Name: 신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 배우세요 바이오오르토고날 클릭 화학을 이용한 제브라피시 태아의 당단백질 라벨링 방법을. 이 기술은 생체 내 동적 영상화가 가능하여 당생물학 연구에 혁신적인 도구를 제공합니다.

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의학의 알버트 아인슈타인 대학에서 시작 자금,이 작품은 부분적으로 국민 건강의 연구소 (RDS에 3U54AI057158 - 06S1 PW로 GM093282)에 의해 지원되었다.

1. 에그 수집 및 Dechorionation <ol><li> 수집 및 35mm 페트리 접시에 zebrafish 달걀을 전송, 가능한 한 많은 물을으로 제거한 다음 E3 배아 매체 1 MG / ML Pronease 전자 (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2 · 2 시간 2 O, 0.33 MM MgSO을 추가 chorion을 소화하기 위해 4, 산도 = 7.4). </li><li> 3~5분 후, 생선 물 (리터 60 MG "인스턴트 오션 '소주 H 2 O)로 가득 비커에 요리를 병합하고, 부드럽게 비커에 달걀을 전송하고 계란 물을에"가을 "수 있습니다. </li><li> 생선 물 세 번와 계란을 씻어. 대부분의 달걀들은 chorion에서 발표됩니다. </li><li> 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 E3 배아 매체 가득 아가로 오스 - 코팅 배양 접시에 dechorionated 달걀을 전송합니다. </li></ol> 2. GDP - FucAl로 Microinjection <ol><li> 보고된 7 번 프로토콜 다음과 같은 사출 요리를 준비합니다. </li><li> E3 배아 매체 가득 주입 요리에 dechorionated 계란을 전송합니다. </li><li> 바늘을 준비, 2 μL 주입 솔루션을로드합니다. 이 솔루션은 추적기 0.2 M KCl에 페놀 레드 로딩 염료 (0.1 % W / V)와 같은 20 GDP - FucAl가 chemoenzymatically 8 합성 MM하거나, 알렉사 플루어 594 - dextran (5 % W / V)가 포함되어 있습니다. 대조군으로 주입 용액에 GDP - fucose와 GDP - FucAl를 교체하십시오. </li><li> 바늘을 부수고 1 NL 드롭 9 얻을 수있는 분사 압력 및 시간을 조정합니다. </li><li> 두 솔루션 1 NL와 계란을 주사. </li><li> E3 배아 매체 가득 아가로 오스 - 코팅 배양 접시에 계란을 전송합니다. </li><li> 28 ° C에서 알을 품어하고 배입니다 3-4시간 이내 unfertilized 계란을 제거합니다. </li></ol> 3. BTTES - 잘라내기 (I) 촉매 클릭 화학 반응 <ol><li> 배아가 발달 단계 (예 : 후반 gastrula, 조직 세분화 및 초기 유충), 코트 아가로 오스와 96 - 웰 플레이트의 기반을 원하는 도달했을 때. </li><li> 각 잘하는 92 μL E3 배아 매체를 추가, (H 2 O의 2.5 MM 주식에서) 4 μL 알렉사 플루어 - 488 azide를 추가하여 다음 2 μL BTTES - CuSO 4 6시 1분 복잡하고 섞어 부드럽게 발라줍니다. </li><li> 잘 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 클릭 화학 시약을 포함하는으로 배아를 전송합니다. 각 잘 다섯 배아 미만을 포함해야합니다. </li><li> 클릭 반응 3 시작 2.5 μL 신선한 나트륨 아스코 브를 (H 2 O에서 100 MM 재고에서) 추가합니다. 각 시약의 최종 농도 : 알렉사 플루어 - 488 azide : 100 μm의, CuSO 4 : 50 μm의; BTTES : 300 μm의, 나트륨 아스코 브 : 2.5 MM. </li><li> 3 분 후, 100 μL E3의 배아 매체 즉시 희석 후 반응을 담금질하기 위해, 2 μL bathocuproine sulphonate (H 2 O 50 MM 재고), biocompatible 구리 chelator를 추가합니다. </li><li> 유리 페트리 접시에 배아를 전송 15 ML E3 배아 매체로 취급 태아에게 2 번 씻는다. </li></ol> 4. 이미징 <ol><li> MatTek 유리 바닥 microwell 요리에 ultralow 용융 점 아가로 오스 (E3 배아 매체에서 1.2 % (W / V))의 방울 장소, 아가로 오스 드롭으로 배아를 놓으십시오. </li><li> dorsally 또는 옆으로 배아를 위치와 아가로 오스 드롭을 응고 5 분 얼음 접시를 놓습니다. 그것은 아가로 오스 드롭을 커버 때까지 음식을 부드럽게 E3 배아 매체를 추가합니다. </li><li> 형광 및 명시야 이미지는 순차적으로 공촛점 현미경을 사용하여 획득하고 있습니다. 모든 배아 이미지는 5 μm의 단계 간격을 사용하는 인수입니다. 복합 수치는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 1은 우리 두 단계 라벨링 전략의 흐름을 보여줍니다. 그림 2는 9.5 시간 게시물 수정 (HPF)에서 BTTES - 중재 CuAAC 통해 zebrafish 배아의 라벨을 보여줍니다. BTTES는 트리스 (triazolylmethyl) 아민 기반 리간드이다. 그것은 현장에서 생성된 잘라내기 (I)로 조정하면 극적으로 CuAAC 가속하고, 명백한 독성없이 생활 시스템에 빠르게 cycloaddition 반응을 촉진합니다. 즉시 3 분 클릭 반응 다음, 우리는 국내 총생산 (GDP) - FucAl 취급 배아의 강력한 라벨 (그림 2, 왼쪽 패널)을 감지할 수 있습니다. 단지 배경 형광은 GDP - fucose (그림 2, 오른쪽 패널)과 microinjected 제어 배아의 발견입니다. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. zebrafish 배아의 뒤덮었 레이어 fucosylated glycans를 라벨링의 전략. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. BTTES - 잘라내기 (I) 촉매를 클릭 화학 통해 zebrafish embryogenesis 동안 fucosylated glycans의 생체내 이미징에서. 한 세포 단계의 배아 zebrafish는 GDP - FucAl의 단일 복용과 함께 microinjected과 devel 수있게됩니다9.5 HPF로 조합. 배아는 다음 알렉사 플루어 BTTES - 잘라내기 (I)에 의해 488 - azide의 촉매와 반응하고 있습니다. 반응 배아는 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 명시야 (하단 패널), 알렉사 플루어 488 형광 (어퍼 패널)의 최대 강도 Z - 프로젝션 이미지. 스케일 바 : 100 μm의. 문제 해결 <table border="1"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 원인 </td><td> 치료제 </td></tr><tr><td> 배아는 건강에 해롭습보세요 </td><td> microinjected 솔루션은 오염 물질을 포함하고 </td><td> 뉴클레오 티드 설탕의 순도 85 %보다 커야한다. 소스를 확인합니다. </td></tr><tr><td> 반응 후 아무 라벨링이 없습니다 </td><td> 구리 농도는 아래 30 μm의 수 있습니다 </td><td> 배아를 추가할 때 구리 농도가 아래에 30 μm의 때 반응 속도가 크게 방울로 초과 E3의 배아 미디어를 추가하여 반응 용액을 희석하지 않도록주의하십시오. </td></tr><tr><td> 배아는 반응 후 다이 </td><td> 배아의 부적 절한 처리 </td><td> pipet 불타는 광택이며 반응 용기는 0.5 % 아가로 오스의 매우 얇은 레이어로 코팅되어 있는지 확인합니다. </td></tr><tr><td> 이미지가 낮아요보세요 </td><td> 시약은 제대로 배아를 추가하기 전에 혼합하지 않습니다 </td><td> 시약에 대한 이외의 권장 순서를 따라, 그리고 클릭 화학 시약 제대로 배아를 추가하기 전에 혼합되었는지 확인하십시오. </td></tr><tr><td> 이미지가 배아가 손상보기 </td><td> 반응 동안 힘차게 손해를 흔들림하면 배아 </td><td> 배아는 솔루션에 한번 부드럽게 미만 10 초 동안 흔들. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

<p class="jove_content"&gt; 이미징 biomolecules<em&gt; 생체내에</em&gt; 자신의 모국어 환경에서 자신의 생물 학적 활동의 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 zebrafish 배아의 뒤덮었 계층에 fucosylated glycans의 라벨이 BTTES - 중재 biocompatible CuAAC 통해 GDP - FucAl 하나의 세포 단계의 배아와 두 번째 단계 형광단의 활용을 microinjecting하여 실현하는 방법을 보여줍니다<sup&gt; 3</sup&gt;. 강력한 라벨이 2~3분 이내에 얻을 수 있으며, 라벨 glycans 2.5 HPF 빠르면 감지됩니다. 중요한 것은, GDP - FucAl의 단일 복용 96 HPF까지 감지 alkyne 종속 형광 신호를 얻을 수 있습니다. 동일한 접근 방식은 두 개의 연속 CuAAC 통해 zebrafish을 개발 alkyne - 태그 fucosides의 거래를 모니터링하는 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 실험에 확장될 수 있습니다. 그러나, 라벨은 클릭 화학 시...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 구리 (II) 황산염의 pentahydrate </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 488 azide </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextran, 알렉사 플루어 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D - 22913 </td></tr><tr><td> (+) - L - 아스코 브 산 나트륨 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic 산성 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> 유리 바닥 microwell 요리 </td><td> MatTek </td><td> P35G - 1.5-14 - C </td></tr></tbody></table>

신진 대사 라벨링 및 bioorthogonal 클릭 화학에 의해 zebrafish 태아의 영상 glycans

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

생체내의 이미징 glycans 최근 azide 또는 alkyne - 태그 단당류 1, 2 세포 또는 유기체를 처리하여 bioorthogonal 화학 기자 전략을 사용하여 활성화되었습니다. glycan의 biosynthetic 기계에 의해 처리 수정 단당류는, 세포 표면 glycoconjugates에 통합됩니다. bioorthogonal azide 또는 alkyne 태그 다음 시각화를위한 형광 프로브와 공유 결합 결합을 허용하거나, 농축 및 glycoproteomic 분석을위한 화성 탐사선과. 의 뒤덮었 레이어 fucosylated glycans를 라벨 GDP - 5 - alkynylfucose (GDP - FucAl), 2 하나의 세포 단계의 배아 1) microinjection) :이 프로토콜을 포함하여 일반적으로 zebrafish 배아에서 fucosylated glycans의 비침 투 이미징에 사용되는 절차를 설명 공촛점 현미경 3 biocompatible 잘라내기 (I) 촉매 azide - alkyne cycloaddition의 (CuAAC), 3) 영상을 통해 azide - 복합 fluorophores와 zebrafish 배아. 여기에서 설명한 방법은 쉽게 glycans의 다른 클래스, sialic 산성 4 N - acetylgalactosamine 5, 6를 포함하는 예 glycans 개발 zebrafish과 다른 살아있는 생물에을 시각화하기 위해 확장될 수 있습니다.

zebrafish 배아에서 alkyne - 태그 glycans의 급속한, 비침 투, 그리고 강력한 라벨을 허용 클릭 화학 기반 방법을 설명합니다. 후반 gastrulation 단계에 zebrafish 배아의 뒤덮었 레이어 Fucosylated glycans이 연구에서 몇 군데 있었다.

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans

최근 생체 내(in vivo)에서 글리칸(glycan)을 이미징하는 것이 가능해졌는데, 이는 세포나 생물체에 아지드(azide) 또는 ... 처리하여 바이오 직교 화학 리포터(bioorthogonal chemical reporter) 전략을 사용하는 방식입니다.

최근의 글리칸(glycan) 인비보(in vivo) 이미징 시연에서는 알킨(alkin) 또는 아지드(azide)가 표지된 단당류를 세포나 유기체에 처리하는 생체 직교 화학 리포터 전략이 사용됩니다. 글리칸 생합성 기제에 의해 처리된 변형 단당류는 세포 표면의 당접합체에 생체 직교 알킨 또는 아지드 표지로 통합됩니다. 이후 시각화를 위한 형광 프로브 또는 농축 및 당단백질체 분석을 위한 친화성 프로브와 공유 결합 컨쥬게이션이 가능해집니다.이 클릭 화학 기반 방법은 제브라피시 배아 내의 알킨 또는 아지드 검출 글리칸을 신속하고 비침습적이며 견고하게 표지할 수 있게 하며, 발달 중인 생물체의 다른 종류의 글리칸을 시각화하는 데로 쉽게 확장될 수 있습니다. 렉틴 또는 항체 기반 글리칸 검출 방법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 동적인 인비보(in vivo) 이미징에 적용 가능하다는 점입니다. 렉틴 및 항체 기반 이미징 방법은 특정 시점의 글리칸에 대한 스냅샷만을 제공합니다.이러한 방법들은 동적 연구 맥락에서 구현하기 어렵습니다. 또한, 렉틴이나 항체를 이용해 글리칸을 표지하려면 관심 세포나 조직을 천연 환경에서 제거하고 분석 전 고정 과정이 필요합니다. 반면, 바이오 직교 화학 리포터 전략을 사용하여 글리칸을 표지하면 이러한 제한 사항을 극복할 수 있으며, 제브라피시 배아 및 sea elegance 배아와 같은 살아있는 시스템 내 글리칸의 비침습적 이미징에 직접 적용할 수 있습니다.Qlik 화학의 생체 적합성 버전인 BTT Es 매개 Azi Aine Cyclo edition을 사용하면 1~5분 이내에 강력한 라벨링이 가능합니다. 절차를 처리하는 단계는 다음과 같습니다. 실험실에서 제브라피쉬 알을 수집하여 35 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 가능한 한 많은 물을 제거한 다음, 난막을 소화시키기 위해 배아 배지에 1 mg/mL pronase E를 첨가합니다. 3~5분 후 난막에서 기포가 발생하면, 접시를 어류용 물이 채워진 비커에 담급니다.알들이 물속으로 떨어지게 하여 조심스럽게 비커로 옮깁니다. 알들을 어류 용수로 충분히 헹구어 대부분의 알이 난막(corion)에서 분리되도록 합니다. 이제 화염 멸균한 피펫을 사용하여, 코팅된 알들을 E three 배아 배지가 채워진 agros 코팅 페트리 접시에 옮깁니다. 준비된 주입용 접시에 E three 배아 배지를 채우고 코팅된 알들을 옮깁니다.다음으로, 바늘을 준비하고 20 millimolar GDP Fuk all과 추적자로서 5%lor, 5 94 dextrin 또는 음성 대조군으로서 0.2 molar potassium chloride 내의 0.1%phenyl red 로딩 염료가 포함된 주입 용액 2 µL를 충전합니다. 주입 용액 내의 GDP FUCA를 GDP Fuco로 대체하십시오. 이제 바늘 끝을 떼어내고, 1 nanoliter 방울이 맺힐 때까지 주입 압력과 지속 시간을 조절하십시오.그런 다음 난자에 용액 1 nanoliter를 주입합니다. 마지막으로, 주입된 난자를 E3 배아가 포함된 agar 코팅 페트리 접시에 옮기고 수정 후 3~4시간 이내에 28 °C에서 배양합니다. 배아가 후기 가스트룰라 조직 분절기 및 초기 유충기와 같은 원하는 발달 단계에 도달하면 수정되지 않은 난자를 제거합니다.96-웰 플레이트의 바닥을 aros로 코팅합니다. 각 웰에 배아 배지 92 µL를 넣은 후, 물에 희석한 2.5 mM 스톡 용액의 4 88 azide 4 µL와 B-T-T-E-S 황산 구리 6:1 복합체 2 µL를 화염 연마된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 첨가합니다. 5개 미만의 배아를 웰로 옮깁니다.클릭 화학 시약을 계속해서 추가하며, 갓 준비한 100 millimolar sodium ascorbate 2.5 µL를 넣습니다. 클릭 반응을 시작하려면 3분 동안 반응시킵니다. 이제 반응을 중단시키기 위해 생체 적합성 구리 킬레이트제인 50 millimolar batho Cooper wine sulfonate 2 µL를 추가하고, 즉시 100 µL의 배아 배지로 희석합니다.배아를 유리 페트리 접시에 옮기고, 처리된 배아를 15 milliliters의 embryo.Medium으로 2회 세척합니다. matte tech glass bottom micro well dish에 ultra low melting point aros 한 방울을 떨어뜨린 후, 배아를 aros 방울 안으로 옮깁니다. 배아의 위치를 잡고 접시를 얼음 위에 5분 동안 둡니다.Agarose 드롭을 고정하기 위해, agarose가 덮일 때까지 배아 배지를 디쉬에 조심스럽게 첨가하십시오. 순차적으로 떨어뜨려 줍니다. 공초점 현미경을 사용하여 5 µm 간격으로 형광 및 명시야 이미지를 획득하고 합성 이미지를 구성하십시오.이미지를 사용합니다. J-B-T-T-E-S는 NC-2에서 생성된 copper(I)와 배위 결합 시 copper(I)의 촉매 작용을 획기적으로 가속화하며, 뚜렷한 독성 없이 생체 내 시스템에서 고리 첨가 반응을 빠르게 촉진하는 아트리 아민 기반 리간드입니다. 본 실험에서는 B-T-T-E-S 매개 구리를 통해 제브라피쉬 배아를 표지합니다.수정 후 9.5시간, 3분간의 클릭 반응 직후의 A, a, C입니다. 예상대로 GDPF로 처리된 모든 배아에서 강력한 라벨링이 검출됩니다. GDP로 미세 주입된 대조군 배아에서는 배경 형광만 검출됩니다. Fuco 라벨링 및 이미징은 수정 후 2.5시간에서 96시간 사이 언제든지 수행할 수 있습니다.이 이미지들은 수정 후 24시간과 48시간에 얻은 것입니다. 펄스 체이스(Pulse chase) 기법을 사용하였습니다. 이 전략을 통해 서로 다른 시점에서 생성된 Alcon fuco에 서로 다른 색상의 형광 표지를 함으로써, sated glycans의 동적인 생합성 과정을 모니터링할 수 있습니다.이 절차는 유전적 돌연변이 또는 형태 기반의 유전적 억제 기술과 결합하여 제브라피시 배아 발생 과정 중 개별 글리칸 합성 효소의 구체적인 역할을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 당쇄 생합성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 아실화나 액체화와 같은 다른 번역 후 변형 과정에도 적용될 수 있습니다.이는 또한 새로 합성된 단백질 연구에도 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아 유전자 변형의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템의 개발을보고합니다. 이것은 Fibroblast 성장 팩터 리포터 유전자의 표현에 작은 분자, BCI의 복용 부양 효과를 측정하고 높은 처리량 zebrafish 화학 화면 설립을위한 기술을 제공하는 능력을 보여줍니다.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

이 비디오는 제브라피시 방사상 신경교세포에서 Notch/DeltaD 신호를 이미지화하기 위한 항체 흡수 분석을 보여줍니다. 여기에는 아가로스가 박힌 탈이온화된 제브라피시 배아를 장착하고, 망막 신경절 세포에 DeltaD 리간드를 표적으로 하는 염료 용액을 주입하고, 비대칭 세포 분열을 위해 형광 현미경으로 이미징하여 Notch/DeltaD 신호 활성화를 확인하는 작업이 포함됩니다.

제브라피시 방사상 신경교세포(Radial Glia progenitor)에서 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

제브라피시 배아에 존재하는 저농도 내인성 수용체를 검출하기 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 우리는 이를 AFLIP이라고 명명했는데, 이는 면역침전과 연결된 리간드에 의한 수용체의 친화성 표지로 구성되어 있기 때문입니다.

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

이 연구는 제브라 피쉬에서 급성 및 만성 고혈당 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 목표는 구성 및 상해 유발 신경 발생과 같은 생리적 과정에 대한 고혈당의 영향을 조사하는 것입니다. 이 연구는 또한 PET / CT를 사용하여 방사성 동위 원소 표지 된 분자 (여기서는 [ 18 F] -FDG)를 따르는 제브라 피쉬의 사용을 강조합니다.

제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

배우세요 바이오오르토고날 클릭 화학을 이용한 제브라피시 태아의 당단백질 라벨링 방법을. 이 기술은 생체 내 동적 영상화가 가능하여 당생물학 연구에 혁신적인 도구를 제공합니다.

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans

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