Name: 의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답 Ectoderm (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 학습하세요 Xenopus 초기 배아에 RNA를 주입하여 형광 단백질의 아세포 내 분포 변화를 관찰하는 방법을. 성장 인자 신호에 반응하여 단백질이 중심체에서 세포막으로 이동하는 과정을 형광 현미경으로 시각화하여 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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Xenopus 계란 1.에서는 체외의 수정 <ol><li> 실험 전에 인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (400 단위 / 개구리) 12 시간과 함께 주입했다 암컷 개구리의 알을 얻을 수 있습니다. </li><li> 1 X 마크의 변경 링어 달걀 솔루션 (MMR) 10 해부 testis의 작은 조각으로 체외에서 그들을 비옥의 소량의 (0.5-1 ML)로 플레이스 계란. 2-3 분 후, 계란의 전체 표면을 커버하기 위해 0.1 X MMR을 추가합니다. HCL (수산화 나트륨과 산도 8 조정) - 20 분, 달걀 젤리 코트는 3 % 시스테인에 의해 제거됩니다. 계란은 주사에 대한 (13 ° C) 0.1 X MMR 세 번와 세탁과 감기 인큐베이터에 남아 있습니다. </li><li> 수정된 달걀은 2-4 셀 단계 개발에 사용할 수 있습니다. 주사 들어, 배아는 3 % Ficoll, 0.5 X MMR을 포함하고있는 솔루션으로 전송됩니다. </li></ol> 2. RNA의 Microinjection <ol><li> RNAS는 mMessage mMachine 키트 (앰비온)를 사용하여 선형 DNA 템플릿에서 합성 및 0.1-1 μg / μl의 주식 농도에서 RNase 무료 물로 희석하고 있습니다. 주사에 대한 RNAS 최적의 복용은 파일럿 실험에서 결정됩니다. Diversin - RFP, 멤브레인 마커 GFP - CAAX 8 Frizzled에 대한 RNAS는 사출 당 0.1-1 NG에 사용됩니다. </li><li> 주사 바늘은 바늘 연삭기와 다음 모세관과에서 바늘 풀러와 함께 준비하고 있습니다. 주입하기 전에 각각의 주사 바늘을 주입 액체 당 10 NL를 꺼내 물로 교정입니다. </li><li> 주사 들어, 배아는 3 % Ficoll, 0.5 X MMR의 큰 비말에 플라스틱 접시에 게재됩니다. RNA 솔루션 중 하나 microliter은 Narishige microinjector과 주사 바늘로 빨려입니다. RNA 10 NL은 8 세포 배아 2-3 회 동물 blastomeres로 주입됩니다. 주입 배아는 12 잘 판의 우물에 전송됩니다. </li></ol> 3. 준비 Ectodermal의 Explants <ol><li> 주입된 배아가 초기 gastrula 단계에 도달하면, 그들은 1퍼센트 아가로 오스와 코팅 3cm 플라스틱 접시에 0.6 X MMR 솔루션으로 전송됩니다. Vitelline 막는 포셉 한 쌍의와 함께 수동으로 제거됩니다. Ectodermal의 explants은 텅스텐 바늘과 hairloop를 사용하여 배아에서 excised 수 있습니다. </li><li> Ectodermal의 explants는 유리관에 양도와 인산 3.7 %의 포름 알데히드와 함께 고정 30 분 (PBS) 호수 버퍼입니다. 고정 explants는 PBS 세 번 (10 분마다)로 세탁합니다. DAPI는 핵을 얼룩이 세 번째 세척에 포함되어 있습니다. </li><li> Explants은 슬라이드 유리에 장착된 있습니다. 스카치 테이프의 두 스트립은 슬라이드에 붙어 있으며, explants는 두 스트립 사이에 위치하고 있습니다. explants의 외부 표면에 색소 때문에, explants의 안쪽은 현미경의 목표를 직면한다. 장착 솔루션 11 (PBS 25 MG / ML DABCO, 변색 방지 시약을 포함하여 70 %의 글리세롤)의 2-3 20 μl 방울을 추가합니다. 위에 coverslip 놔. </li></ol> 4. 형광 현미경 Explants의 이미징 <ol><li> 샘플은 적절한 필터를 자이스 혈구 Axioplan 형광 현미경으로 볼 수 있습니다. </li><li> 이미지가 여러 독립적인 explants에서 특정 비행기를 시각화하기 위해 Apotome 첨부 파일이 촬영됩니다. </li></ol> 5. Cryosectioning Cryosectioning는 세포 및 immunostaining에 대한 더 적용에 형광 단백질의 분포를 시각적으로 대안적인 방법입니다. 10 단계에서 배아는 덴트의 정착액 (20 % DMSO, 80 % 메탄올)와 1-2시간에 대한 해결되었습니다 PBS로 씻어하고, 15 % 생선 gelatin/15 %의 자당 솔루션 11 내장. 임베디드 배아는 빠르게 드라이 아이스에 냉동하고 cryosections는 Leica 그라 이오 스탯에 생성됩니다. 크로스 섹션 주입 RNAS 및 번역된 단백질 제품을 상속 ectodermal 세포를 포함합니다. 섹션 형광 보유 및 특정 항체와 immunostained 후 형광과 복합 보조 항체로 분류하실 수 있습니다. 핵은 DAPI 물들일 수 있습니다. 설치 미디어는 위에서 설명한 것과 동일합니다. 위에서 설명한 영상을 수행할 수 있습니다. 6. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Frizzled 수용체는 세포막에 Diversin을 모집. Frizzled 8 (Xfz8) 및 사업부 - RFP의 RNAS을 표현 Ectoderm 세포 대신의 세포막에서 사업부 - RFP를 공개 centrosome합니다 (G - tubulin의 공동 얼룩으로 나타났다). 실험의 계획은 상단에, 전형적인 단면이 표시됩니다.

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 Diversin의 subcellular 지방화를 특징으로 위의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 동물 극 explants에서 Diversin - RFP는 핵 옆에 발견되었으며 cryosections (그림 1)에서 G - tubulin, centrosomal 마커와 colocalized. 단백질의 subcellular 지방화가 확인되면, 삭제 구조는 단백질 도메인이 필요하고 subcellular 지방화 충분되는 구축 생성할 수 있습니다. 이 방법을 사용 Diversin의 centrosomal 현지화 도메인은 중간에 매핑되었습니다과 단백질의 카르복시 - 터미널 도메인에 코일 - 코일 모티브 8 포함하는 둘 다. 동일한 프로토콜은 단백질 지방화는 신호에 대한 응답으로 변경되는, 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 Wnt 분비 단백질은 세포막에 인접한 작은 반점이있는 구조로 사업부 - RFP를 변경하는 행위 발견, 반면 세포막 패치 (그림 1) Fz8 모집 ...

의 형광 단백질의 편광 translocation xenopuswnt 신호에 응답> ectoderm

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

세포 극성 동적으로 배아 개발 1, 2 중 내장 및 외부 양쪽 요인에 의해 규제됩니다 진핵 세포의 기본 속성입니다. 이 규정에 관련된 신호 경로 중 하나는 embryogenesis 동안 여러 번 사용하고 인간의 질병에 3, 4, 5에 중요합니다 Wnt 경로입니다. 이 경로의 여러 분자 구성 요소는 coordinately 공간 제한 방식으로 신호를 통제하지만 기본 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. Xenopus 배아 상피 세포가 다양한 신호 단백질의 subcellular 지방화를 공부하는 우수한 시스템입니다. 형광등 융합 단백질은 RNA의 microinjection에 의해 Xenopus의 배아에서 표현, ectodermal의 explants 준비하고 단백질 지방화는 epifluorescence에 의해 평가됩니다. 이 실험 프로토콜에서 우리는 Diversin, 신호 및 세포 극성 결정 6, 7에 연루되어 세포질 단백질의 subcellular 지방화는 Wnt 신호 전달 8 공부 Xenopus ectodermal 세포의 시각이다 방법에 대해 설명합니다. Wnt 리간드 또는 Frizzled 수용체의 Coexpression 붉은 형광 단백질, RFP와 함께 융합 Diversin의 유통을 바꿀지도 모르겠어, 그리고 편광 패션 8, 9에있는 세포막에 모집. 이 전 생체내 프로토콜은 신호의 공간적 제어 손상 조직과는 다른 그리고 더 많은 어려운 분석되는 교양 포유 동물 세포의 체외 연구에서에 대한 유용한 이외해야합니다.

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

세포 극성은 진핵세포의 기본적 특성으로, 배아 발달 과정 동안 내인성 및 외인성 요인 모두에 의해 역동적으로 조절됩니다.

이 프로시저의 전반적인 목표는 성장 인자 신호 전달에 따른 단백질의 세포 내 국소화 변화를 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 Xenopus 초기 배아의 동물극에 RFP와 신호 수용체 FRIZZLED 8을 인코딩하는 RNA를 주입합니다. 그다음 전극 implanted 배아 또는 배아 저온 절편을 준비하여 면역 염색을 수행합니다.마지막으로, 면역 염색된 세포를 형광 현미경으로 촬영합니다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 소기관 국소화가 배아 신호 전달 경로에 어떻게 의존하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 diverse가 FRIZZLED eight 수용체에 의해 중심체에서 세포막으로 보충된다는 것을 입증합니다.이 방법은 연구자가 xenopus 배아를 이용하여 생체 내(in vivo) 신호 전달 단백질의 세포 내 위치를 시각화할 수 있게 해줍니다. 이는 신호 전달의 공간적 조절 및 세포 우선순위 메커니즘 연구와 같이 발생학 및 세포 생물학의 근본적인 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 체외 수정 과정을 시작하려면, 인간 난포 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)을 주입한 암컷 개구리로부터 난자를 얻으십시오.실험 12시간 전에 1X Marx modified ringer solution 0.5~1mL를 알 위에 첨가하고, 절제된 정소의 작은 조각을 이용해 체외 수정을 시킵니다. 2~3분 후, 0.1 XMMR로 염 농도를 낮추어 정자의 운동성을 활성화합니다. 20분 동안 배양합니다.수정 후, 난자는 동물극이 위로 향하도록 배치합니다. MMR 용액을 3% cysteine 수용액으로 교체하여 5분 동안 처리함으로써 난자의 젤 외피를 제거합니다. 난자를 0.1 XMMR로 3회 세척합니다.2~4세포기까지 13 °C에서 배양합니다. 그 후 배아를 미세주입용 0.5 XMMR이 포함된 3% fi로 옮깁니다.M message M machine 키트를 사용하여 선형화된 DNA 템플릿으로부터 RNA를 합성하고, RNA-free water로 희석하여 0.1 to 1 µg/µL 농도로 맞춥니다. 다양한 RFP, 막 마커 GFP CX 및 FRIZZLED 8의 RNA는 주입당 0.1 to 1 ng씩 사용합니다. 주입 전, 니들 풀러(needle puller)와 니들 그라인더(needle grinder)를 사용하여 모세관으로 주입용 바늘을 제작합니다.주입을 위해 각 바늘을 물로 교정하여 1회 주입 시 10리터의 액체가 배출되도록 합니다. 배아를 3%fial 0.5 XMMR의 커다란 방울 위에 플라스틱 접시 위에 놓습니다. 정밀한 shige 마이크로 인젝터를 사용하여 주입 바늘에 1µL의 RNA 용액을 흡입합니다.2세포기 배아의 두 동물극에 RNA 10 nanoliters를 각각 주입합니다. 주입된 배아를 12-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 초기 낭배기에 도달할 때까지 13 °C에서 배양합니다.위장 단계(gastro stage) 배아를 1% aeros가 코팅된 6cm 플라스틱 디쉬 내의 0.6 XMMR 용액으로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 난황막(vitel membrane)을 수동으로 제거합니다. 그 후 tsin 니들과 헤어 루프(hair loop)를 사용하여 배아에서 외배엽 절편(ectodermal explants)을 절제합니다.PBS에 희석된 3.7% formaldehyde에서 30분 동안 고정합니다. X explan을 PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 핵을 염색하기 위해, 세 번째 세척 단계에 davi를 추가합니다.다음으로, X explan의 안쪽 무색 부위가 대물렌즈를 향하도록 두 개의 스카치테이프 조각 사이에 배치하여 유리 슬라이드에 고정합니다. 마운팅 용액을 20 µL씩 2~3방울 가합니다. 그 위에 커버슬립을 덮습니다.주입된 배아를 냉동 절편화하여 세포 내 형광 단백질의 분포를 시각화하고 특정 항체로 공동 염색할 수 있습니다. Stage 10에서, 4 mL 유리 바이알에 담긴 고정액으로 상온에서 1~2시간 동안 배아를 고정합니다. 그다음 PBS로 세척한 후, 동일한 바이알 내의 15% 어류 젤라틴, 15% sucrose 용액에 배아를 포매합니다.다음 날, 포매된 배아를 플라스틱 몰드로 옮깁니다. 드라이아이스 위에서 포매된 배아를 빠르게 냉동시킵니다. 그 다음 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 동결 절편을 제작합니다.외배엽 이식물에 대해 설명한 것과 동일한 방법으로 절편에 면역형광 염색을 수행하고, 슬라이드를 마운팅한 후 횡단면 배아를 이미지화합니다. 적절한 필터가 장착된 Zeiss Axio plan 형광 현미경을 사용하여 이미지를 수집하고, X 평면 내의 특정 Z 평면을 식별하여 이미지화합니다. 이 그림에서 ersin은 외배엽 세포의 중심체에 국소화되어 있지만, trans는 세포막으로 전위되었습니다.Frizzled eight에 반응하여, cex GFP는 세포막을 녹색으로 표시합니다. Diverse in RFP는 적색으로 나타나며, DPI로 표시된 핵은 청색으로 나타납니다. 배아 냉동 절편에서 Diverse in RFP는 Frizzled eight에 의해 세포막으로 모집됩니다.Gamma tubulin은 중심체 마커입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 하위 해상도에서의 단백질 도킹 권한 부여 및 신호 전달 과정 연구에 있어 XUS 배아와 배아 세포의 유용성에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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