Name: 라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 학습하세요 라이브 랫 두피 뉴런에서 형광 탐침 TMRM과 H2D CFDA를 이용한 미토콘드리아 막 전위 및 활성산소종 측정 방법을. 공초점 현미경 실시간 이미징으로 신경세포 기능과 산화 스트레스를 정량 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 보건원 (JCB에 K22NS050137)에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 <ol><li> 대뇌 피질의 뉴런은 고립과 앞에서 설명한 기법과 폴리 - D - 라이신과 laminin 1 코팅 유리 바닥 (MatTek 공사, 애쉬 랜드, MA)와 문화 요리에 도금을 사용하여 재배하고 있습니다. </li></ol> 2. 형광 프로브 TMRM와 H 2 DCF - DA에 대한 재고 솔루션을 준비 <ol><li> 무수 dimethylsulfoxide 1 ML에 TMRM의 5.0 MG를 해소하여 TMRM의 10 MM 재고 솔루션을 준비합니다. 소용돌이 1 분 동안. 그런 다음, aliquots을하고 -20 ° C에서 그들을 저장, 빛으로부터 보호하고, 1 개월 이내에 사용합니다. </li><li> 다음 무수 DMSO 1 ML에서 H 2 DCF - DA의 4.87 밀리그램을 용해하여 H 2 DCF - DA의 10 MM 재고 솔루션을 준비합니다. 마찬가지로, 와동 1 분 동안. 그런 다음, aliquots을하고 -20 ° C에서 그들을 저장, 빛으로부터 보호하고, 일주일 이내에 사용합니다. </li></ol> 3. TMRM 및 H 2 DCF - DA로 로딩 쥐 대뇌 피질 뉴런 TMRM는 mitochondria의 매우 부정적인 요금 내부에 축적 potentiometric, 셀 투과 형광 표시기입니다. mitochondrial TMRM의 자동 담금질을 피하기 위해 TMRM의 낮은 농도 (10-50 nm의 범위)를 사용하는 것이 중요합니다. 그런 다음, TMRM의 형광 신호는 내부 mitochondrial 멤브레인 전체 ΔΨm 직접 공동과 관련이있을 수 있습니다. ΔΨm의 손실이 형광 강도의 손실 발생 mitochondria에서 누출 TMRM됩니다. H 2 DCF - DA는 세포 - 세포 투과 esterases하여 DCF - DA로 변환 프로브 및 형광 DCF에서의 산화 결과입니다. 높은 로딩 농도도 H 2의 부재 O 2 DCF 형광의 채도가 발생할 수 있으므로 DCF - DA는 20-10 μm의 그것 사이의 범위 H 2의 최종 농도는 서로 다른 뇌 영역에서 파생된 뉴런에서 경험적으로 테스트해야합니다. 모든 내생이나 외인성 산화제의 존재 (예 : 질산 산화, 과산화수소)는 DFC 형광 강도를 증가합니다. 아래, 우리는 TMRM와 H 2 DCF - DA와 쥐의 대뇌 피질의 뉴런 로딩을위한 프로토콜을 제공합니다. <ol><li> 결핵 : : 145 MM NaCl, 5 MM KCl, 10 MM 포도당 1.5 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 10 TMRM와 쥐 대뇌 피질의 뉴런을로드하려면, 먼저 Tyrode의 버퍼 (텍스트 오버레이와 교양 뉴런에게 3 회 ​​씻어 MM의 HEPES;) NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다. 그런 다음, TB의 1 / 1000 회 10 MM TMRM 주식을 diluting하여 TMRM 20 NM를 준비하고 TB 1 ML 당 희석 TMRM 2 μl를 추가합니다. 상온에서 어두운 곳에 45 분 TMRM과 뉴런을 품어. 45 분 후, 현미경의 무대에 문화 접시를 탑재하고 영상을 시작합니다. </li><li> H 2 DCF - DA와 쥐의 대뇌 피질의 뉴런을로드하려면, 결핵과 교양 뉴런에게 3 회 ​​씻는다. 다음 TB의 H 2 DCF - DA 주식 10분의 1 회 10 MM을 diluting하여 H 2 DCF - DA 2 μm의 준비를하고 TB 1 ML 당 희석 H 2 DCF - DA 2 μl를 추가합니다. 그런 다음, 상온에서 어두운 45 분 H 2 DCF - DA로 뉴런을 품어. 45 분 후, 이미지를 취득하기 전에 여분의 형광 표시기를 제거하는 결핵과 뉴런에게 4 번 씻으십시오. </li></ol> 4. ΔΨm을 결정하는 TMRM와 incubated 뉴런의 이미징 라이브 <ol><li> TMRM, 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (텍스트 오버레이 : LSM 510, 칼 자이스 혈구 주)와 incubated 뉴런의 라이브 영상 수행하려면, 라이브 타임 시리즈 프로그램의 응용 프로그램과 함께하는 것은, 사용됩니다. 이미지를 취득하고 photobleaching 방지하는 데 필요한 시간을 최소화하기 위해; 낮은 해상도와 감쇠 레이저 파워 (1 % : 낮은 해상도의 레이저 파워 256 X 256 텍스트 오버레이)을 적용합니다. </li><li> . 다음 반사광을 사용 TMRM와 함께 로드된 탑재 뉴런의 초점을 조정합니다. 514 NM에서 조명과 570 nm의에서 감지하여 TMRM 형광을 검사합니다. 단지 채도 수준 아래 카메라의 감지 게인을 설정합니다. </li><li> 취득 해상도, 레이저 파워, 카메라의 감지 이득, 그리고 시간 경과 간격을 포함 모든 매개 변수되면 이미지 설정, 실험을 사이에 이러한 설정을 변경하지 마십시오. 다음 필드를 변경합니다. 이미지를 수집 시작합니다. </li><li> ΔΨm의 변화를 테스트하려면, 그러한 FCCP 또는 2 μg / oligomycin의 ML, 1 μm의 같은 자극이 크게 각각 mitochondrial 멤브레인 잠재력을 depolarize 또는 hyperpolarize되는, 적용할 수 있습니다. 이러한 변경 사항은 FCCP의 경우에 기준 형광 강도, 또는 oligomycin의 경우 TMRM 형광 강도의 증가와 비교 TMRM 형광 강도의 감소로 반영됩니다. </li></ol> 5. ROS를 확인하는 H 2 DCF - DA와 incubated 뉴런의 라이브 영상 <ol><li> H 2 DCF - DA, 최초로 incubated 뉴런의 라이브 영상을 수행하려면, 현미경의 무대에 문화 접시를 탑재합니다. 우리 세포의 초점을 조정주입은 빛을 반사. 488 nm의 여기에서 그리고 515 nm의 방출에 의해 DCF 형광을 검사합니다. </li><li> 다음 5-7 %, 검출기 이득, 256 X 256의 해상도 레이저 파워를 조정합니다. 실험을 사이에 이러한 설정을 변경하지 마십시오. 그런 다음, 시간 시리즈 프로그램을 사용하여 라이브 영상을 얻기위한 주파수를 설정합니다. </li><li> 새로운 분야를 선택하고 이미지를 획득 시작합니다. ROS 수준의 변화를 감지하기 위해, H 2 O 2 100-200 μm의와 세포를 치료. 이것은 기준 레벨과 비교 DCF 형광 강도의 증가로 반영됩니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 영역을 선택 LSM 프로그램에서 도구 : 관심 지역 (ROI 텍스트 오버레이)를 사용합니다. 그런 다음, TMRM 또는 ROS 형광 강도를 측정합니다. mitochondrial 지역 또는 TMRM이나 ROS의 형광 강도, 각각을 측정하는 몇 군데 세포에서 전체 세포 본체에서 로아에서 로아를 선택합니다. </li><li> TMRM 또는 각 시점에 대한 ROS에 대한 모든 군데 세포에 대한 전체 세포 기관에서 각 세포의 모든 로아에서 평균 형광 강도를 계산합니다. 배경 형광 강도를 계산하기 위해 셀 옆에 지역을 선택합니다. 몇 가지 측정을 가지고 평균 배경 강도를 계산합니다. </li><li> Microsoft Excel을 사용하여 각 시점의 각 세포에 로아의 평균 형광 강도의 평균 배경 형광 강도를 빼기. . 배경 강도를 공제한 후,이 수식을 (ΔF = FF O / F O X 100, F = 기본 형광 어느 시점에서 = 형광 강도, 텍스트 오버레이)를 사용하여 기준 형광에 TMRM 또는 DCF 형광 강도를 정상화 그런 다음, 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화를 보여주는 줄거리를 생성하는 시그마 플롯 프로그램을 사용합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 그림 1A는 TMRM와 incubated 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 형광 이미지를 보여줍니다. FCCP, mitochondrial uncoupler의 또한 mitochondrial 탈분극 및 TMRM의 형광 강도 (그림의 1B)의 손실로 연결됩니다. 기준 TMRM의 형광 수준 FCCP를 추가 (.; 그림 1C 처음으로 350 초) 전에 안정 남아 있습니다. 시간이 지남에 따라 TMRM 형광 변화를 정량 분석​​ FCCP (그림 1C)를 추가 후 TMRM의 형광에 상당한 감소를 보여줍니다. 그림 1D는 DCF로로드 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 형광 이미지를 보여줍니다. 에서 H 2 O 2 결과 또한 (그림 1E) 세포 기관에서 DCF 형광 강도를 증가했다. 기준 DCF 형광 수준은 H 2 O 2의 응용 프로그램을 이전 (처음 120 초) 변경됩니다. DCF 형광의 시간 - 저속도 측정은 안정 수준을 보여, H 2 O 2 치료 (그림 1 층) 이후 증가하는. <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. mitochondrial 막 잠재력과 라이브 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에서 ROS 수준의 평가. (A) 대뇌 피질의 뉴런 대표 형광 이미지 TMRM 탑재. 기본 TMRM 형광 스캔 후 뉴런은 protonophore FCCP (1 μm의)와 치료를했다. 오른쪽에있는 밝은 노란색과 검은색으로 표현하는 최대 및 최소 강도 각각과 TMRM 형광의 강도 pseudocolor 바 있습니다. mitochondrial 지역의 TMRM의 형광의 손실이 FCCP 치료 (패널 B)에 따라 ΔΨm의 붕괴를 나타냅니다. 다른 시간 시점에서 TMRM 형광 강도 변화의 양적 표현 FCCP 치료 전후 패널 C. (D)에 H2DCF - DA와 함께 로드된 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 형광 이미지를 볼 수 있습니다. 기본 DCF 형광을 결정 후, 세포는 200 μm의 H 2 O 2로 치료했고, DCF 형광의 변화는 평가했다. DCF 형광의 증가는 H 2 O 2 치료 (E)시 ROS 수준의 증가를 반영합니다. DCF 형광의 변화의 정량 분석, H 2 O 2 치료 전후는, 패널 F. 스케일 표시줄에 = 10 μm의를 표시합니다 Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi 40X 목표를 사용하여 FCCP 추가 전후의 대뇌 피질의 뉴런에 TMRM의 세포 이미징을 살고있다. pseudocolor 강도가 최대 (FCCP 추가하기 전에 밝은 노란색을) 보여 주며 (붉은 색, FCCP 추가 후) FCCP 추가 후 TMRM 형광 강도를 감소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> 비디오. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi 40X 목표를 사용하여 H 2 O 2 또한 이전과 이후 대뇌 피질의 뉴런에서 DCF의 세포 이미징을 살고있다. 기준 DCF 형광은 세포 기관에서 밝은 녹색 색상을 보유하고 H2O2 또한 DC 증가밝은 녹색 색상 F 형광 강도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 각각 형광 표시기 TMRM와 H 2 DCF - DA를 사용하여 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에 ΔΨm과 ROS를 결정하는 방법을 설명하는 단계별 절차를 제공합니다. 다른 세포 유형에 대한, 경험적으로 TMRM 또는 H 2 DCF - DA의 최종 농도 및 로딩 시간을 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 TMRM 20-200 NM의 농도 범위, 그리고 TMRM과 세포 배양 시간은 20 60 분 다릅니다. H 2의 최종 농도는 DCF - DA는 20-10 μm의 범위에서,이 표시기를 포함하는로드 솔루션 세포의 배양은 30-45 분부터 다릅니다. 어떤 자극이없는에있는 세포 및 형광 강도의 변화 (TMRM 형광 깜빡 예를 들어)을 모두 사진 독성을 피하기 위해 이미지를 복용의 레이저 전원 및 스캔 속도를 최적화하는 것이 중요합니다. 최적화된 광학 설정은 자극의 부재에서 (요건) 포화 이상 또는 이하가 아닌 형광 신호를 발생한다. 라이브 영상을 10-15 분에 대한 자극의 부재에서 프로브의 형광 강도에 변화가없는 경우 특정 레이저 파워와 스캔 속도로 선택한 필드에서 이미지를 수집하기 위해 최적의 조건을 달성하고 있습니다. ΔΨm을 결정하기 위해 다른 형광 프로브는 rhodamine 123와 테트라 메틸 에틸 에스테르 rhodamine (TMRE)를 포함합니다. 그러나, 그들은 고립 mitochondria 2의 호흡 과정을 억제하는 것으로 확인되었습니다. 중요한 TMRM 낮은 농도 2 mitochondrial 호흡에 영향을주지 않습니다 낮은 phototoxicity 및 기타 프로브에 비해 3 photobleaching 있습니다. H 2 DCF - DA는 잘 세포의 유지와 같이 ROS에 대한 좋은 지표 등 peroxides 같은 여러 산화제 종, 슈퍼 산화물과 질산 산화물 4 인식합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 유리 바닥 문화 요리 </td><td> MatTek 코퍼레이션 </td><td> P35G - 1.5-14 - C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF - DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2 시간 2 O </td><td> 시그마 </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td></tr></tbody></table>

라이브 랫 두피 뉴런에서 mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial 막 잠재적인 (ΔΨm)는 ATP를 생성하는 호흡 체인의 생리 기능을 유지하기위한 중요합니다. ΔΨm의 큰 손실이 이후의 죽음과 에너지의 고갈 세포를 렌더링. 반응 산소 종 (ROS)는 중요한 신호 분자 있지만, 병적인 조건에서 그들의 축적은 산화 스트레스로 연결됩니다. 세포에 ROS의 두 가지 주요 소스는 환경 독소 및 산화 인산화 과정입니다. Mitochondrial 장애 및 산화 스트레스는 많은 질병의 pathophysiology에 연루되어있다, 그러므로 ΔΨm 및 ROS를 결정하는 능력은 세포와 mitochondria의 기능의 생리적 상태에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 여러 형광 프로브 (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC - 1) 세포 유형의 다양한 Δψm을 결정하는 데 사용, 그리고 수 많은 형광 지표 (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF - DA)는 ROS를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 . 거의 ΔΨm 또는 ROS를 평가하는 데 사용 가능한 형광 프로브의 모든 ΔΨm이나 ROS의 수준을 증가 또는 감소 자극에 비례 자신의 형광 강도를 증가 또는 감소 단일 파장 지표입니다. 따라서, 그것은 기본 수준과 특정 자극의 적용 후 이러한 프로브의 형광 강도를 측정하는 필수적입니다. 이것은 하나가 기본 수준과 자극 사이의 형광 강도의 변화의 비율을 결정할 수 있습니다. 형광 강도이 변경 사항은 ΔΨm이나 ROS의 상대적인 수준의 변화를 반영합니다. 이 비디오에서는, 우리는 기본 수준 사이 FCCP, mitochondrial uncoupler를 적용한 후에 TMRM 형광 강도의 비율 변화를 확인하기 위해 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 형광 표시기, TMRM을 적용하는 방법을 보여줍니다. FCCP 치료 인한 TMRM 형광의 낮은 수준 mitochondrial 막 잠재력의 탈분극을 반영합니다. 우리는 또한 H 2 O 2의 신청 후에베이스 라인 처음에 대뇌 피질의 뉴런에서 ROS의 수준을 평가하고 형광 프로브 H 2 DCF - DA를 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 (작은 수정)도 다른 세포 유형과 다른 뇌 영역에서 분리된 뉴런에 ΔΨm 및 ROS의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 특정 자극의 응용 프로그램을 이전과 이후 TMRM 형광 강도의 상대적 변화를 결정하기 위해 대뇌 피질의 뉴런에서, 형광 표시기, TMRM의 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 또한 형광 프로브 H의 응용 프로그램을 표시<sub&gt; 2</sub&gt; DCF - DA 대뇌 피질의 뉴런의 반응 산소 종의 상대적 수준을 평가합니다.

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

미토콘드리아 막 전위(&Delta;&Psi;m)는 ATP를 생성하기 위한 호흡 연쇄의 생리학적 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다. A ...

이 실험 절차의 목적은 형광 프로브인 TMRM과 H 2D CFD를 각각 사용하여 일차 피질 신경세포의 미토콘드리아 막 전위와 활성 산소종 수치를 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 TMRM과 H 2D CFDA의 스톡 및 작동 농도를 준비합니다. 두 번째 단계는 Thai roads 버퍼 내에서 실온으로 45분 동안 피질 신경세포를 TMRM 및 H 2D CFDA와 함께 배양하는 것입니다.세 번째 단계는 각각 515/517 nm 및 488/515 nm의 여기/방출 파장을 사용하여 살아있는 피질 뉴런에서 TMRM과 DCF의 형광 강도를 이미지화하는 것입니다. TMRM 형광의 변화는 미토콘드리아 언커플러인 FCCP 존재 하에 모니터링하며, DCF 형광의 변화는 과산화수소 존재 하에 모니터링합니다. 이 절차의 마지막 단계는 데이터의 수집, 정규화 및 분석입니다.최종적으로, FCCP 및 과산화수소 처리 전후의 TMRM 및 DCF 형광 강도 상대 수치를 각각 그래프로 그려 결과를 얻습니다. 안녕하세요, Joanna Koska입니다. 로욜라 시카고 대학교의 저희 연구실에 오신 것을 환영합니다.오늘은 쥐의 피질 뉴런에서 미토콘드리아 막 전위와 활성 산소종을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 실험 절차는 dhi가 시연하겠습니다. 안녕하세요, 저는 Denise Jossi입니다.본 절차를 통해 단일 미토콘드리아 표지에서 미토콘드리아 막 전위를 측정하고, 단일 세포 표지에서 활성 산소종을 측정할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 5 mg의 TMRM을 1 mL의 무수 dimethyl sulf oxide에 녹여 10 mM TMRM 스톡 용액을 준비하고 1분 동안 볼텍싱하십시오.그런 다음 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 빛으로부터 보호하고 한 달 이내에 사용하십시오. 다음으로, 4.87 mg의 H 2D CFDA를 1 mL의 무수 dimethyl sulf oxide에 녹여 10 mM의 H 2D CFDA 스톡 용액을 준비하십시오.마찬가지로 1분 동안 볼텍싱한 다음, 소분하여 -20°C에서 보관하십시오. 빛을 차단하여 보관하고, 일주일 이내에 쥐의 피질 뉴런에 TMRM을 먼저 로딩하는 데 사용하십시오. 배양된 뉴런을 Tyro's buffer로 3회 세척하십시오.그 다음 10 millimolar TMRM 스톡 용액을 tb로 1000배 희석하여 20 nano molar TMRM을 준비합니다. 그런 다음 tb 1 milliliter당 희석된 TMRM 2 microliters를 첨가합니다. 뉴런을 TMRM과 함께 상온의 암소에서 45분 동안 배양합니다.45분 후, 배양 접시를 현미경 스테이지 위에 올리고 쥐 피질 뉴런에 H 2D CFDA를 로딩하기 위한 이미징을 시작하며, 배양된 뉴런을 tb로 3회 세척합니다. 다음으로, 10 millimolar H 2D CFDA 스톡을 tb로 10배 희석하여 2 micromolar H 2D CFDA를 준비합니다. 그런 다음 tb 1 milliliter당 희석된 H 2D CFDA 2 microliters를 첨가합니다.그 후, 뉴런을 H 2D CFDA와 함께 상온의 암소에서 45분 동안 배양합니다. 이미지를 얻기 전, 과량의 형광 지시약을 제거하기 위해 뉴런을 TB로 4 번 세척합니다. 라이브 타임 시리즈 프로그램을 적용하여 TMRM로 배양한 뉴런의 라이브 이미징을 수행하기 위해 공초점 레이저 주사 현미경을 사용합니다. 이미지 획득에 소요되는 시간을 최소화하고 광퇴색을 방지하기 위해 저해상도와 감쇠된 레이저 출력을 적용합니다.다음으로, 반사광을 사용하여 TMRM이 로딩된 장착 뉴런의 초점을 조정합니다. 514 nm에서 조사하고 570 nm에서 검출하여 TMRM 형광을 확인합니다. 해상도, 레이저 출력, 카메라 게인 및 이미지 획득을 위한 타임랩스 간격을 포함한 모든 파라미터가 설정되면, 카메라의 검출 게인을 포화 수준 바로 아래로 설정합니다.실험 사이에 이 설정들을 변경하지 마십시오. 다음으로, 필드를 변경하십시오. 1 µM의 FCCP 또는 2 µg/mL의 oligomycin을 처리하여 미토콘드리아 막 전위를 각각 유의미하게 탈분극 또는 과분극시킬 수 있으므로, delta PSY M 자극의 변화를 테스트하기 위해 이미지 수집을 시작하십시오.이러한 변화는 FCCP의 경우 기저 형광 강도 대비 TMRM 형광 강도의 감소로, 또는 TMRM 형광 강도의 증가로 나타납니다. H 2D CFDA와 함께 배양된 뉴런의 라이브 이미징을 수행하려면, 먼저 배양 접시를 현미경 스테이지에 고정하고 반사광을 사용하여 세포의 초점을 조정하십시오. 4 88 nanometers에서 들뜨게 하고 five 15 nanometers에서 방출되는 DCF 형광을 관찰하십시오.다음으로, 레이저 출력을 5~7%로 조정하고 게인(gain)과 해상도를 256 x 256으로 설정하십시오. 실험 간에 이 설정들을 변경하지 마십시오. 그런 다음 라이브 이미지를 얻기 위한 빈도를 설정하십시오.Time series 프로그램을 사용하여 새로운 시야를 선택하고, ROS 수준의 변화를 검출하기 위해 이미지 획득을 시작합니다. 세포를 100 내지 200 µM의 과산화수소로 처리합니다. 이는 기저 수준과 비교하여 DCF 형광 강도의 증가로 나타납니다.LSM 프로그램의 관심 영역(ROI) 도구를 사용하여 영역을 선택합니다. 그런 다음 이미지 셀에서 미토콘드리아 영역의 ROI 또는 전체 세포체의 ROI를 선택합니다. 이를 통해 각각 TMRM 또는 ROS의 형광 강도를 측정합니다.세포 옆의 영역을 선택합니다. 배경 형광 강도를 계산하기 위해 여러 번 측정하고, Microsoft Excel을 사용하여 각 시점별 각 세포의 관심 영역 평균 형광 강도에서 평균 배경 형광 강도를 빼어 평균 배경 강도를 계산합니다. 배경 강도를 뺀 후, TMRM 또는 DCF 형광 강도를 기선 형광 값으로 정규화합니다.이 공식을 사용하여 Sigma plot 프로그램을 통해 시간에 따른 형광 강도의 변화를 나타내는 그래프를 생성하십시오. 다음은 TMRM과 함께 배양된 쥐의 피질 뉴런 형광 이미지의 예시입니다. F-C-C-P-A 미토콘드리아 언커플러(uncoupler)를 첨가하면 미토콘드리아 탈분극이 일어나며 TMRM 형광 강도가 감소합니다.FCCP를 첨가하기 전까지 TMRM 형광의 기저 수준은 안정적으로 유지됩니다. 시간에 따른 TMRM 형광 변화의 정량적 분석 결과, FCCP 첨가 후 TMRM 형광이 유의미하게 감소하는 것으로 나타났습니다. 다음은 DCF가 로딩된 쥐 피질 뉴런의 형광 이미지 예시입니다.과산화수소 처리를 하기 전 처음 120초 동안 baseline DCF 형광 수준은 변하지 않고 유지됩니다. 과산화수소를 첨가하면 세포체 내의 DCF 형광 강도가 증가합니다. DCF 형광의 타임랩스 측정 결과, 과산화수소 처리 후 형광 수준이 증가한 상태로 일정하게 유지됨을 보여줍니다.본 절차에서는 광퇴색 및 광독성으로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 낮은 레이저 출력과 빠른 스캔 속도를 사용하는 것이 중요합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Katsalifis, A., et al. 비율계량 지표를 사용하여 일차 뉴런에서 미토콘드리아 글루타티온 산화환원 상태의 실시간 이미징. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 비율계량 형광 지시약을 사용하여 1차 뉴런에서 미토콘드리아 산화환원 상태의 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경으로 두 가지 여기 파장을 적용하여 형광 강도 비율을 측정하여 미토콘드리아 산화를 평가합니다. 이 프로토콜에는 칼슘 유입 및 활성 산소종(ROS) 생성을 유도하기 위한 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 자극과 NMDA 유도 미토콘드리아 산화를 정량화하기 위한 산화제 및 환원제를 사용한 보정이 포함됩니다.

비율계량 지표를 사용하여 1차 뉴런의 미토콘드리아 산화환원 상태 이미징

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

이 문서에서는 미토타임제 생체 센서가 장착된 성상세포 배양의 미토콘드리아 타임랩스 이미징 방법과 미토콘드리아 역학, 이동성, 형태, 생물 발생, 레독스 상태 및 회전율의 결과다발성 분석을 설명합니다.

배양 된 성상 세포에서 미토콘드리아 시스템의 라이브 이미징

이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

미토콘드리아 네트워크는 매우 복잡하여 분석하기가 매우 어렵습니다. 새로운 MATLAB 툴은 타임랩스 이미지에서 실시간 컨포칼 이미징 미토콘드리아를 분석하지만, 출력 볼륨이 커서 개별 수동 주의가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 신속한 파일 분석이 가능한 루틴 최적화가 개발되었습니다.

동형 특이적 레티노산 수용체에 의한 살아있는 신경 미토콘드리아 항상성 조절의 최적화된 자동 분석

이 프로토콜은 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용한 미토콘드리아 초미세 구조 시각화 및 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포 및 일차 쥐 해마 뉴런의 증식, 분화 및 염색을 위한 워크플로우를 제시합니다.

신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용

이 연구에서는 단계별 프로토콜을 설명하고 샘플 준비, 이미지 획득 및 데이터 분석을 포함하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 형태학적 특성을 결정하기 위한 주요 세부 사항을 강조합니다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위해 미토콘드리아 형태를 검사하는 데 일반적으로 사용됩니다.

컨포칼 현미경을 사용한 살아있는 세포의 미토콘드리아 형태 측정

우리는 공명 라만 분광법(RRS)을 이용한 비침습적이고 실시간 미토콘드리아 건강을 모니터링하는 방법을 제시합니다. 우리는 RRS를 사용해 미토콘드리아 산화환원 상태를 정량화하고, 미토콘드리아 건강을 측정하는 지표인 공명 라만 축소 미토콘드리아 비율(3RMR)을 개발했는데, 이는 전통적인 혈액-가스 분석제보다 산소 변화에 더 빠른 반응을 보입니다.

공명 라만 분광법을 이용한 미토콘드리아 기능의 실시간 비침습적 평가

학습하세요 라이브 랫 두피 뉴런에서 형광 탐침 TMRM과 H2D CFDA를 이용한 미토콘드리아 막 전위 및 활성산소종 측정 방법을. 공초점 현미경 실시간 이미징으로 신경세포 기능과 산화 스트레스를 정량 분석할 수 있습니다.

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

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