β - glucuronidase (거스)을 기반으로 세포를 파괴 분석

이 절차의 전반적인 목표는 Gus 리포터 시스템을 사용하여 특정 유전자의 잠재적 사멸 특성을 분석하는 것입니다. 관심 유전자는 Gus cassette로 클로닝되고 35 s promoter 하에서 적절한 agrobacterium 벡터에서 성장합니다. 그런 다음 이러한 벡터를 Agrobacterium 균주 LBA 44 0 4로 형질전환하고 Gus 발현 카세트를 포함하는 배양액과 혼합하여 Nick Oceana Hamana 잎에 침투시킵니다.

거스 활성은 조직화학적 염색을 통해 시각적으로 평가하거나 Fluor metric mug assay를 통해 정량적으로 평가할 수 있습니다. DNA 래더링 또는 터널 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 포유류 시스템에서 일반적으로 사용되지만 식물에서 재현하기 어렵다는 점은, 가스 발현이 발생하기 위해 살아있는 세포가 필요하다는 단순한 사실을 활용하는 민감하고 신속한 식물 기반 일시적 분석이라는 것입니다. 오늘 절차를 시연하는 것은 Hua RAO가 될 것입니다.

우리 연구실의 박사 후 연구원은 섭씨 25도에서 자란 3주에서 6주 된 니코티아나 하마나 식물의 완전히 확장된 건강한 잎이 필요합니다. 이 프로토콜을 8일 동안 수행할 계획입니다. 1일차에 세포 사멸 분석을 위한 벡터를 포함하는 아그로박테리움 종양 fassan의 글리세롤 스톡과 함께 격자를 형성하고, Gus 발현 카세트가 있는 벡터도 여러 배양 조합을 테스트할 때 항상 빈 벡터를 음성 대조군 또는 스터퍼로 포함합니다.

접시를 섭씨 28도에서 이틀 동안 배양합니다. 3일째에는 각 플레이트에서 단일 콜로니로 2ml의 선택적 LB를 접종합니다. 최대 성장 밀도에 도달할 때까지 섭씨 28도에서 200RPM으로 24시간 동안 흔들어 각 배양물을 배양합니다.

배양 24시간 후 응집이 있는 경우 피펫팅으로 배양액을 완전히 재현탁하고, 새로운 선택적 LB로 각 배양액의 총 부피를 10ml로 증가시켜 아그로박테리움 독성 유전자를 유도합니다. 25마이크로몰에 아세톤을 첨가하고 각 배양물을 섭씨 28도에서 16시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 다음 단계는 4, 실온 및 Resus에서 10분 동안 000G에서 각 배양을 원심분리하고 10밀리리터의 침투 매체에 펠릿을 현탁시키는 것입니다.

아세톤을 첨가하지 말고 배양물을 다시 원심 분리하지만 지금 Resus를 사용하십시오. 100마이크로몰 아세톤을 함유한 5밀리리터의 침투 매체에 각 펠릿을 현탁시킵니다. 이제 600나노미터에서 OD를 측정합니다.

0.1 이하의 농도는 허용되지만 0.9보다 크면 침투 전에 침투, 매체 및 아세톤으로 0.9로 희석합니다. 배양 후 3시간 동안 흔들면서 섭씨 28도에서 배양물을 한 번 더 배양합니다. 실험 배양 및 대조군 배양을 Gus 카세트를 포함하는 배양물과 1:1 비율로 혼합합니다.

각 배양에 대해 1밀리리터의 바늘 없는 주사기를 사용하여 ABA 씰이나 새로 돋아난 잎의 아래쪽에 침투합니다. 침투량은 중요하지 않습니다. 물을 담글 수 있는 지역이 충분히 형성되면 음성 대조군과 유전자를 모두 침투시켜 같은 식물의 반대쪽 잎에 대한 분석을 한 다음 같은 방식으로 두 개의 식물에 더 침투시킵니다.

따라서 각 문화에는 세 가지 식물이 있습니다. 침투 후 3일이 지나면 잎을 채취하고 돌풍 단백질 발현을 분석해야 합니다. 잎이 완전히 젖을 때까지 xlu 기질로 전체 잎에 진공 침투하여 조직화학 분석을 시작합니다.

이제 밤새 실온에서 또는 파란색 염색이 뚜렷할 때 뚜렷한 파란색 염색이 나타날 때까지 어둠 속에서 잎을 배양합니다. 잎을 증류수로 헹구고 엽록소가 제거될 때까지 70% 에탄올로 밤새 배양합니다. 다음날, 잎과 증류수를 헹구고 GUS 발현 수준을 평가합니다.

Gus 발현을 정량화하기 위해 기판 머그를 형광 제품 mu로 변환하며, 이는 액체 질소를 사용하여 모르타르에서 침투된 잎 디스크를 분쇄하여 측정할 수 있습니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 유지하면서 100마이크로리터의 GUS 추출 버퍼를 추가합니다. 지금 14, 4 섭씨 온도에 5 분 당 000 GS에 현탁액을 분리기를 설치하고, Gus를 포함하는 총 녹는 단백질을 포함하는 상등액을 모으십시오.

NanoDrop을 사용하여 총 용해성 단백질 농도를 측정하고 Gus 추출 버퍼의 각 샘플에 대해 총 단백질 농도를 100마이크로그램으로 조정합니다. 이제 Gus 추출 버퍼의 머그 기판을 각 샘플에 최종 농도인 2밀리몰 머그잔으로 추가합니다. 샘플당 총 100마이크로리터의 부피는 피펫팅으로 충분히 혼합되어야 하며 섭씨 37도에서 한 시간 동안 반응을 배양해야 합니다.

한 시간 후 800마이크로리터의 돌풍 정지 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다. mu를 정량화하기 위해 각 샘플의 100마이크로리터를 마이크로타이터 플레이트에 로드하고, 플레이트 리더에서 분석하고, 365나노미터 여기에서 형광을 측정하고, 455나노미터 방출 파장을 측정하고, 표준 곡선과 비교하고, 거스 활성을 분당 총 용해성 단백질 반응의 마이크로그램당 M으로 보고할 수 있습니다. GUS 발현 카세트가 세포 사멸의 음성 조절자 또는 사멸 방지 유전자와 함께 침투할 때 사용되는 구조체에 따라 다양한 돌풍 수준이 검출됩니다.

이에 비해 높은 돌풍 수준이 관찰됩니다. 빈 벡터 컨트롤의 거스 수준은 훨씬 낮습니다. 반대로, 세포 사멸의 양성 조절인자 또는 사멸 촉진 유전자를 사용하는 경우, 빈 벡터 대조군에 비해 Gus 발현의 시장 감소가 관찰됩니다.

이 기술을 마스터하면 약 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 기술이 특정 유전자의 잠재력을 결정하기 위한 초기 단계로 사용된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 초기 결과를 확인하고 관련된 세포의 유형을 결정하기 위해 추가 작업을 수행해야 합니다.