라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

이 절차의 목표는 형광 프로브, TMRM 및 H 2D CFD를 각각 사용하여 1차 피질 뉴런의 미토콘드리아 막 전위와 활성 산소 종의 수준을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 TMRM 및 H 2D CFDA의 재고 및 작업 농도를 준비하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 태국 도로 완충액에서 45분 동안 실온에서 TMRM 및 H 2D CFDA로 피질 뉴런을 배양

세 번째 단계는 각각 5, 15, 5, 17 나노미터 및 4 88 5 15 나노미터 여기 방출을 사용하여 살아있는 피질 뉴런에서 TMRM 및 DCF의 형광 강도를 이미지화하는 것입니다. 형광에서 TMR의 변화는 미토콘드리아 unco FCCP가 있는 곳에서 모니터링되며, DCF 형광의 변화는 과산화수소가 있는 경우 모니터링됩니다. 이 절차의 마지막 단계는 데이터를 수집, 정규화 및 분석하는 것입니다.

궁극적으로 결과는 FCCP 및 과산화수소 처리 전과 후의 TMRM 및 DCF 형광 강도의 상대적 수준을 각각 보여주는 그래프를 표시하여 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조안나 코스카입니다. 시카고 로욜라 대학교의 제 연구실에 오신 것을 환영합니다.

오늘은 쥐의 피질 뉴런에서 미토콘드리아 막 전위와 활성 산소 종을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 절차는 dhi에 의해 시연됩니다. 안녕하세요, 저는 드 드니즈 조시입니다.

이 절차를 사용하여 단일 미토콘드리아 라벨에서 미토콘드리아 막 전위를 측정하고 단일 세포 라벨에서 활성 산소 종을 측정할 수 있습니다. 시작하겠습니다. 10밀리몰의 TMRM 스톡을 1밀리리터의 무수 디메틸 황산화물 와류에 1분 동안 용해시켜 TMRM 10밀리몰을 준비합니다.

그런 다음 부분 표본이 섭씨 영하 20도에서 부분 표본을 보관하도록 합니다. 빛으로부터 보호하고 한 달 이내에 사용하십시오. 다음으로, 4.87 밀리그램의 H 2D CFDA를 1 밀리리터의 무수 디메틸 황산화물에 용해시켜 10 밀리몰의 H 2D CFDA 스톡을 준비합니다.

마찬가지로 1분 동안 소용돌이친 다음 부분 표본을 만들어 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 빛으로부터 보호하고 일주일 이내에 사용하여 쥐 피질 뉴런에 TMRM을 먼저 로드하십시오. 배양된 뉴런을 티로의 완충액으로 세 번 씻습니다.

그런 다음 10 밀리몰 TMRM 스톡을 TB에서 1000 번 희석하여 20 나노 몰 TMRM을 준비합니다. 그런 다음 결핵 1밀리리터당 희석된 TMRM 2마이크로리터를 추가합니다. TMRM으로 뉴런을 실온의 어둠 속에서 45분 동안 배양합니다.

45분 후, 현미경 스테이지에 배양 접시를 장착하고 이미징을 시작하여 쥐 피질 뉴런에 H 2D CFDA를 로드하고 배양된 뉴런을 결핵으로 세 번 세척합니다. 다음으로, 10 밀리몰 H 2D CFDA 스톡을 결핵에 10 배 희석하여 H 2D CFDA의 2 마이크로 몰을 준비합니다. 그런 다음 결핵 1밀리리터당 2마이크로리터의 희석된 H 2D CFDA를 첨가합니다.

그런 다음 H 2D CFDA로 뉴런을 45분 동안 배양하고 45분 후 실온에서 어둠 속에서 배양합니다. TB로 뉴런을 4회 세척하여 과도한 형광 지표를 제거한 후 이미지를 얻기 전에 TMRM 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 배양된 뉴런의 라이브 이미징을 수행하고 실시간 시계열 프로그램을 사용합니다. 저해상도 및 감쇠된 레이저 출력을 적용하여 이미지를 얻는 데 필요한 시간을 최소화하고 광 표백을 방지합니다.

다음으로, 반사광을 사용하여 TMRM이 로드된 장착된 뉴런의 초점을 조정합니다. 5개의 14나노미터에서 조명과 5개의 70나노미터에서 검출로 TMRM 형광을 검사합니다. 해상도, 레이저 파워 감지, 카메라 게인 및 이미지를 얻기 위한 타임랩스 간격을 포함하는 모든 매개변수가 설정되면 카메라의 감지 게인을 채도 수준 바로 아래로 설정합니다.

실험 간에 이러한 설정을 변경하지 마세요. 그런 다음 필드를 변경합니다. FCCP 1마이크로몰 또는 밀리리터당 2마이크로그램의 올리고 마이신을 적용할 수 있는 것과 같은 델타 PSY M 자극의 변화를 테스트하기 위한 이미지 수집을 시작하며, 이는 각각 미토콘드리아 막 전위를 크게 탈분극 또는 과분극시킵니다.

이러한 변화는 FCCP의 경우 기준선 형광 강도에 비해 TMRM 형광 강도의 감소 또는 TMRM 형광 강도의 증가에 의해 반영됩니다. LIGA myin sin의 경우 H 2D CFDA로 배양된 뉴런의 라이브 이미징을 수행하기 위해 먼저 현미경 스테이지에 배양 접시를 장착하고 반사광을 사용하여 세포의 초점을 조정합니다. 4 88 나노미터에서 여기(excitation)와 5 15 나노미터에서 방출에 의한 DCF 형광을 검사합니다.

다음으로, 레이저 출력을 5-7%로 조정하십시오.2 56 x 2 56의 게인과 해상도를 감지합니다. 실험 간에 이러한 설정을 변경하지 마세요. 그런 다음 라이브 이미지를 얻기 위한 주파수를 설정합니다.

시계열 프로그램을 사용하여 새 필드를 선택하고 이미지 획득을 시작하여 R OS 레벨의 변화를 감지합니다. 100-200마이크로몰의 과산화수소로 세포를 처리합니다. 이는 기준선 수준과 비교하여 DCF 형광 강도의 증가에 의해 반영될 것입니다.

LSM 프로그램의 관심 영역 도구를 사용하여 영역을 선택합니다. 그런 다음 이미지 세포의 미토콘드리아 영역에서 ROI를 선택하거나 전체 세포체에서 ROI를 선택합니다. TMRM 또는 ROS의 형광 강도를 각각 측정합니다.

셀 옆에 있는 영역을 선택합니다. 배경 형광 강도를 계산하려면 여러 가지 측정을 수행하고 평균 배경 강도를 계산하려면 Microsoft Excel을 사용하여 각 시점에 대한 각 셀의 관심 영역의 평균 형광 강도에서 평균 배경 형광 강도를 뺍니다. 배경 강도를 뺀 후 TMRM 또는 DCF 형광 강도를 기준선 형광으로 정규화합니다.

그런 다음 이 공식을 사용하여 시그마 플롯 프로그램을 사용하여 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 플롯을 생성합니다. 다음은 TMRM으로 배양된 쥐 피질 뉴런의 형광 이미지의 예입니다. F-C-C-P-A 미토콘드리아 unco의 첨가는 미토콘드리아 탈분극 및 TMRM 형광 강도의 손실로 이어집니다.

기준선 TMRM 형광 수준은 FCCP를 추가하기 전에 안정적으로 유지됩니다. 시간 경과에 따른 TMRM 형광 변화의 정량 분석은 FCCP 첨가 후 TMRM 형광이 크게 감소하는 것을 보여줍니다. 다음은 DCF가 로드된 쥐 피질 뉴런의 형광 이미지의 예입니다.

기준선 DCF 형광 수준은 과산화수소를 적용하기 전 처음 120초 동안 변하지 않습니다. 과산화수소를 첨가하면 세포체에서 DCF 형광 강도가 증가합니다. DCF 형광의 저속 측정은 과산화수소 처리 후 증가한 꾸준한 수준을 보여줍니다.

이 절차에서는 광표백 및 광독성으로 인한 아티팩트를 피하기 위해 낮은 레이저 출력과 빠른 스캔 속도를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 실험에 행운을 빕니다.