Name: 탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 생분해성 탄성체와 소금 융합법을 이용해 다공성 관형 스캐폴드를 제작하고, 혈관 평활근 세포를 배양하여 동맥 조직 공학용 기능성 조직을 개발하는 방법을 탐색하세요.

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저자는 PGS 합성, 생물 반응기 설치, DRS에 대한 통찰력 토론을위한 박사 베드로 크라포 박사 진 가오 감사합니다. 모하메드 Ezzelarab와 개코 원숭이 경동맥의 동맥을 explanting위한 그치 우. 이 연구는 국립 보건원 (R01 HL089658)에서 부여에 의해 지원되었다.

1. 관형 스캐폴드 제작 <ol><li> 발판을위한 금형으로., 유리 튜브 (소형 부품, 미라, FL 길이 = 70mm, 외경 = 9.0 mm, 벽 두께 mm = 1.0) 준비 </li><li> 탈이온수 10 ML로 HA 100 MG를 용해하여 1.0 WT / 권 % hyaluronic 산성 (HA) (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)를 준비합니다. 솔루션에 공기 방울이 없을 때까지 하루 회전을 사용하여 섞는다. </li><li> 유리 튜브의 상단에 1.0 %의 HA 솔루션을 붓고. 그것은 금형의 내부 벽을 따라 천천히 흘러가게. 솔루션은 회전을 사용하여 금형의 하단에 도달하면 튜브를 통해 플립과 금형의 내벽이 골고루 솔루션 코팅 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 코팅 후, 24 H. 위해 37 진공 오븐 ° C로 모든 유리 tubings 건조 </li><li> 갈기와 체 소금 입자 (크기 = 25-32 μm의)는 porogens로 사용. </li><li> 유리 튜브 (1.0 %의 HA 솔루션 내부 코팅), 심봉 (스테인리스는 PTFE 튜빙으로 쌌다), 열 수축 (HS) 슬리브 및 PTFE 링으로 이전 8 설명한 조립. </li><li> 실리콘 고무 퍼널 통해 주걱을 사용하여 유리 몰드에 원하는 크기의 소금 입자를 추가합니다. 소금 입자의 균등을 보장하기 위해 부드럽게 금형을 누릅니다. 주걱의 측면을 사용하여 금형의 맨 위에 여분의 소금 입자를 다쳤어요. </li><li> 소금 포장의 금형을 전송하기 전에 30 분 하이브리드화 인큐베이터를 켭니다. 하이브리드화 배양기를 끄고 소금 융합에 대한 하이브리드화 인큐베이터에 소금 포장 금형을 넣어. </li><li> 하이브리드화 인큐베이터에서 금형을 제거하고 37 진공 오븐으로 그들을 건조 ° C를 24 H.위한 </li><li> 진공 오븐에서 소금 포장의 금형을 제거하고 그들을 실온에서 냉각 수 있습니다. PTFE의 반지를 들고 그것을 아래로 밀어 스테인리스 심봉를 제거합니다. 심봉가 금형에 너무 꽉 경우, 그것을 꺼내 바늘 펜치를 사용합니다. 금형의 하단에서 PTFE 반지를 제거합니다. </li><li> ° C 5 분 HS 슬리브를 축소 120의 오븐으로 금형을 넣어. HS 슬리브가 줄었 있는지 확인하십시오. 소금 포장 금형에서 HS 슬리브를 제거하고 그들을 실온에서 냉각 수 있습니다. 그들이 사용하는 때까지 dessicator에 금형 보관하십시오. </li><li> 20 WT / 권의 %의 솔루션을 형성 tetrahydrofuran 15 ML (THF) (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)으로 PGS 3 G를 해소하여 PGS 솔루션을 준비합니다. </li><li> 흄 후드에서 spoid를 사용하여 그것을 놓아 소금 포장 금형의 루멘에 PGS 솔루션을 추가합니다. 45 °에 대한 유리 금형을 엎드려서 천천히 금형을 회전과 함께 내부 루멘으로 PGS 솔루션을 놓으십시오. PGS 솔루션 금형의 벽을 따라 아래로 흐르고 있는지 확인하십시오. 건조 장소가 관찰되면, 더 많은 솔루션을 추가합니다. </li><li> PGS 솔루션을 추가 후, THF를 증발을 위해 적어도 30 분 흄 후드에서 금형을 놓으십시오. </li><li> 100 mTorr 150 ° C 경화 PGS를 보려면 미리 정해진 경화 시간의 진공 오븐 (예 : 24 / 48분의 36 H)로 금형을 넣어. </li><li> 치료 후, 금형을 가지고 진정 실온에서 그들을 놓으십시오. 수직 위치 천천히 함께 탈이온수에 각각의 금형을 찍어. 공기 방울이 비계 찢어 원인이 있기 때문에 물이 빨리으로 그들을 찍어하지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 물 목욕으로 금형을 전송하고 쉽게 HA를 해산하기 위해 실리콘 튜브를 사용하여 1 H에 대한 각도에서 그들을 놓으십시오. HA는 금형에서 녹아 있는지 확인하십시오. 아무 HA는 금형에서 공개하지 않으면 천천히 금형에서 공개 주걱을 사용하여 비계의 한쪽 끝을 밀어. 발판의 다른 끝에이 단계를 반복하여 물이 욕조에서 천천히 앞뒤로 금형을 흔들. 발판이 금형 내부 이동 있는지 확인하십시오. </li><li> 주의 활동가 다른 물 목욕으로 발판을 전송합니다. 발판을 깰 수 굳게 발판을 잡아하지 마십시오. 소금 입자 아웃 리치 물을 변화와 적어도 3 일 동안 물 목욕에 비계를 놓습니다. </li><li> 소금 입자 밖으로 침출 후 탈이온수 가득 15 ML의 원심 분리기 튜브 각 비계를 전송하고 동결 1 H 위해 드라이 아이스 상자에서 그들을 놓으십시오. lyophilizer (모든 튜브 택시가 열려 있어야합니다)에 원심 분리기 튜브를 넣어 2 일간을 lyophilize. </li><li> 그들이 사용하는 때까지 전에 dessicator에 모든 공사장 공중 발판을 넣고. </li></ol> 2. 셀 심는위한 발판 준비 <ol><li> dessicator에서 공사장 공중 발판을 가지고 길이의 25-30밀리미터로 잘라. </li><li> 이 실리콘 고무 stoppers을 (직경 = 20mm, 벽 두께 = 6.35 mm, 중간 구멍 직경 = 3 ㎜) 준비 두 PTFE의 tubings을 (외경 = 3.97 mm, 내경 연결 = 2.38 mm, 벽 두께 = 0.79 mm, 길이 = 각 스토퍼의 가운데 구멍을 60mm와 40mm). </li><li> 길이 1.5 mm로 HS 반지를 잘라 발판의 한쪽 끝을 상단에 올려 놓는거야. 가능한 한 작은 겹치는 부분을 발판의 한쪽 끝을 하나의 PTFE 튜빙을 (실리콘 고무 마개 연결되어 있음) 누르십시오. </li><li> ° C 10 분에 대한 HS 반지를 축소 120의 오븐에 발판과 PTFE 튜빙을 넣어. HS 링이 축소되고 공사장 공중 발판을 단단히 PTFE 튜빙에 연결되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 발판과 PTFE 튜브를 타고 아래로 냉각 상온에서 그들을 놓으십시오. 폴리 카보 네이트 튜브 (외경이 15.5 mm =, 내경 = 9mm, 길이 = 50 ㎜) 생물 반응기 챔버 등에 비계 - PTFE 튜빙 어셈블리를 넣어. </li><li> 단계 2.3) 및 2.4)과 같은 비계로 PTFE 튜빙의 다른 쪽 끝을 연결합니다. </li><li> 폴리 카보 네이트 튜브의 양쪽 끝을 자신의 내부 표면을 첨부하는 방법은 두 실리콘 고무 stoppers를 조정합니다. (; 폭 = 20mm, 길이 = 70mm, 두께 = 6.35 mm 상단 및 하단) 2 알루미늄 합금 판으로 실리콘 고무 stoppers 모두 외부 표면을 연결합니다. 접시의 측면 구멍 두개의 스레드 봉을 넣고 접시에 엄지 너트 나사를 강화하여 접시에 폴리 카보 네이트 튜브 (비계 내부 포함) 이후의 수정 프로그램입니다. </li><li> 각 발판의 seedable 길이 (두 HS 고리 사이의 길이)를 측정하고 세포 시딩 각 비계의 내부 표면적 (π X 내경 X seedable 길이)를 계산합니다. </li><li> 랩 한 생물 반응기 챔버 알루미늄 호일로 유닛과 ° C 30 분 120에 autoclaving하여 소독. 30 분 120 ° C에서 autoclaving하여 생물 반응기의 각 부분 (중간 저수지, 펌프​​ 튜브, 가스 교환기, manifolds, 그리고 니들 밸브) 소독과 세포 배양 후드 안으로 그들을 조립. </li><li> 사전은 - 치료와 perfusions 일련의 (70, 50, 및 25 % 에탄올 1 H 들어, 생리 (PBS 인산염 버퍼와 공사장 공중 발판을 씻어; 사용하여 24 H에 대한 Mediatech, 헤른던, VA) 2 H, 그리고 SMC 문화 매체 1.0 ML / 흐름 회로의 분 연동 펌프. </li></ol> 3. 세포 심는 문화 <ol><li> 청소년 남성 개코 원숭이 (Papio 아누비스)의 경동맥 동맥에서 기본 동맥 평활근 세포를 (SMCs) 분리 및 passaging 이전에 설명된 바와 같이 9 시딩하기 전에 2 차원 (2D) 문화를 특징. </li><li> 10% 태아 소 혈청 (Lonza, 워커스빌, MD), 1 % L - 글루타민 (Mediatech), 50 μg / ML의 아스코르비 산 (피셔 과학, 페어 론과 MCDB 131 매체 (Mediatech, 헤른던, VA)를 사용하여 SMCs을 확장 NJ), 그리고 항생 - antimycotic 솔루션 (10,000 IU / ML 페니실린, 10,000 μg / ML의 스트렙토 마이신, 25 μg / ML amphotericin B, Mediatech). </li><li> 생물 반응기의 흐름 회로에서 각 생물 반응기 챔버를 분리합니다. (입구) abluminal 및 luminal (콘센트) 흐름을 모두 잘라 후 공사장 공중 발판의 루멘에 5 ML의 주사기와 서스펜션을 주사하여 2x10 6 세포 / cm 2 밀도 발판에 씨앗 SMCs (통로 4-6). </li><li> 37 ° C에서 하이브 리다이 제이션 인큐베이터에 모든 생물 반응기의 챔버 스를 넣고 세포가 균일하게 발판으로 확산 수 있도록 4 H 2 RPM에서 그들을 돌린다. </li><li> 후드에있는 생물 반응기의 회로를 흐름에 하이브리드화 보육 다시 첨부 그들의 생물 반응기 챔버 스를 꺼내. 세포 문화 인큐베이터로 모든 생물 반응기 시스템을 전송합니다. </li><li> 연동 펌프의 연골에 펌프 튜브 (내경 1.6 mm =)를 연결하고 저수지에서 신선한 문화 매체를로드합니다. 1.0 ML / 전용 luminal 흐름 뒤에 15 분 분을 통해 - 벽면 재관류를 (abluminal하는 luminal)를 시작합니다. </li><li> 1-14.2 ML / 분 (15.3 다인즈 / cm 2) 일 21 일 120 mmHg, 각각 및 일 20 mmHg : 1.0 ML / 분부터 점진적으로 (1.1 다인즈 / cm 2 luminal 전단 응력)를 유량 및 압력을 향상시킬 수 있습니다. 일 4 펌프 튜브 (내경 3.2 mm =)와 매체 매주 한번을 변경합니다. </li></ol> 4. 조직 착취 및 분석을위한 샘플 준비 <ol><li> 21 일 문화 후, 중간 저수지의 펌프와 클램프 tubings을 (유입 및 콘센트) 중지합니다. 후드에 연동 펌프 및 전송 생물 반응기 시스템의 연골에서 펌프 튜브를 분리합니다. </li><li> 입구와 각 생물 반응기 챔버의 출구 tubings 고정 및 유동 루프에서 분리합니다. 입구 관을 열고 폴리 카보 네이트 튜브 내부의 문화 매체를 수집하는 아울렛 튜브에서 배양 - 요리를 준비합니다. 천천히 아울렛 튜브를 열고 챔버에서 매체를 제거합니다. </li><li> 챔버에서 abluminal 게이지 바늘과 luminal 실리콘 튜브를 분리하고 엄지 나사를 출시하여 알루미늄 접시를 분리합니다. 폴리 카보 네이트 튜브를 제거하고 PTFE 튜빙의 구조 조직의 한쪽 끝을 분리. </li><li> PBS 10 ML 가득 배양 - 접시를 준비하고 PTFE 튜빙에서 구조의 다른 쪽 끝을 분리. PBS로 구조를 세 번 씻어 넣어. </li><li> 길이 5 - mm로 면도날과 구조를 잘라. -80 생화 학적 분석에 대한 ° C의 냉장고에서 그것을 정지하거나 조직 테크 최적의 절삭 온도 화합물 (사쿠라 Finetek 주식 회사, 토랜스, CA에 기계적 시험 또는 스냅 동결을위한 신선한 매체의 5 ML 가득 15 ML의 원심 분리기 튜브로 전송 )에 대한 조직학 / immunofluorescence 얼룩. </li></ol> 5. 대표 결과 : 관형 PGS의 공사장 공중 발판은 소금 융합 방법 (그림 1A)에 의해 생분해성 탄성체를 사용하여 가공되었습니다. 각 생물 반응기 챔버 luminal와 abluminal 두 흐름과 공사장 공중 발판을 제공하고 주요 흐름 루프 (그림의 1B)에서 별도의 단위로 분리 수 있습니다. 생물 반응기 시스템은 제어 및 흐름뿐만 아니라 압력 (그림 1C &amp; D)를 모니터링하여 한 번에 culturing 네 공사장 공중 발판을 위해 설계되었습니다. 생물 반응기 문화의 개략도는 그림에 표시되었다. 2. SMCs을 심는 후, 각 생물 반응기 챔버는 37 회전되었습니다 ° C 발판의 루멘에 균일하게 세포를 배포 4 H하십시오. 그리고, 타악기 흐름이 점차 증가 유량 (그림 2A) 및 압력 (그림 2B)로 14 일까지 공사장 공중 발판을 적용했다. 14 일 후, 흐름과 압력이 문화의 끝 (일 21)까지 지속적으로 유지. PGS 발판의 표면 형태는 전자 현미경 (SEM)을 검색하여 조사되었다. 스캐닝 전자 micrographs는 비계가 일관성 벽이 (539 ± 18 μm의)을 두께 것을 보여주었다 (그림 3A)와 무작위로 luminal 표면 (그림 3B)에 대한 매크로 및 마이크로 모공을 배포했습니다. 발판의 Morphometric 매개 변수는 microcomputed tomography (마이크로 - CT) 및 영상 분석 측정되었다. 평균 기공 크기는 23.3 ± 3.9 μm의 기공과 상호 연관이 99.4 ± 0.62 %이다, 모든 모공이 완전히 발판으로 서로 연결되어있다는 것을 의미합니다. 에탄올 변위로 측정 다공성은 75.6 ± 2.7 %입니다. PGS 구조의 세포 형태는 SEM (그림 4)에 의해 조사되었다. Multilayered의 SMCs 완전히 luminal 표면을 커버하고 그들은 흐름 방향에 수직 지향했다. 이러한 결과는 타악기 흐름 생물 반응기에서 기계 시설의 발판에서 SMC 방향을 지원하는 것으로 나타났습니다. 세포외 매트릭스 (ECM) 및 탄성 섬유의 존재는 H &amp; E의 얼룩과 엘라스틴 autofluorescence (그림 5)에 의해 조사되었다. H &amp; E 염색법은 세포와 ECM 단백질이 완전히 구조 PGS의 루멘을 취재 것을 보여주었다. 엘라스틴 autofluorescence 또한 구조의 luminal 표면에 circumferentially 조직 탄성 섬유를 보여주었다. PGS 구조의 ECM 단백질의 생산은 생화 학적 assays에서 측정되었습니다. 불용성 엘라스틴과 콜라겐의 내용은 20.2 ± 9.1 μg / 조직 및 6.3의 MG ± 조직의 1.9 μg / MG, 각각 있었다. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 스캐폴드 제조 및 생물 반응기 시스템. 관형 발판 제조의 (A) 도식. (B) 생물 반응기 챔버가. 공사장 공중 발판은 PTFE 튜빙에 연결된 폴리 카보 네이트 튜브에 배치하고, 실리콘 고무 stoppers 및 알루미늄 합금 판으로 수정되었습니다. (게이지 바늘로) luminal (실리콘 튜브로)와 abluminal 흐름 : 각 챔버는 두 흐름 경로를하고 있습니다. 인큐베이터 안에 (C) 생물 반응기 시스템. 그것은 중간 저수지, 연동 펌프 모듈, 가스 교환기, 압력​​ 트랜스 듀서, 두 manifolds (위쪽과 아래쪽) 및 니들 밸브를 포함합니다. (D) 생물 반응기 시스템은 인큐베이터 밖으로 배치. 그것은 압력 모니터, 흐름 제어 장치, 데이터 수집 시스템 및 컴퓨터가 포함됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 생물 반응기 문화의 도식. (A) 문화 프로토콜. (B) 각각의 시점 (1 일, 4, 7, 14)에서 압력 프로파일을 적용. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. PGS 발판의 표면 형태. (A) 크로스 - 섹션을 참조하십시오. (B) 루멘은. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. PGS의 세포 형태는 구조. (A) 루멘은. 45 ° 컷의 (B) 크로스 - 섹션을 참조하십시오. 두 그림의 화살표는 흐름 방향을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 조직학 및 PGS의 엘라스틴 autofluorescence는 건설. (A) H &amp; E 염색법. (B) 대응 엘라스틴의 autofluorescence가. L : 루멘. 배율 : 40X. 스케일 바 : 50 μm의.

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</ol>

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여기에서 설명한 생분해성 탄성체를 사용하여 제조 기술은 몇 가지 기능을 가지고 있습니다. (1) 우리는 금형 자료로 hyaluronic 산성 (HA)을 사용합니다. HA는 물 용해되기 때문에, 발판은 쉽게 물에 그것을 몸으로 후 유리 금형에서 발표되었습니다. 솔루션의 낮은 농도 (&lt;0.5 WT / 권 %)가 점성이 아니므로 우리가 유리 튜브의 상단에 물을 붓는 경우 아래로 너무 빨리 흐르고 있기 때문에이 보고서에서 우리는 HA 솔루션의 1.0 WT / 권 %를 사용합니다. 이 솔루션은 튜브의 바닥을 날아이 단계를 반복하면 코트의 HA 솔루션에 균일하게, 우리는 유리 튜브를 통해 협조했습니다. 이 HA 코팅이 최종 공사장 공중 발판을 발표에 대한 우리의 제작 과정에 중요합니다. (2) 우리는 유리 튜브에 염분을 유지를위한 열 수축 (HS) 슬리브를 사용합니다. 소금은 밀도가 유리 튜브와 HS 슬리브의 내부 벽 사이의 공간에 포장하고 있기 때문에, HS 슬리브가 튜브의 바닥에 심봉 및 PTFE 링을 제거한 후 소금을 유지. 우리는 ° C 5 분 120에 오븐에 곰팡이를 넣어 쉽게 HS 슬리브를 제거한 다음 소금 관형 템플릿을 얻을 수 있습니다. (3) 우리는 소금의 융합 방법을 사용합니다. 이곳은 소금 융합 방법은 융합 시간 10 변화에 의해 기공 상호 및 기계적 특성을 향상시킬 수있는 것으로 알려져 있습니다. 우리가 PGS를 사용한 이후 마이크로 모공 가능성이 글리세롤의 증기에 의해 생성된 우리가 이전에 11 설명된대로 치료 PGS 동안 형성하는 동안 또한, 매크로 모공은 침출 과정에서 소금 입자에 의해 생산되었다. 따라서이 방법은 소금의 입자뿐만 아니라 조건을 치료 PGS을 변화하여 다른 매크로 및 마이크로 구조와 다공성 관형 공사장 공중 발판을 조작하는 잠재력이있다. 생물 반응기에서 기계 시설은 타악기 흐름 재관류를 제공하고 있습니다 (최대 유량을 의미 = 14 ML / 분, 최대 전단 응력 = 15.3 다인 / cm 2, 주파수 = 0.5-1.7 Hz에서) 및 LED PGS 발판과 생리학 관련 압박 SMC의 성장과 방향 (그림 4). 이러한 결과는 이전 연구는이 주파수에서 그 순환 스트레칭을보고 및 전단 응력은 SMC 증식 12 및 ECM 단백질 생산 13,14 증가와 일치하고 있습니다. SMC의 성장과 방향뿐만 아니라, PGS는 특히 circumferentially 생물 반응기에서 3 주간 문화 이내 탄성 섬유 (그림 5) 조직, ECM 단백질 생산을 지원하는 개념입니다. 더 탄성 섬유가 이러한 구조를 찾을 수 없습니다 동안 작은 직경 동맥 구조로 탄성 발판을 사용하여 일부 연구는, 기계적 강도와 원시 동맥 15, 스피너 플라스크 16,17를 사용하여 호환 공사장 공중 발판으로 급속한 SMC 통합 비교 버스트 압력을 증명하고있다. 우리의 결과는 생물 반응기로부터 순환 방사형 팽만 가능성이 합성과 조직을 엘라스틴에 기여 PGS 발판에 SMCs에보다 효과적으로 기계적 신호 전달을 개선하는 것이 좋습니다. 혈관 SMCs 우리 접근, 정지 내피에서 ECM의 단백질을 생산하고 임상 성공 작은 직경 동맥 구조를 개발하는 데 필요한 기계적 강도를 개선하는 유일한 세포가 있기 때문에. 우리는 내피 세포가 우리 문화의 조건과 기계 시설 9 미만의 합류 monolayer 및 지원 표현형 단백질 발현을 생성 SMCs 공동 교양보고있다. 따라서, 우리의 접근 방법을 바탕으로 공동의 문화 실험 조건의 수정이 결과 구조의 기능을 개선하고 nonthrombogenic, 강력한를 생성하기 위해 다음 단계로 될, 여기서 설명하고, 준수 동맥 원래 동맥과 비슷한 개념입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Hyaluronic의 산 나트륨 소금 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetrahydrofuran </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15-100 - CV </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Lonza </td><td> BW14 - 502F </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 - CV </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> A62 - 500 </td></tr><tr><td> 항생제 - antimycotic 솔루션 </td><td> Mediatech </td><td> 30-004 - CI </td></tr><tr><td> 인산은 살린 (PBS)를 버퍼 </td><td> Mediatech </td><td> 21-031 - CV </td></tr><tr><td> 조직 테크 최적의 절삭 온도 화합물, 4583 </td><td> 사쿠라 Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

탄성 pgs는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

심혈관 질환은 미국에서 사망의 주요 원인 중 하나이며, 특히 관상 동맥 질환은 노령화 인구 증가 비만 1 증가합니다. 현재 autologous 선박, allografts, 그리고 합성 이식 일반적으로이 동맥 대체 사용으로 알려져 있습니다을 사용하여 수술을 우회. 그러나 이러한 이식은 동맥의 내경이 낮은 가용성, thrombotic 합병증, 컴플 라 이언스 불일치, 그리고 늦은 내막 증식증 3,4로 인해 6mm 이하는 제한된 애플 리케이션을했습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 조직 공학이 성공적으로 nonthrombogenic, 강력하고, 준수 작은 직경 동맥 구조를 개발하는 유망 대안으로 적용되었습니다. 몇몇 이전 연구는 트라이 - 층상 구조, 우수한 기계적 성질과 기본 동맥 5,6에 비해 파열 압력과 작은 직경 동맥 구조를 개발했습니다. 높은 인장 강도와 단단한 재료 또는 셀 시트 발판에서 콜라겐의 생산을 증가하여 파열 압력이 구조는 여전히 이식 후 이식 실패를 일으킬 수있는 주요 문제 낮은 엘라스틴 생산 및 규정 준수를했다 동안. 이러한 문제 고려, 우리는 기계 컨디셔닝과 함께 elastometric biomaterial이 탄력을 제공하고 세포외 기질의 생산을 증가하고 세포의 방향을 지원하는 혈관 세포에보다 효율적으로 기계적 신호를 실시할 것이라고 가상. 이 보고서의 목적은 다공성 관형 공사장 공중 발판의 제조 기술과 동맥 조직 공학에게 적용하는 역동적인 기계 시설을 소개하는 것입니다. 우리는 소금의 융합 방식에서 다공성 관형 공사장 공중 발판을 fabricating위한 폴리 (글리세롤의 sebacate) (PGS) 7 생분해성 탄성체를 사용합니다. 성인 기본 개코 원숭이 평활근 세포 (SMCs)은 3 주간의 설계 타악기 유동 생물 반응기에서 교양 공사장 공중 발판의 루멘에 씨앗을 품고 있었다. PGS의 공사장 공중 발판을 일관성 두께했고 무작위로 배포 매크로 및 마이크로 모공. 타악기 흐름 생물 반응기에서 기계 시설은 SMC 오리 엔테이션과 공사장 공중 발판의 향상된 ECM 생산을 지원. 이러한 결과는 탄성 공사장 공중 발판 및 생물 반응기 문화의 기계적 조절은 동맥 조직 공학을위한 유망한 방법 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

타악기 흐름 생물 반응기에서 교양 혈관 평활근 세포와 탄성 PGS의 공사장 공중 발판은 비교적 짧은 기간에 문화 기본 ECM 생산과 유망 중소 지름 동맥 구조가 발생할 수 있습니다.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

심혈관 질환은 미국의 주요 사망 원인 중 하나이며, 특히 관상동맥 질환은 인구 고령화에 따라 증가하고 있으며...

이 영상에서는 동맥 조직 공학을 위해 다공성 관형 스캐폴드를 제작하고 이를 동적 기계적 자극에 노출시키는 방법을 보여줍니다. 우선 생분해성 엘라스토머와 용융 접합법을 사용하여 스캐폴드를 제작합니다. 그 후 세포 파종을 위해 스캐폴드를 준비하고 이를 바이오리액터 시스템에 조립합니다.바이오리액터 내의 혈관 평활근 세포를 스캐폴드에 파종하여 배양합니다. 몇 주 후, 조직을 수확하여 주사 전자 현미경, H&amp;E 염색 및 엘라스틴 자가형광을 이용하여 분석합니다. 그 결과, 평활근은 다층 구조를 형성하며 수직 방향으로 배열됩니다.입자 제거법과 유사한 이 기술의 주요 장점은 유리 몰드를 사용하여 다공성 관형 지지체와 히알루론산을 제작할 수 있다는 것입니다. 몰드를 제거하면 지지체가 완성되며, 지지체 몰드는 유리관 조각으로 준비합니다. 관을 홀더에 고정하고 전날 준비한 히알루론산 용액을 관 안에 붓습니다.히알루론산이 내벽을 따라 천천히 흘러내립니다. 용액이 몰드 바닥에 도달하면 몰드를 뒤집어 줍니다. 몰드 내벽에 용액이 고르게 코팅될 때까지 이 단계를 반복합니다.코팅 후, 준비된 모든 유리 몰드를 진공 오븐에서 37 °C로 24시간 동안 건조합니다. 일반적으로 유리 몰드가 건조되는 동안 4개의 몰드를 동시에 준비합니다. 염 입자 주입물을 준비하기 위해, SVE 염 입자를 25에서 32 µm 크기로 분쇄합니다.다음 날, 준비된 유리 몰드 맨드릴, PTFE 튜빙, 열수축 슬리브 및 PTFE 링을 조립합니다. 먼저, 맨드릴을 65 millimeter 길이의 PTFE 튜빙에 넣고 120 degrees Celsius에서 5분 동안 가열합니다. PTFE를 수축시키는 동안 하이브리다이제이션 인큐베이터를 37 degrees Celsius로 최소 30분 동안 예열해 둡니다.튜브가 맨드릴을 감싸면, 열수축 슬리브를 맨드릴 위로 밀어 넣어 자유롭게 움직이게 합니다. 그다음 맨드릴을 유리 몰드 안에 넣고 맨드릴 하단에 A-P-T-F-E 링을 부착합니다. PTFE 링이 유리 몰드 바닥에 밀착되었는지 확인하십시오.다음으로, 스패튤라와 실리콘 고무 깔때기를 사용하여 유리 몰드에 염 입자 죽을 넣습니다. 그런 다음 입자가 고르게 분포되도록 스패튤라로 몰드를 가볍게 두드리고 넘친 소금을 긁어냅니다. 이제 예열된 인큐베이터의 전원을 끄고 소금이 채워진 몰드를 빠르게 넣습니다. 이후 30분 동안 소금이 융합되며, 그 후 진공 오븐에서 37 °C로 24시간 동안 몰드를 건조시킵니다.냉각 후 다음 날, PTFE 링을 고정한 상태에서 스테인리스 스틸 맨드릴을 밀어내어 몰드에서 제거합니다. 필요한 경우 니들 노즈 플라이어를 사용하십시오. 그런 다음 몰드 바닥에서 PTFE 링을 제거합니다.다음으로, 몰드를 가열하여 슬리브를 수축시킨 후, 수축된 슬리브를 몰드에서 제거합니다. 몰드는 다음 사용 시까지 식힌 후 후드 내 데시케이터에 보관합니다. 스포이드를 사용하여 유리 몰드를 45도 각도로 기울인 뒤, 몰드를 천천히 회전시키면서 내부 루멘에 PGS 용액을 떨어뜨립니다.PGS 용액이 몰드의 벽면을 따라 흘러내리는지 확인하십시오. 건조한 부분이 있으면 PGS를 더 추가하십시오. 이제 흄 후드 내에서 THF를 최소 30분 동안 증발시키십시오. THF가 모두 증발하면, 진공 오븐에서 몰드를 경화시키십시오.하루 동안 경화시킨 후, 몰드를 상온으로 식히고 24 °C의 탈이온수에 수직으로 천천히 담급니다. 너무 빠르게 기울이면 기포가 발생하여 스캐폴드가 찢어질 수 있습니다. 몰드를 워터 배스로 조심스럽게 옮깁니다.실리콘 튜브를 사용하여 비스듬하게 배치하고, 히알루론산이 한 시간 동안 용해되도록 둡니다. 한 시간이 지난 후에도 히알루론산이 몰드에서 분리되지 않았다면, 몰드를 담근 상태에서 스패튤라를 사용하여 히알루론산을 양 끝에서 천천히 밀어낸 다음, 몰드를 천천히 흔듭니다. 이제 유리 몰드 내부에서 스캐폴드가 움직이지 않았는지 확인하고, 움직였다면 포셉으로 스캐폴드를 천천히 당겨 몰드에서 분리합니다.다음으로, 섬세한 스캐폴드를 완만하게 교반하는 탈이온수 배스로 조심스럽게 옮겨 염 입자를 침출시킵니다. 이 과정은 최소 3일이 소요되며, 매일 물을 교체해주어야 합니다. 염이 모두 침출되면, 각 스캐폴드를 탈이온수가 채워진 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮긴 후 드라이아이스 박스에서 1시간 동안 동결시킵니다. 동결된 원심분리 튜브의 캡을 열어 동결건조기에 넣고 3일 동안 건조합니다.동결 건조가 완료되면, 사용 전까지 지지체(scaffold)를 데시케이터에 보관하십시오. 먼저 지지체를 25~30 mm 길이로 자릅니다. 다음으로, 각 실리콘 고무 마개의 중앙 구멍에 PTFE 튜빙을 끼워 두 개의 마개를 준비합니다.그런 다음 수축 튜브(hs ring)를 1.5mm 길이로 자르고, 자른 튜브를 지지체(scaffold)의 한쪽 끝에 끼웁니다. 스토퍼에 연결된 PTFE 튜브 하나를 지지체의 동일한 끝부분으로 밀어 넣되, 지지체가 튜빙에 단단히 연결될 수 있도록 수축 튜브 아래로 약간 겹치게 밀어 넣은 후, 오븐에서 수축 튜브를 수축시키고 조립체가 상온으로 식을 때까지 기다립니다. 이제 바이오리액터 챔버 역할을 하는 50mm 폴리카보네이트 튜브를 지지체 위로 미끄러뜨려 끼우고 실리콘 고무 스토퍼의 내면에서 고정합니다.이전과 마찬가지로, 다른 PTFE 튜브와 스토퍼를 hs 링으로 스캐폴드의 반대쪽 끝에 고정하여 챔버를 완성합니다. 두 번째 스토퍼는 폴리카보네이트 튜브의 반대쪽 끝에 부착합니다. 다음으로, 스토퍼의 외면을 두 개의 알루미늄 합금 플레이트에 부착합니다.각 플레이트의 측면 구멍에 나사산 막대 두 개를 끼우고 손나사로 플레이트를 고정합니다. 스캐폴드를 바이오리액터에 부착합니다. 이제 두 개의 hs 링 사이의 거리인 각 스캐폴드의 가시 길이를 측정하고, 내부 표면적을 계산합니다.세포 파종을 위해, 오토클레이브를 사용하여 호일로 개별 포장한 챔버들과 바이오리액터 유닛의 각 부품을 멸균합니다. 멸균이 완료되면, 세포 배양 후드 내에서 바이오리액터를 조립합니다.연동 펌프를 사용하여 유체 회로에서 분당 1mm의 속도로 일련의 관류를 수행하여 스캐폴드를 전처리하고 세척합니다. 먼저 70% ethanol, 50% ethanol, 이어서 25% ethanol로 각각 1시간씩 세척합니다. 세 번의 ethanol 세척 후에는 PBS로 2시간 동안 세척합니다.마지막으로, 바이오리액터에 SMC 배양액을 24시간 동안 관류시키면 세포 파종 및 실험 준비가 완료됩니다. 이제 함께 제공된 원고의 지침에 따라, 제곱센티미터당 200만 개의 세포를 바이오리액터에 파종하고, 이후 21일 동안 튜브 내 배지를 교체하며 펌프 속도를 조정합니다. 점진적으로 구조물 내의 압력은 배양 첫날 약 4 mmHg에서 배양 2주 후 100 mmHg 이상으로 증가하며, 배양 3주 후에는 함께 제공된 원고에 명시된 대로 세포를 수확하여 분석을 준비합니다.이러한 관형 PGS 지지체는 솔트 퓨전(salt fusion)법으로 제작되었습니다. 주사전자현미경 분석 결과, 모든 지지체는 균일한 벽 두께를 가졌으며 단면에서 부분적인 결함이 발견되지 않았습니다. 모든 지지체의 내강 표면에서 무작위로 분포된 거대 기공과 미세 기공이 관찰되었습니다.세포 배양 후, 다층의 SMC는 유체 흐름 방향에 수직인 방향으로 성장했습니다. 또한, 세포와 DCM 단백질이 모든 PGS 구조체의 내강을 완전히 덮었습니다. 엘라스틴 자가형광 결과, 구조체의 내강 표면에서 원주 방향으로 조직된 탄성 섬유가 관찰되었습니다.이 영상을 시청한 후, 다공성 튜브형 지지체를 제작하고, 세포를 관찰하며, 사전 설계된 바이오리액터를 사용하여 지지체를 배양하는 방법을 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리 그룹은 심장 혈관 시스템의 생리 타악기의 스트레스가 implantable 작은 직경 혈관 이식을 다시 생성하기 위해 일일 생물 반응기 문화 시스템을 개발했습니다.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

이 프로토콜은 자신의 주변의 세포외 기질에서 발표가 되려면 여러 phenotypes로 차별화에 시달릴 수도 줄기 세포의 고유 기능을 활용에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 원고는 동시에 지방 파생 줄기 세포를 공동으로 차별화하는 데, PEG-섬유소와 콜라겐으로 구성되어 bilayered 히드로겔을 활용 모델, 우리의 설명 및 특성을...

ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

폴리 (글리세롤 도데)라는 이름의 새로운 생분해 성 고분자에서 새로운 디자인의 컬렉터를 통해 더 큰 예금 영역에 걸쳐 전기 방사 장 섬유 (PGD)의 합성 및 제조가보고되었다. 마우스 섬유는 다 능성 줄기 세포로부터 유도 된 세포의 성장을지지 할 수 있었다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate)

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

조직 공학을 위한 스캐폴드는 세포 틈새의 복잡한 생화학적, 생물물리학적 미시환경을 다시 요약해야 합니다. 여기에서는 계면 고분자 전해질 복합체 섬유를 플랫폼으로 사용하여 지속적인 생화학적 방출을 가진 복합 다중 구성 요소 고분자 골격을 만드는 방법을 보여줍니다.

생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판

폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) - -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

이 작업에서는 용융 혼합과 선택적 침출의 조합을 사용하여 폴리(젖산)/폴리에틸렌 글리콜(PLA/PEG) 스캐폴드를 준비했습니다. 본 명세서에서 논의된 방법은 다공성과 공극 크기를 모두 높게 제어함으로써 3층 스캐폴드를 개발할 수 있도록 허용했다. 기계적 특성은 또한 생리학적 환경에서 평가되었습니다.

손쉬운 및 환경 친화적 인 경로는 그레이드 기공 크기와 폴리 (젖산) 공사장 공중 발판을 제조

혈관 개장 및 생 분해성 고분자 비 계 기반 조직 설계 혈관의 자극 타악기와 실시간 문화에 비 계 저하의 과정을 감시 하는 비파괴 및 긴 기간에 대 한 단계 프로토콜 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다.

광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 분해 비 계 기반 조직 설계 혈관 개발의 비파괴 모니터링

여기에 제시된 것은 혈관 및 기타 관 구조의 조직 공학에 적합한 중공 비계의 한 단계 제작을 위한 사용이 간편한 코어/쉘, 3차원 생체 인쇄 설정입니다.

관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

식도 재건은 도전적인 절차이며, 식도 점막과 근육의 재생을 가능하게하고 인공 이식으로 이식 할 수있는 조직 공학 식도의 개발이 필요합니다. 여기에서는 스캐폴드 제조, 생물 반응기 재배 및 다양한 수술 기법을 포함한 인공 식도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편

이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.

유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

배우세요 생분해성 탄성체와 소금 융합법을 이용해 다공성 관형 스캐폴드를 제작하고, 혈관 평활근 세포를 배양하여 동맥 조직 공학용 기능성 조직을 개발하는 방법을 탐색하세요.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

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