Name: 마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 학습하세요 마이크로 볼륨 UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 dsDNA와 단백질을 정량하는 방법을. 극소량 샘플로도 높은 재현성과 정확성을 확보하여 생물학 연구의 처리량을 향상시킵니다.

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1. DNA의 Quantitation 절차 <ol><li> 악기를 켭니다. </li><li> PC의 바탕 화면에서 BioSpec - 나노 소프트웨어를 여십시오. </li><li> 간단한 핵산 - dsDNA 탭 (그림 1)를 클릭하십시오. </li><li> 소프트웨어 악기와 통신을 설정하고 초기화 순서를 실행합니다. 이것은 악기 사양에 따라 수행되었는지 확인합니다. </li><li> pathlength 슬라이더에서 0.7 또는 0.2 mm를 선택합니다. 이것은 pathlength를 선택하고 모든 계산이 선택 pathlength를 기반으로합니다. </li><li> BioSpec - 나노 소프트웨어 설치를 클릭 - Autowiping 설정에서 다음. 1 또는 2를 선택합니다. </li><li> 피펫 2 μL (0.7 mm)을 H 2 O 또는 받침대에 버퍼. </li><li> 빈 측정 공백 또는 F6을 누릅니다. 새로운 pathlength 때마다 그것이 공백을 녹화하는 데 필요한 선택됩니다. </li><li> 받침대에있는 샘플의 피펫 2 μL. </li><li> 소프트웨어 시작하거나 악기의 시작 버튼을 누르면 클릭하십시오. 어퍼 창이 샘플 비말 접촉을 이동합니다. 제논 섬광을 볼 수 있습니다. </li><li> 재현성을 결정하기 위해 동일한 샘플에게 3 번 반복합니다. </li><li> 기록된 모든 데이터는. 버드 파일로 저장됩니다. </li><li> . PDF 또는. csv 파일로 저장하려면 PDF / CSV 또는 F9 저장을 클릭하십시오. 결과는 또한 저장 탭에서 적절한 선택을 사용하여. csv 파일로 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 단백질 Quantitation을위한 프로토콜 <ol><li> 단백질 Quantitation 탭을 선택합니다 (그림 2). </li><li> 알려진 경우, 멸종 계수 e280을 입력합니다. </li><li> e280이 알려져 있지 않은 경우가 e280Calc를 사용하여 계산합니다. </li><li> pathlength 슬라이더에서 0.7 또는 0.2 mm를 선택합니다. </li><li> 설정 - Autowiping 설정을 클릭합니다. 2 선택하거나 위. </li><li> 피펫 3 μL (0.2 mm)을 H 2 O 또는 받침대에 버퍼. </li><li> 빈 측정 공백 또는 F6을 누릅니다. </li><li> 페데 스탈에서 단백질 샘플의 피펫 3 μL. </li><li> 소프트웨어 시작하거나 악기의 시작 버튼을 누르면 클릭하십시오. </li><li> 재현성을 결정하기 위해 동일한 샘플에게 3 번 반복합니다. </li><li> 기록된 모든 데이터는. 버드 파일로 저장됩니다 </li><li> . PDF 또는. csv 파일로 저장하려면 PDF / CSV 또는 F9 저장을 클릭하십시오. </li></ol> 3. 대표 결과 : 1. DNA의 Quantitation에 대한 검색 결과 그림 3은 전형적인 이중 좌초된 DNA 샘플에 대한 측정에서 데이터를 보여줍니다. 농도와 계산 OD 280분의 260 비율도 표시됩니다. 그림 4는 DNA의 quantitation에 대한 재현성 테스트 결과가 포함되어 있습니다. 그림 3 및 4 보여주는 결과의 데이터는 0.26 %의 낮은 상대 표준 편차에서 분명 같은 높은 재현할 수 있습니다. 주 1 : 의 DNA quantitation의 부정확은 자외선 영역에서 흡수 수 있습니다 버퍼 구성 요소의 존재에서 발생할 수 있습니다. 그것은 또한 동질적인 샘플 솔루션을 사용해야합니다. pipetted되는 샘플의 양이 어떤 거품의 도입없이 정확한 볼륨만이 1-2 μL, 조심 pipetting이므로 필요합니다. 2. 단백질 Quantitation에 대한 검색 결과 그림 5는 BSA에 대한 단백질 농도 분석을 나타냅니다. μg / ML 단백질 농도는 e280 가치에 기반을두고 있습니다. 그림 6은 재현성 분석을 보여줍니다. DNA뿐만 아니라 단백질을 위해뿐만 아니라 - 그것은 BioSpec - 나노 정확하게 농도를 측정하는 것을 0.51 %의 상대 표준 편차에서 분명하다. 2 주 : 단백질 농도에 영향을 미치는 요인 단백질의 정확한 농도 결정은 산도, 버퍼, 온도, 또는 첨가제에 의한 불안정성에서 최소한의 효과가있을 경우 가능합니다. 대부분의 단백질 정화 처리의 다양한 단계를 통해 이뤄지는, 따라서 그것은 단백질 비말 형성에 방해가 될 수있는 계면 활성제 또는 다른 첨가제를 포함할 수도 있습니다. 이러한 샘플은 5mm의 pathlength의 석영 세포를 사용하면 매우 좋습니다. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 더블 좌초의 DNA quantitation를위한 그림 1. Analyte 선택 창 <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 비 표시 단백질 quantitation에 대한 그림 2. Analyte 선택 창 <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> DNA의 quantitation를위한 그림 3. 대표 데이터 <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> DNA의 quantitation를위한 그림 4. 재현성 데이터 <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 단백질 quantitation를위한 대표 데이터 <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000"> 그림 6. 단백질 quantitation에 대한 재현성 데이터

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran이 박사는이 문서에 등장하는 악기를 만드는 Shimadzu의 직원입니다.

BioSpec - 나노는 등 일관성없는 결과와 지루한 수동 노동의 DNA quantitation 방법 고유의 현재의 문제를 해결하기 위해 설계되었습니다. 각 측정 경험 분자 생물학이 분 3-6에 대한 여러 샘플을 분석할 수 있도록 불과 3 초 정도 걸립니다. 독특한 와이퍼 기능 측정의 처리량을 향상뿐만 아니라, 또한 측정 사이의 무시할 수 carryover의 결과로, 받침대의 수동 청소에 대한 필요성을 제거합니다. 또한, 1000 NG / μL를 포함하는 DNA 샘플에 대한 단 2 잎사귀를 사용하여 테스트, carryover을 표명 미만 2 μL / NG. 5mm의 pathlength 세포의 가용성 희석 핵산과 단백질 샘플을 분석하는 옵션을 제공하며 다른 응용 프로그램이 악기의 사용을 확장합니다.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>송아지 흉선 DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>우혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

핵산 quantitation 절차는 지난 30 년간 크게 고급 있습니다. 점점 더 많은, 분자 생물학 자들이 실험에 대한 핵산 샘플 일관성있는 작은 볼륨 분석을 필요로합니다. BioSpec - 나노는 전문 광학과 민감한 PDA 검출기를 통해 현재의 DNA quantitation 방법 고유의 부정확, 비 재현할 결과의 문제에 잠재적인 솔루션을 제공합니다. BioSpec - 나노도함으로써 광섬유 요소 및 수동 청소, 지루한 반복하고, 일관성없는 배치를 제거, 설치, 측정, 및 세척이 장비에 의해 수행되는 이러한 자동화된 기능이 있습니다. 본 연구에서는, 데이터는 DNA와 단백질뿐만 아니라 측정 재현성 및 정확도에의 부량에 제공됩니다. 자동 샘플 연락처 및 빠른 스캔 뛰어난 처리량의 결과, 3 초 안에 측정이 가능합니다. 데이터 분석 소프트웨어의 내장 기능을 사용 수행됩니다. DNA 농도를 계산에 사용되는 공식은 다음과 같습니다 : 샘플 농도 = DF ° (OD260 - OD320) · NACF (1) = 샘플 희석 계수와 NACF = 핵산 농도 계수 어디 DF. 핵산 농도 계수는 1을 선택 analyte에 따라 설정됩니다. 단백질 농도 결과는 μg / ML 또는 각각 e280 및 분자량 값을 입력하여 몰스 / L로 표현할 수있다. 티르, TRP 그리고 시스테인 (SS 결합)에 대한 잔류 값이 e280Calc 탭에 입력하는 경우, 흡광 계수 값은 e280으로 계산됩니다 = 5,500 X (TRP의 잔류물) + 1490 X (티르의 잔류물) + 125 X (시스테인 SS 결합) . e280 값은 농도 계산을위한 소프트웨어에 의해 사용됩니다. 핵산과 단백질의 농도 결정뿐만 아니라, BioSpec - 나노는 다른 많은 analytes에 대한 매우 마이크로 볼륨 분광 광도계 또는 5mm의 pathlength 세포를 사용하여 표준 분광 광도계로 사용할 수 있습니다.

의사 소통이 dsDNA와 단백질 quantitation에 대한 BioSpec - UV - VIS 나노 분광 광도계의 정확성과 재현성에 대한 데이터를 제공합니다. 자동 닦는 함수가 처리량과 더 정확한 결과를 위해 최소한의 carryover 결과를 개선하는 동안에도 초소형 볼륨 (1-2 패), 재현성이 우수합니다.

핵산 정량 분석 절차는 지난 30년 동안 크게 발전해 왔습니다. 분자생물학자들은 점점 더 일관된...

본 절차의 전반적인 목표는 마이크로 볼륨 분광광도계를 사용하여 핵산과 단백질의 농도를 정확하고 재현성 있게 측정하는 것입니다. 이는 먼저 측정 대상 샘플에 적합한 광경로 길이를 선택함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 블랭크를 측정하는 것입니다.다음으로, DNA 또는 단백질 샘플을 측정합니다. 프로시저의 마지막 단계는 데이터를 PDF 또는 CSV 형식으로 저장하는 것입니다. 결과적으로, DNA와 단백질에 대해 재현성이 매우 높은 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법을 통해 정량 분석을 빠르고 정확하게 수행할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 속도가 빠르고 정밀하며 재현성이 높다는 점입니다. DNA 정량 분석 절차를 시작하려면 BIOS spec nano 분광광도계를 켭니다.PC 데스크톱에서 BIOS spec nano 소프트웨어를 실행하십시오. simple nucleic acid D-S-D-N-A 탭을 클릭하십시오. 소프트웨어가 기기와의 통신을 설정하고 초기화 시퀀스를 실행합니다.이를 통해 기기가 사양에 따라 작동하는지 확인할 수 있습니다. 다음으로 광경로 길이를 선택합니다. 광경로 길이 슬라이더에서 설정하십시오.마이크로리터 부피의 샘플을 위해 세 가지 옵션을 사용할 수 있습니다. 0.2 mm 또는 0.7 mm를 사용할 수 있으며, 희석된 샘플의 경우 5 mm 광로 길이를 가진 큐벳을 사용하는 옵션이 있습니다.본 시연에서는 2 µL 샘플을 측정하기 위해 0.7 mm를 선택합니다. 모든 계산은 선택한 광경로 길이를 기준으로 이루어집니다. 다음으로 소프트웨어에서 setup 탭을 클릭하고 auto wiping setup을 선택하십시오.한 번 닦아낼 때마다 하나씩 선택하십시오. 시료 측정 전 또는 새로운 광경로 길이를 선택할 때마다 블랭크 측정이 필요합니다. 0.7 millimeter 광경로 길이의 경우, 페데스탈 위에 2 µL의 물 또는 버퍼를 피펫팅하십시오. 블랭크 측정을 위해 blank를 클릭하십시오.상단 윈도우가 이동하여 시료 액적과 접촉하며 제논 플래시가 관찰됩니다. 측정이 완료되면 와이퍼가 자동으로 시료를 닦아냅니다. 이제 시료 측정 가능 상태가 됩니다.미용해 입자가 존재할 경우 재현성 없는 데이터가 도출되므로 균질한 시료 용액을 사용하는 것이 중요합니다. 기포 유입을 방지하기 위해 시료 2 µL를 조심스럽게 흡입한 후, 피펫 팁에서 페데스탈 위로 시료를 균일하게 분주하십시오.기기의 시작 버튼을 누릅니다. 이전과 마찬가지로 상단 윈도우가 이동하여 샘플 액적에 접촉하며, 제논 플래시가 관찰됩니다. 재현성을 확인하기 위해 동일한 샘플을 3회 반복 측정하며, 기록된 모든 데이터는 자동으로 BUD 파일로 저장됩니다. PDF 또는 CSV 파일로 저장하려면 save P-D-F-C-S-V를 클릭하십시오.저장 탭에서 적절한 항목을 선택하여 결과를 CSV 파일로 저장할 수 있습니다. 단백질 정량은 absorbance two 80 법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 단백질 정량을 하려면 단백질 정량 탭을 선택하십시오.소멸 계수 epsilon 280을 알고 있다면 입력하십시오. Epsilon 280을 모르는 경우, Epsilon 280 calc를 사용하여 계산하십시오. path length 슬라이더에서 0.2 millimeters를 선택하여 3 µL 샘플을 측정하십시오. 다음으로 소프트웨어에서 setup 탭을 클릭하고 auto wiping setup을 선택하십시오. 샘플의 오염을 방지하고 정확한 측정값을 얻기 위해 2회 세척하도록 2를 선택하십시오.피펫의 블랭크를 측정하려면 3 µL의 물 또는 완충액을 페데스탈 위에 분주한 후, 블랭크 측정 버튼을 클릭하십시오. 다음으로, 3 µL의 단백질 샘플을 페데스탈 위에 조심스럽게 분주합니다. 샘플 측정을 시작할 때 기포가 유입되지 않도록 주의하며, 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하거나 기기의 시작 버튼을 누르십시오.재현성을 확인하기 위해 동일한 샘플을 세 번 반복 측정합니다. 다음은 전형적인 이중 가닥 DNA 샘플의 측정 데이터입니다. DNA 농도를 계산하는 공식은 샘플 농도 = DF × (OD 260 - OD 320) × NACF이며, 여기서 DF는 샘플 희석 배수이고 NACF는 핵산 농도 계수입니다.핵산 농도 계수는 선택한 분석물에 따라 설정됩니다. 계산된 핵산 농도와 OD 260/280 비율이 표시됩니다. 이 표에는 DNA 정량의 재현성 테스트 결과가 포함되어 있습니다.종합적인 데이터는 0.26%라는 낮은 상대 표준 편차에서 알 수 있듯이 결과의 재현성이 매우 높음을 보여줍니다. BSA에 대한 단백질 농도 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 밀리리터당 마이크로그램 단위의 단백질 농도는 Epsilon two 80 값에 근거합니다. 마지막으로, 이 표는 단백질 정량의 재현성 분석 결과를 보여줍니다.0.51%의 상대 표준 편차는 BIOS spec nano가 DNA뿐만 아니라 단백질의 od 또한 정확하게 측정함을 나타냅니다. 숙련되면 1분 이내에 여러 개의 시료를 분석할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

질량 분석계는 큰 단백질 단지를 분석하는 데 유용한 도구로 입증되었습니다. 이 방법은 멀티 - subunit 어셈블리의 구성, stoichiometry 및 전반적인 아키텍처에 대한 통찰력을 수 있습니다. 여기, 우리가 설명하는, 단계 단계의 구조 질량 분광법 분석을 수행하고, macromolecular 구조를 특성화하는 방법.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

전통적인 핵산 quantitation 방법론을 실천하고 효율적인 대안으로 NanoDrop microvolume 시스템의 사용은 두 microvolume 핵산 quantitation 프로토콜의 시범을 통해 설명합니다.

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nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

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