Immunocytochemistry : 인간 신경 줄기 세포

안녕하세요, 저는 스티브입니다. 저는 Irvine에 있는 uc의 병리학과에 있는 Flanagan 박사의 실험실에서 일하고 있습니다. 그리고 오늘은 인간 신경 전구 세포의 면역 화학을 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다.

이 프로토콜에는 코팅된 커버 슬립에 세포를 놓고 하룻밤 동안 1차 항체의 세포를 차단하고 배양한 다음 여러 가지 작업을 수행하고 2차 항체를 실온에서 적용하는 것이 포함됩니다. 마지막으로 덮개를 장착하면 현미경 비행에 미끄러집니다. 시작하자.

그래서 먼저 12mm 너비의 멸균 독일 유리 커버 슬립 3개를 24웰 플레이트에 배치하여 라미네이트로 코팅할 것입니다. 이제 플레이트에 커버 슬립이 있고 먼저 PDL 폴리 라이신 용액을 추가하고 실온에서 5분 동안 PDL에서 커버 서브를 배양할 것입니다. 이제 5분이 지나면 PDL을 제거하고 라미닌을 바르고 라미네이트에서 커버 슬립을 최소 4시간 또는 그 이상 밤새 배양할 것입니다.

그래서 저는 라미네이트에서 밤새 플레이트를 배양했고, 이제 PBS로 커버 슬립을 헹구고 이미 계수한 인간 신경 전구 세포를 플레이트화할 것입니다. 그래서 방금 라미네이트 용액을 제거했고 이제 PBS로 커버 슬립을 제어하겠습니다. 이제 PBS를 제거하고 미디어 솔루션을 씌울 것입니다.

드디어 세포를 볼 준비가 되었습니다. 그래서 저는 밀당 10만 개의 세포를 보게 될 것인데, 이는 24개의 웰 플레이트에 대해 웰당 50, 000개의 셀을 추가한다는 것을 의미합니다. 그래서 플레이트를 좌우로 기울여 셀이 커버 슬립 표면에 고르게 퍼져 있는지 확인하겠습니다.

그리고 이제 저는 적어도 24시간 동안 인큐베이터에 넣어 면역화학을 위해 정착시키고 퍼뜨릴 것입니다. 세포는 24시간 동안 계속 자라고 있었고 저는 그것들을 보았고 그것들은 붙어 있었고 잘 퍼져 있었습니다. 이제 5 분 동안 4 % perfor 높이로 수정하겠습니다.

하지만 먼저 매체를 제거하고 세포가 마르지 않도록 할 것입니다. 그래서 미디어를 제거하고 동시에 고정제를 추가하겠습니다. 그래서 이것을 양손 기술이라고 합니다.

이제 실온에서 5분 동안 고정액으로 세포를 배양할 것입니다. 5분이 지났네요. PFA를 제거하여 PFA 폐기물 용기에 넣고 PBS를 추가하는 동시에 PFA를 제거하여 세포가 건조되지 않도록 할 것입니다.

이 플라스틱 흡입 피펫 중 하나를 사용하여 PFA를 끌어올리고 타이머를 5분으로 설정하겠습니다. 그래서 제 세포가 PBS 세척 상태에 있는 동안 Triton X 100을 사용하여 perme 시각화 솔루션을 준비할 것입니다. 그것은 비이온성 세제이며 매우 점성이 있습니다.

따라서 모든 용액이 파이펫에 들어갈 때까지 기다리는 것이 중요합니다. 그래서 저는 PBS에서 0.3% 용액을 준비하고 10mils의 PBS를 추가할 것입니다. 그리고 이 10mil의 PBS에 30마이크로리터의 tri next 100을 추가할 것입니다.

그래서 저는 30마이크로리터의 트라이를 추가하고 그 다음에는 100에서 10mils의 PBS를 추가할 것입니다. 그래서 모든 솔루션이 팁에 들어갈 수 있도록 약 10 초를 추가 할 것입니다. 그래서 저는, 여기에 저의 perme 활용 솔루션이 있습니다.

나는 그것을 10 분 동안 회전기에 올려 놓은 다음 점성이 있는 트릿톤이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 소용돌이칩니다. 이제 perme 시각화 단계를 수행 할 준비가되었습니다. 그래서 저는 실온에서 5분 동안 현명하게 할 것입니다.

5분이 지났네요. 이제 트리톤을 모두 씻어내기 위해 5분 PBS 세척을 세 번 할 것입니다. 다시 한 번, 시계를 5분으로 설정하겠습니다.

그래서 저는 방금 모든 세척 단계를 완료했기 때문에 차단 단계를 수행할 준비가 되었습니다. 그래서 차단 단계를 위해 PBS에서 5% BSA 솔루션을 준비했습니다. 그리고 모든 세척과 마찬가지로 PBS를 제거하고 동시에 차단 솔루션을 추가하겠습니다.

그리고 차단 단계는 실온에서 1시간 동안 진행됩니다. 그래서 제 세포가 차단되는 동안 1차 항체 배양을 위해 플레이트를 준비할 것입니다. 이 유리판으로 시작해서 이 정도 크기의 파라 필름 조각을 잘라보겠습니다.

제가 할 일은 그걸 감쌀 거고, 테이프가 좀 필요해서, 테이프 네 개가 필요하니까요. 그래서 저는 그것들을 모두 준비할 것입니다. 그래서 저는 이 파라 필름 조각을 가져다가 표면이 멋지고 매끄럽게 되도록 곧게 펴겠습니다.

그런 다음 양쪽 끝을 가져다가 유리판 뒷면에 테이프로 붙일 것입니다. 이제 다른 쪽 끝을 당겨 표면이 똑바로 펴지도록 하고 다른 쪽 끝을 뒤쪽에 테이프로 붙일 것입니다. 이제 첫 번째 필름과 같은 크기의 다른 쌍 필름이 필요합니다.

그리고 기본적으로 저는 같은 일을 할 것입니다. 그래서 저는 첫 번째 필름 위에 두 번째 파라 필름을 테이프로 붙였는데, 첫 번째 필름과 마찬가지로 두 번째 퍼필 필름의 한쪽 끝을 풀어 놓은 것을 제외하고는 항체 용액을 놓고 첫 번째 조각에 파워 슬립을 할 것이기 때문입니다. 그런 다음 샌드위치를 만드는 두 번째 조각을 그 위에 놓을 것입니다.

하지만 지금 당장은, 저는 항체 용액을 넣고 덮을 곳에 라벨을 붙일 것입니다. 자, 세포는 이제 한 시간 동안 차단 용액에 있었고 이제 하룻밤 배양을 위해 1차 항체의 방울에 커버 슬립을 끼울 것입니다. 그래서 저는 35마이크로리터의 1차 항체를 한 방울 떨어뜨리고, 거품이 생기고 거품이 항체와 항원의 결합을 방해할 수 있기 때문에 모든 액체를 배출하지 않도록 매우 조심할 것입니다.

그래서 저는 1차 항체 세 방울 모두에 거품이 생기는 것을 피하려고 노력하고, 이 방울 위에 세포로 슬립을 덮을 준비가 되었습니다. 이제 제가 할 일은 커버 슬립을 집어드는 것입니다. 먼저 커버 슬립을 옆으로 옮기고 핀셋을 연 상태에서 부드럽게 들어 올려 보겠습니다.

커버 슬립을 잡은 것 같으면 핀셋을 천천히 닫고 우물에서 커버 슬립을 부드럽게 들어 올릴 것입니다. 그래서 지금 셀은 커버 슬립 위에 있습니다. 그래서 제가 할 일은 반전시키고 뒤집어서 방울을 부드럽게 만지고 거품을 만들지 않고 방울 위에 천천히 놓

그래서 저는 두 번째와 세 번째 커버 슬립에 대해서도 같은 절차를 반복할 것입니다. 마지막 단계는 두 번째 파라 필름을 맨 위에 놓는 것입니다. 그리고 제가 할 방법은 그렇게 한 번의 동작으로 그것을 내려놓는 것입니다.

좌우로 움직이지 않고 움직이고 싶습니다. 그리고 마지막으로 다른 테이프로 접시 바닥에 고정할 것입니다. 그리고 마침내 세포는 하룻밤 동안 4도에서 배양할 준비가 되었으며 이것이 면역화학의 첫째 날을 끝냅니다.

오늘은 면역 화학의 2일차이며, 저는 PB S3의 커버 슬립을 5분 동안 세척할 것입니다. 그런 다음 실온에서 2시간 동안 2차 항체를 배양할 것입니다. 먼저 커버 슬립을 제거할 수 있도록 파라 필름을 그렇게 절단합니다.

그리고 파라 필름의 상단 부분을 천천히 들어 올려 커버 슬립이 케어 파라 필름의 하단 부분에 남아 있도록 할 것입니다. 그래서 첫 번째 조각을 제거하고 PBS 세척 용액이 담긴 플레이트가 준비되었습니다. 그래서 저는 각 뚜껑 수프를 들어올려 우물에 넣어 항원결정기에 부착되지 않은 남아있는 1차 항체를 씻어낼 것입니다.

그래서 커버 슬립을 들어 올리려면 먼저 면도날로 그렇게 잡고 부드럽게 집어 올리려고 합니다. 그리고 세포가 항체 용액을 마주하고 있기 때문에 세포를 뒤집어서 지금 맨 위에 있도록 하고 웰 안으로 밀어 넣어 맨 위에 여전히 남아 있도록 할 것입니다. 그리고 남은 파워 슬립에 대해 절차를 반복하겠습니다.

그래서 5분 동안 씻을 것입니다. 5분이 지났네요. PBS 솔루션을 교체하려고 합니다.

후크 다이를 추가하겠습니다. 이제 5분 동안 배양할 것입니다. 그래서 후크 배화가 완료되었으며 이제 커버 sos를 장착하고 볼 준비가되었습니다.

그래서 먼저 형광 다임이 표백되는 것을 방지하는 데 도움이 되는 쿼드 벡터 쉴드를 alk 할 것입니다. 먼저 슬라이드에 커버 슬립의 수로 레이블을 지정한 다음 10마이크로리터의 벡터 쉴드를 배치할 것입니다. Vector Shield는 오일이며 정말 점성이 있기 때문에 팁에 모든 것이 들어갈 때까지 조금 기다리는 것도 중요합니다.

그래서 저는 현미경 슬라이드에 벡터 쉴드를 놓았고, 이제 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 끼울 준비가 되었습니다. 그래서 제가 가장 먼저 할 일은 커버 슬립을 집어 들고 커버 슬립의 뒷면을 탈이온수로 헹구는 것인데, 그렇지 않으면 건조될 때 PBS에 있던 소금이 결정화되어 형광 다이의 광학적 특성을 방해할 것이기 때문입니다. 그래서 저는 탈이온수를 준비하겠습니다.

그래서 저는 커버 슬립을 집어 들고 그 뒷면을 탈이온수로 헹굴 것입니다. 그런 다음 주석 닦음을 만져 말리겠습니다. 그런 다음 다시 반전시켜 세포 쪽이 반전되어 현미경 슬라이드 위로 내려가

그리고 이전과 마찬가지로 벡터 쉴드의 드롭을 만지고 거품을 가두지 않고 천천히 내릴 것입니다. 그리고 저는 모든 화물 플립에 대해 동일한 절차를 반복할 것입니다. 이제 살펴 보겠습니다.

이것은 면역 화학을 수행하고 사진을 얻고 오버레이를 만드는 등의 작업을 수행한 후 얻을 수 있는 것의 예입니다. 이 이미지에서, 이것은, 이것은 출생 후 쥐의 음흉개에서 분리된 해마 신경 줄기세포의 이미지입니다. 오늘은 인간 신경 전구 세포의 면역 화학을 수행하는 방법을 보여 드렸습니다.

그리고 눈치채셨다면, 이 기술을 사용하면 팽창성 항체 시약을 저장할 수 있습니다. 우리는 퍼필에 작은 방울을 떨어뜨리고 그 위에 세포가 있는 커버 슬립을 반전시켜 매우 적은 양의 1차 및 2차 항체를 사용했습니다. 그러니 계속해서, 면역요법 화학을 하고, 저를 지켜봐 주셔서 감사합니다.