의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

이 프로시저의 전반적인 목표는 성장 인자 신호 전달에 따른 단백질의 세포 내 국소화 변화를 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 Xenopus 초기 배아의 동물극에 RFP와 신호 수용체 FRIZZLED 8을 인코딩하는 RNA를 주입합니다. 그다음 전극 implanted 배아 또는 배아 저온 절편을 준비하여 면역 염색을 수행합니다.

마지막으로, 면역 염색된 세포를 형광 현미경으로 촬영합니다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 소기관 국소화가 배아 신호 전달 경로에 어떻게 의존하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 diverse가 FRIZZLED eight 수용체에 의해 중심체에서 세포막으로 보충된다는 것을 입증합니다.

이 방법은 연구자가 xenopus 배아를 이용하여 생체 내(in vivo) 신호 전달 단백질의 세포 내 위치를 시각화할 수 있게 해줍니다. 이는 신호 전달의 공간적 조절 및 세포 우선순위 메커니즘 연구와 같이 발생학 및 세포 생물학의 근본적인 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 체외 수정 과정을 시작하려면, 인간 난포 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)을 주입한 암컷 개구리로부터 난자를 얻으십시오.

실험 12시간 전에 1X Marx modified ringer solution 0.5~1mL를 알 위에 첨가하고, 절제된 정소의 작은 조각을 이용해 체외 수정을 시킵니다. 2~3분 후, 0.1 XMMR로 염 농도를 낮추어 정자의 운동성을 활성화합니다. 20분 동안 배양합니다.

수정 후, 난자는 동물극이 위로 향하도록 배치합니다. MMR 용액을 3% cysteine 수용액으로 교체하여 5분 동안 처리함으로써 난자의 젤 외피를 제거합니다. 난자를 0.1 XMMR로 3회 세척합니다.

2~4세포기까지 13 °C에서 배양합니다. 그 후 배아를 미세주입용 0.5 XMMR이 포함된 3% fi로 옮깁니다.

M message M machine 키트를 사용하여 선형화된 DNA 템플릿으로부터 RNA를 합성하고, RNA-free water로 희석하여 0.1 to 1 µg/µL 농도로 맞춥니다. 다양한 RFP, 막 마커 GFP CX 및 FRIZZLED 8의 RNA는 주입당 0.1 to 1 ng씩 사용합니다. 주입 전, 니들 풀러(needle puller)와 니들 그라인더(needle grinder)를 사용하여 모세관으로 주입용 바늘을 제작합니다.

주입을 위해 각 바늘을 물로 교정하여 1회 주입 시 10리터의 액체가 배출되도록 합니다. 배아를 3%fial 0.5 XMMR의 커다란 방울 위에 플라스틱 접시 위에 놓습니다. 정밀한 shige 마이크로 인젝터를 사용하여 주입 바늘에 1µL의 RNA 용액을 흡입합니다.

2세포기 배아의 두 동물극에 RNA 10 nanoliters를 각각 주입합니다. 주입된 배아를 12-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 초기 낭배기에 도달할 때까지 13 °C에서 배양합니다.

위장 단계(gastro stage) 배아를 1% aeros가 코팅된 6cm 플라스틱 디쉬 내의 0.6 XMMR 용액으로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 난황막(vitel membrane)을 수동으로 제거합니다. 그 후 tsin 니들과 헤어 루프(hair loop)를 사용하여 배아에서 외배엽 절편(ectodermal explants)을 절제합니다.

PBS에 희석된 3.7% formaldehyde에서 30분 동안 고정합니다. X explan을 PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 핵을 염색하기 위해, 세 번째 세척 단계에 davi를 추가합니다.

다음으로, X explan의 안쪽 무색 부위가 대물렌즈를 향하도록 두 개의 스카치테이프 조각 사이에 배치하여 유리 슬라이드에 고정합니다. 마운팅 용액을 20 µL씩 2~3방울 가합니다. 그 위에 커버슬립을 덮습니다.

주입된 배아를 냉동 절편화하여 세포 내 형광 단백질의 분포를 시각화하고 특정 항체로 공동 염색할 수 있습니다. Stage 10에서, 4 mL 유리 바이알에 담긴 고정액으로 상온에서 1~2시간 동안 배아를 고정합니다. 그다음 PBS로 세척한 후, 동일한 바이알 내의 15% 어류 젤라틴, 15% sucrose 용액에 배아를 포매합니다.

다음 날, 포매된 배아를 플라스틱 몰드로 옮깁니다. 드라이아이스 위에서 포매된 배아를 빠르게 냉동시킵니다. 그 다음 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 동결 절편을 제작합니다.

외배엽 이식물에 대해 설명한 것과 동일한 방법으로 절편에 면역형광 염색을 수행하고, 슬라이드를 마운팅한 후 횡단면 배아를 이미지화합니다. 적절한 필터가 장착된 Zeiss Axio plan 형광 현미경을 사용하여 이미지를 수집하고, X 평면 내의 특정 Z 평면을 식별하여 이미지화합니다. 이 그림에서 ersin은 외배엽 세포의 중심체에 국소화되어 있지만, trans는 세포막으로 전위되었습니다.

Frizzled eight에 반응하여, cex GFP는 세포막을 녹색으로 표시합니다. Diverse in RFP는 적색으로 나타나며, DPI로 표시된 핵은 청색으로 나타납니다. 배아 냉동 절편에서 Diverse in RFP는 Frizzled eight에 의해 세포막으로 모집됩니다.

Gamma tubulin은 중심체 마커입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 하위 해상도에서의 단백질 도킹 권한 부여 및 신호 전달 과정 연구에 있어 XUS 배아와 배아 세포의 유용성에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.