 coverslip 30 μl, 18mm의 coverslip 당 20 μl, 12mm의 coverslip 당 15 μl) 희석. 세포가 다운 얼굴, 그리고 세포가 항체에 접촉되도록 항체 솔루션을 통해 그것을하다​​ 이러한 반전, 고정 세포로 coverslip을 선택하십시오. 전체 구조를 통해 두 번째 parafilm 스트립를 놓습니다. 4 ° C 하룻밤에 품어. 3 일 : 세탁, 보조 항체 보육, 원자력 스테인 및 장착 <ol><li> 조심스럽게 세포가 직면 있도록 최고 parafilm 스트립을 제거하고 coverslip을 받아 그것을 반전하고, 세척 각 우물에 PBS와 함께 접시에 돌려 놓으십시오. </li><li> PBS로 세포를 3 번​​, 5 분 때마다 씻으십시오. </li><li> , 기본 항체를 검출하는 기본 항체가 토끼로 만들어진 경우 예를 들어, 보조 항체는 토끼 IgG를 인식해야 보조 항체를 선택합니다. 또한 (IgG, IgM 등) 항체 isotype에 맞게 처리해. 여러 차 항체를 사용하는 경우, 그들은 서로 다른 종 또는 isotypes에서, 그리고 보조 항체에 연결된 다른 마커와 감지하는 계획을 확인하십시오. 예를 들어, 녹색 형광단에 방지 마우스 이차 결합과 빨간색 형광단에 방지 토끼 보조 결합을 사용할 수 있습니다. 기본과 동일한 기술을 사용하여 상온에서 어둠 속에서 2 시간 동안 1 % BSA에 적절한 농도로 희석 보조 항체 용액에 세포를 품어 (동영상에 표시되지 단계). 보조가 글리세롤 솔루션 (25mm의 coverslip 40 μl, 18mm의 coverslip 30 μl, 12mm의 coverslip 당 25 μl)으로 저장되는 경우 부화에 필요한 보조 항체의 볼륨 차 항체에 대한보다 약간 클 수 있습니다 . <ul><li> 참고 : 보조 항체를 시각화하는 형광 분자를 사용하는 경우 예제는 보조 항체가 추가되었습니다 일단 빛으로부터 보호되어야합니다. 어둠 속에서, 또는 호일 커버 플레이트에 품어. </li></ul></li><li> 조심스럽게로 기본 항체에 대한 설명 parafilm에서 coverslips를 제거합니다. 세포에게 2 μg / ML Hoechst 핵 PBS에 희석 얼룩 (핵 counterstain 선호하는 경우)에서 1 분 부화 다음 PBS로 2 회, 각 시간 5 분, 씻으십시오. 얼룩 Hoechst 오래된이고 신호가 너무 희미있다면, 배양 시간 및 / 또는 농도를 증가시킬 수 있습니다. Hoechst와 부화 후 5 분 PBS로 1 회 씻는다. </li><li> coverslips는 현미경의 시각화를위한 설치 미디어와 슬라이드에 장착해야합니다. 형광 분자가 이차 항체의 시각화에 사용되는 경우에는 설치 미디어가 photobleaching 최소화하기 위해 에이전트를 포함해야합니다. 우리는 형광에 대한 설치 매체로 Vectashield를 사용합니다. 현미경 슬라이드 (25mm의 coverslip 당 12 μl, 18mm의 coverslip 당 6 μl, 12mm의 coverslip 당 3 μl)에 Vectashield의 ​​적절한 크기 드롭를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 coverslip을 선택하고 소금을 (PBS에서) 제거 탈이온수로 다시 씻어. kimwipe이나 종이 타월에 과도한 물에서 DAB하고 아래로 향하게 전지 Vectashield의 ​​드롭에 누워. 각도에 coverslip을 놓고 트래핑 기포를 피하기 위해 천천히 내려 수 있습니다. 날짜 및 샘플 정보로 슬라이드를 라벨. </li><li> coverslips와 슬라이드 coverslip 가장자리 주변에서 (어둠)을 초과하는 Vectashield에서 다음 흡입을 건조하도록 허용합니다. 원하는 경우 coverslip의 가장자리는 현재 (coverslips가 거꾸로 현미경에서 볼 수있는 경우 특히 유용합니다), 매니큐어와 봉인 수 있습니다. 우리는 일반적으로 -20 ° C의 냉장고에있는 슬라이드를 저장합니다. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A%2C+the+Arp2%2F3+complex%2C+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li>
<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
</ol>

이 프로토콜은 필요한 항체의 볼륨을 최소화하고 안정적​​인 세포 얼룩을 제공 hNSPCs위한 immunostaining 절차를 설명합니다. 설명된 절차는 세포내 항원 최선이지만, 세포 표면 분자를 얼룩이나 cytoskeleton의 얼룩을 향상시키기 위해 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>독일제 유리(Deutsche Spiegelglas) 커버슬립</td><td>도구</td><td>Carolina Biological</td><td>WW-63-3029</td><td>12, 15, 18, 22, 25 mm 커버슬립 사용 가능</td></tr><tr><td>Liquinox 무인산 세제</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273279</td><td>매우 점성이 높음</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, natural mouse</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>표시된 카탈로그 번호로 Fisher에서 공급</td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>매우 점성이 높음</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>잠재적 발암 물질이므로 분말 및 용액 형태 사용 시 주의 필요</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, IgG-free</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>시약</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>점성이 있음</td></tr></tbody></table>

immunocytochemistry : 인간 신경 줄기 세포

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry은 존재를 결정하는 매우 강력하고 매우 간단 방법, subcellular 지방화, 그리고 가장 일반적으로 흥미, 교양 세포에있는 단백질의 항원의 상대적인 풍부합니다. 이 프로토콜은 선물 쉬운 따라 자신의 얼룩 밖으로 고품질 재현할 질적 및 양적 데이터를 가져오는 동안 연구자 기본 및 보조 항체를 보존하기 위해 사용됩니다 단계 시리즈. 얼룩에 필요한 항체의 볼륨을 보존하는 데 도움이 프로토콜의 두 측면이 있습니다. 하나의 세포는 조직 문화 판의 우물에 배치됩니다 작은 원형 coverslips에 성장하고 있습니다. 고정 후 coverslips에있는 세포는 접시의 우물에서 제거할 수 있습니다. 항체 얼룩 경우, 세포와 coverslip은 parafilm에 대한 항체 솔루션의 작은 방울로 반전하고 건조 방지하기 위해 parafilm의 두 번째 조각으로 덮여있다. 이 방법을 사용하여 항체 솔루션만이 ~ 25 μl가 물들다 각 coverslip (또는 샘플) 필요합니다. 이 프로토콜은 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)의 immunostaining 설명하지만, 많은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

Immunocytochemistry은 존재, subcellular 지방화 및 교양 세포에 대한 관심의 항원의 상대적인 풍부를 결정하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 선물 쉬운 따라 하나가 항체를 절약 하나의 얼룩을 최대한 활용 수있게 단계 시리즈.

Immunocytochemistry : 인간 신경 줄기 세포

면역세포화학법은 ...의 존재 여부, 세포 내 국소화 및 상대적 풍부도를 결정하는 데 매우 강력하고 상당히 간단한 방법입니다.

안녕하세요, 저는 스티브입니다. 저는 Irvine에 있는 uc의 병리학과에 있는 Flanagan 박사의 실험실에서 일하고 있습니다. 그리고 오늘은 인간 신경 전구 세포의 면역 화학을 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다.이 프로토콜에는 코팅된 커버 슬립에 세포를 놓고 하룻밤 동안 1차 항체의 세포를 차단하고 배양한 다음 여러 가지 작업을 수행하고 2차 항체를 실온에서 적용하는 것이 포함됩니다. 마지막으로 덮개를 장착하면 현미경 비행에 미끄러집니다. 시작하자.그래서 먼저 12mm 너비의 멸균 독일 유리 커버 슬립 3개를 24웰 플레이트에 배치하여 라미네이트로 코팅할 것입니다. 이제 플레이트에 커버 슬립이 있고 먼저 PDL 폴리 라이신 용액을 추가하고 실온에서 5분 동안 PDL에서 커버 서브를 배양할 것입니다. 이제 5분이 지나면 PDL을 제거하고 라미닌을 바르고 라미네이트에서 커버 슬립을 최소 4시간 또는 그 이상 밤새 배양할 것입니다.그래서 저는 라미네이트에서 밤새 플레이트를 배양했고, 이제 PBS로 커버 슬립을 헹구고 이미 계수한 인간 신경 전구 세포를 플레이트화할 것입니다. 그래서 방금 라미네이트 용액을 제거했고 이제 PBS로 커버 슬립을 제어하겠습니다. 이제 PBS를 제거하고 미디어 솔루션을 씌울 것입니다.드디어 세포를 볼 준비가 되었습니다. 그래서 저는 밀당 10만 개의 세포를 보게 될 것인데, 이는 24개의 웰 플레이트에 대해 웰당 50, 000개의 셀을 추가한다는 것을 의미합니다. 그래서 플레이트를 좌우로 기울여 셀이 커버 슬립 표면에 고르게 퍼져 있는지 확인하겠습니다.그리고 이제 저는 적어도 24시간 동안 인큐베이터에 넣어 면역화학을 위해 정착시키고 퍼뜨릴 것입니다. 세포는 24시간 동안 계속 자라고 있었고 저는 그것들을 보았고 그것들은 붙어 있었고 잘 퍼져 있었습니다. 이제 5 분 동안 4 % perfor 높이로 수정하겠습니다.하지만 먼저 매체를 제거하고 세포가 마르지 않도록 할 것입니다. 그래서 미디어를 제거하고 동시에 고정제를 추가하겠습니다. 그래서 이것을 양손 기술이라고 합니다.이제 실온에서 5분 동안 고정액으로 세포를 배양할 것입니다. 5분이 지났네요. PFA를 제거하여 PFA 폐기물 용기에 넣고 PBS를 추가하는 동시에 PFA를 제거하여 세포가 건조되지 않도록 할 것입니다.이 플라스틱 흡입 피펫 중 하나를 사용하여 PFA를 끌어올리고 타이머를 5분으로 설정하겠습니다. 그래서 제 세포가 PBS 세척 상태에 있는 동안 Triton X 100을 사용하여 perme 시각화 솔루션을 준비할 것입니다. 그것은 비이온성 세제이며 매우 점성이 있습니다.따라서 모든 용액이 파이펫에 들어갈 때까지 기다리는 것이 중요합니다. 그래서 저는 PBS에서 0.3% 용액을 준비하고 10mils의 PBS를 추가할 것입니다. 그리고 이 10mil의 PBS에 30마이크로리터의 tri next 100을 추가할 것입니다.그래서 저는 30마이크로리터의 트라이를 추가하고 그 다음에는 100에서 10mils의 PBS를 추가할 것입니다. 그래서 모든 솔루션이 팁에 들어갈 수 있도록 약 10 초를 추가 할 것입니다. 그래서 저는, 여기에 저의 perme 활용 솔루션이 있습니다.나는 그것을 10 분 동안 회전기에 올려 놓은 다음 점성이 있는 트릿톤이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 소용돌이칩니다. 이제 perme 시각화 단계를 수행 할 준비가되었습니다. 그래서 저는 실온에서 5분 동안 현명하게 할 것입니다.5분이 지났네요. 이제 트리톤을 모두 씻어내기 위해 5분 PBS 세척을 세 번 할 것입니다. 다시 한 번, 시계를 5분으로 설정하겠습니다.그래서 저는 방금 모든 세척 단계를 완료했기 때문에 차단 단계를 수행할 준비가 되었습니다. 그래서 차단 단계를 위해 PBS에서 5% BSA 솔루션을 준비했습니다. 그리고 모든 세척과 마찬가지로 PBS를 제거하고 동시에 차단 솔루션을 추가하겠습니다.그리고 차단 단계는 실온에서 1시간 동안 진행됩니다. 그래서 제 세포가 차단되는 동안 1차 항체 배양을 위해 플레이트를 준비할 것입니다. 이 유리판으로 시작해서 이 정도 크기의 파라 필름 조각을 잘라보겠습니다.제가 할 일은 그걸 감쌀 거고, 테이프가 좀 필요해서, 테이프 네 개가 필요하니까요. 그래서 저는 그것들을 모두 준비할 것입니다. 그래서 저는 이 파라 필름 조각을 가져다가 표면이 멋지고 매끄럽게 되도록 곧게 펴겠습니다.그런 다음 양쪽 끝을 가져다가 유리판 뒷면에 테이프로 붙일 것입니다. 이제 다른 쪽 끝을 당겨 표면이 똑바로 펴지도록 하고 다른 쪽 끝을 뒤쪽에 테이프로 붙일 것입니다. 이제 첫 번째 필름과 같은 크기의 다른 쌍 필름이 필요합니다.그리고 기본적으로 저는 같은 일을 할 것입니다. 그래서 저는 첫 번째 필름 위에 두 번째 파라 필름을 테이프로 붙였는데, 첫 번째 필름과 마찬가지로 두 번째 퍼필 필름의 한쪽 끝을 풀어 놓은 것을 제외하고는 항체 용액을 놓고 첫 번째 조각에 파워 슬립을 할 것이기 때문입니다. 그런 다음 샌드위치를 만드는 두 번째 조각을 그 위에 놓을 것입니다.하지만 지금 당장은, 저는 항체 용액을 넣고 덮을 곳에 라벨을 붙일 것입니다. 자, 세포는 이제 한 시간 동안 차단 용액에 있었고 이제 하룻밤 배양을 위해 1차 항체의 방울에 커버 슬립을 끼울 것입니다. 그래서 저는 35마이크로리터의 1차 항체를 한 방울 떨어뜨리고, 거품이 생기고 거품이 항체와 항원의 결합을 방해할 수 있기 때문에 모든 액체를 배출하지 않도록 매우 조심할 것입니다.그래서 저는 1차 항체 세 방울 모두에 거품이 생기는 것을 피하려고 노력하고, 이 방울 위에 세포로 슬립을 덮을 준비가 되었습니다. 이제 제가 할 일은 커버 슬립을 집어드는 것입니다. 먼저 커버 슬립을 옆으로 옮기고 핀셋을 연 상태에서 부드럽게 들어 올려 보겠습니다.커버 슬립을 잡은 것 같으면 핀셋을 천천히 닫고 우물에서 커버 슬립을 부드럽게 들어 올릴 것입니다. 그래서 지금 셀은 커버 슬립 위에 있습니다. 그래서 제가 할 일은 반전시키고 뒤집어서 방울을 부드럽게 만지고 거품을 만들지 않고 방울 위에 천천히 놓는 것입니다.그래서 저는 두 번째와 세 번째 커버 슬립에 대해서도 같은 절차를 반복할 것입니다. 마지막 단계는 두 번째 파라 필름을 맨 위에 놓는 것입니다. 그리고 제가 할 방법은 그렇게 한 번의 동작으로 그것을 내려놓는 것입니다.좌우로 움직이지 않고 움직이고 싶습니다. 그리고 마지막으로 다른 테이프로 접시 바닥에 고정할 것입니다. 그리고 마침내 세포는 하룻밤 동안 4도에서 배양할 준비가 되었으며 이것이 면역화학의 첫째 날을 끝냅니다.오늘은 면역 화학의 2일차이며, 저는 PB S3의 커버 슬립을 5분 동안 세척할 것입니다. 그런 다음 실온에서 2시간 동안 2차 항체를 배양할 것입니다. 먼저 커버 슬립을 제거할 수 있도록 파라 필름을 그렇게 절단합니다.그리고 파라 필름의 상단 부분을 천천히 들어 올려 커버 슬립이 케어 파라 필름의 하단 부분에 남아 있도록 할 것입니다. 그래서 첫 번째 조각을 제거하고 PBS 세척 용액이 담긴 플레이트가 준비되었습니다. 그래서 저는 각 뚜껑 수프를 들어올려 우물에 넣어 항원결정기에 부착되지 않은 남아있는 1차 항체를 씻어낼 것입니다.그래서 커버 슬립을 들어 올리려면 먼저 면도날로 그렇게 잡고 부드럽게 집어 올리려고 합니다. 그리고 세포가 항체 용액을 마주하고 있기 때문에 세포를 뒤집어서 지금 맨 위에 있도록 하고 웰 안으로 밀어 넣어 맨 위에 여전히 남아 있도록 할 것입니다. 그리고 남은 파워 슬립에 대해 절차를 반복하겠습니다.그래서 5분 동안 씻을 것입니다. 5분이 지났네요. PBS 솔루션을 교체하려고 합니다.후크 다이를 추가하겠습니다. 이제 5분 동안 배양할 것입니다. 그래서 후크 배화가 완료되었으며 이제 커버 sos를 장착하고 볼 준비가되었습니다.그래서 먼저 형광 다임이 표백되는 것을 방지하는 데 도움이 되는 쿼드 벡터 쉴드를 alk 할 것입니다. 먼저 슬라이드에 커버 슬립의 수로 레이블을 지정한 다음 10마이크로리터의 벡터 쉴드를 배치할 것입니다. Vector Shield는 오일이며 정말 점성이 있기 때문에 팁에 모든 것이 들어갈 때까지 조금 기다리는 것도 중요합니다.그래서 저는 현미경 슬라이드에 벡터 쉴드를 놓았고, 이제 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 끼울 준비가 되었습니다. 그래서 제가 가장 먼저 할 일은 커버 슬립을 집어 들고 커버 슬립의 뒷면을 탈이온수로 헹구는 것인데, 그렇지 않으면 건조될 때 PBS에 있던 소금이 결정화되어 형광 다이의 광학적 특성을 방해할 것이기 때문입니다. 그래서 저는 탈이온수를 준비하겠습니다.그래서 저는 커버 슬립을 집어 들고 그 뒷면을 탈이온수로 헹굴 것입니다. 그런 다음 주석 닦음을 만져 말리겠습니다. 그런 다음 다시 반전시켜 세포 쪽이 반전되어 현미경 슬라이드 위로 내려가도록 합니다.그리고 이전과 마찬가지로 벡터 쉴드의 드롭을 만지고 거품을 가두지 않고 천천히 내릴 것입니다. 그리고 저는 모든 화물 플립에 대해 동일한 절차를 반복할 것입니다. 이제 살펴 보겠습니다.이것은 면역 화학을 수행하고 사진을 얻고 오버레이를 만드는 등의 작업을 수행한 후 얻을 수 있는 것의 예입니다. 이 이미지에서, 이것은, 이것은 출생 후 쥐의 음흉개에서 분리된 해마 신경 줄기세포의 이미지입니다. 오늘은 인간 신경 전구 세포의 면역 화학을 수행하는 방법을 보여 드렸습니다.그리고 눈치채셨다면, 이 기술을 사용하면 팽창성 항체 시약을 저장할 수 있습니다. 우리는 퍼필에 작은 방울을 떨어뜨리고 그 위에 세포가 있는 커버 슬립을 반전시켜 매우 적은 양의 1차 및 2차 항체를 사용했습니다. 그러니 계속해서, 면역요법 화학을 하고, 저를 지켜봐 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 - 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.

자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석

이 비디오 프로토콜은 신경 식민지 - 형성 세포 분석을 사용하여 신경 전구체 세포의 혼합 인구의 타고난 신경 줄기 세포를 차별하고 열거하는 방법을 보여줍니다.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

이 동영상은 EdU incorpion을 사용하여 뇌 조직 절편에서 새로 증식한 신경 줄기 세포를 염색한 다음 면역 형광을 통해 특정 단백질을 시각화하여 세포 역학 및 증식에 대한 이해를 높이는 절차를 보여줍니다.

마우스 뇌 절편에서 증식된 신경 줄기세포를 시각화하기 위한 면역형광 염색

출처: Becker-Kojić, Z. A., et. al., 혈액 유래 신경 세포의 GM 프리 생성. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 형광 현미경 검사를 위해 재프로그래밍된 말초 혈액 세포에서 유래한 신경 세포를 준비하는 프로토콜을 보여주며, 면역 형광 이미징을 통해 뚜렷한 세포 유형과 발달 단계를 보여줍니다.

말초 혈액 유래 세포와 분화된 신경 세포의 면역형광 현미경 검사 

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

신경 세포 유형에서 표면 항원 및/또는 세포 내 항원의 유세포 분석을 위한 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 신경생물학자가 이 강력한 기술을 활용할 수 있도록 실험 계획의 중요한 측면, 단계별 방법론적 절차 및 유세포 분석의 기본 원리를 설명합니다.

신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 세 가지 신경 계통으로 분화 할 수 세포를 참조하십시오. 여기서는 클론 조건 neurosphere 형성 및 분화를 이용하여 주어진 세포 집단에서 NSC 주파수를 결정하는 프로토콜을 기술한다.

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

이 프로토콜은 i) 컨포칼 현미경, ii) 강도 이미징을 수행하기 위한 형광 활성화 세포 분류기 또는 iii) 형광 수명 이미징을 수행하기 위한 다광자 현미경을 사용하여 자가형광 이미징을 통해 1차 성체 마우스 신경 줄기 세포 배양에서 세포 상태를 식별하고 강화하는 전략을 설명합니다.

자가형광을 이용한 Neural Stem Cell Activation State In Vitro 분류

학습하세요 인간 신경 전구 세포에서 면역세포화학법을 활용한 항원 국소화 분석 방법을. 최적화된 프로토콜로 항체 사용 효율을 높이고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.

Immunocytochemistry : 인간 신경 줄기 세포

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