Name: 뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 학습하세요 뉴트의 홍채 색소 상피 세포 배양 및 이식 기법을 통해 수정체 재생 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 실험은 재생 의학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 PAT에 NIH 교부금에 의해 투자 Ey10540했다.

1. 이리스 세포 배양 <ol><li> 7 newts (PBS의 준비 3 aminobenzoate 메탄 sulfonic의 산성 에틸 0.1 %에 anesthetized)과 칼슘, 마그네슘 무료 행크스 솔루션 (CMF)에서 곳에서 눈알를 수집합니다. </li><li> 장갑을 변경하고 조직 문화 후드에서 작동합니다. </li><li> 3 초 Lugol's - EtOH의 눈 볼을 소독. </li><li> CMF 2 번 씻으십시오. </li><li> 행크스에 눈을 전송과 절개를 시작합니다. </li><li> 홍채 - 각막 복잡한을 해부하다 및 신경 망막를 제거합니다. </li><li> 행크스의 새로운 그릇에 단지를 전송합니다. </li><li> 지느러미 및 복부 반쪽에 # 15 메스, 별도의 단지를 사용하여. </li><li> 1 ML은 L - 15을 포함하는 접시에 홍채 조각 (최초 복부)와 장소를 제거합니다. </li><li> 15 % (150 UL) dispase의 볼륨 (7.5 단위 / ML 농도)을 추가합니다. </li><li> 27 2 시간 동안 ° C (parafilm와 랩 요리)에 품어. </li><li> 스트 로마 (27시 플레이스 트립신 용액 ° C)에서 IPE 세포를 분리. </li><li> 1.5 ML 튜브에 IPE 세포를 수집합니다. </li><li> 이분에 대한 RT에서 1,000 RPM (실온)에서 원심 분리기, 뜨는 제거합니다. </li><li> 2 분 동안 RT에서 1000 RPM 1 ML 행크스와 원심 분리기와 세척 뜨는 제거합니다. </li><li> 27에서 2 시간 동안 품어 ° C., 1 ML 트립신 솔루션 추가 </li><li> 이분에 대한 RT에서 1,000 rpm으로 원심 분리기는 트립신을 제거하십시오. </li><li> 2 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기, 씻어 1 ML L - 15을 추가합니다. </li><li> 천천히 위아래로 800 UL L - 15, pipet ~ 10 번 (이상 12 회가 부착을 줄일 수) 추가합니다. </li><li> 플레이트 27 24 잘 콜라겐 코팅 판과 부화에 IPE 세포 ° C 이주 (보통, 4 등의 4 복부 우물이 7 newts에서 얻을 수있다)에 대한. </li><li> 이 단계에서 세포는 유전자 transfection 또는 유도하거나 렌즈 재생을 방해하는 그들의 역할을 결정하는 요인과 치료에 적합합니다. </li></ol> 2. 이리스 세포의 집합 <ol><li> 번호판을 포함 홍채 세포는 부드럽게 400 μl 매체 소용돌이에 dispase 솔루션의 20μl를 추가합니다. </li><li> 27 ° C 야간에 대한 번호판을 품어. </li><li> Pipet 부드럽게 위아래로 세포를 이동시키다하기 </li><li> Eppendorf 튜브 및 RT에서 1,000 rpm으로 2 분 스핀에 플레이스 세포. </li><li> 1 ML 전체 L - 15을 추가하여 중간 및 세척을 제거, RT에서 1,000 rpm으로 2 분 스핀 매체를 제거합니다. </li><li> 집합마다 2000-7000 세포를 사용합니다. 각각의 튜브로 집계 200 UL L - 15을 추가합니다. </li><li> 새로운 eppendorf 튜브에 분할 세포 (200 μl). </li><li> RT 2 분 1,000 rpm으로 회전. </li><li> 27 48 시간을위한 품어 ° C. </li></ol> 3. Aggregrated 세포의 주입 <ol><li> 뉴트의 눈 각막에 슬릿을하고 렌즈를 제거합니다. </li><li> 렌즈 제거 후 눈 복부 측면에 바로 각막 조직 아래 IPE 세포 집계를 놓습니다. </li><li> newts은 그들이 렌즈를 다시 생성하도록 한 달 동안 보관됩니다. </li></ol> 4. 뉴트 아이의 포함 <ol><li> 집계로 이식 뉴트의 눈을 제거하고 인산에 배치 호수 (PBS)가 버퍼. </li><li> 최소 4 시간 또는 밤새 4 ° C에서 4 % paraformaldehyde에 수정. </li><li> 30 분 PBS, 4 ° C에서 씻으십시오. </li><li> 4 ° C, 30 분 0.85 %의 식염수에 그것을 취급합니다. </li><li> 15 분 동안 RT : 살린 / 에탄올 (1:1)에 씻으십시오. </li><li> 70 % 에탄올에 세척 : RT, 15 분. 한번 반복합니다. </li><li> RT 30 분 각 85 % 에탄올과 95 % 에탄올로 세척 </li><li> 100 % 에탄올에 세척 : RT, 30 분. 한번 반복합니다. </li><li> 4 스토어 ° C 또는 계속합니다. </li><li> 100 % 크실렌의 세척 : RT, 30 분. 한번 반복합니다. </li><li> 60 ° C, 45 분 : 크실렌 / 파라핀 (1:1)으로 처리합니다. </li><li> 60 ° C, 20 분 100 % 파라핀과 치료. 그것을 두 번 더 반복합니다. </li><li> 금형을 포함에 삽입할 수 있습니다. </li></ol> 5. Sectioning <ol><li> 마이크로톰를 사용하여 임베디드 눈 15 μm의 섹션을 준비합니다. </li><li> 젤라틴 코팅 슬라이드에 눈 섹션을 장소와 따뜻한 슬라이드에두고. </li></ol> 6. 더럽히는 것 <ol><li> 이곳은 10 분 크실렌에 슬라이드. 한번 더 반복합니다. </li><li> 의 하이드 레이트 : 100 %, 95 %, 80 %, 70 %, 일분 각 30 % 에탄올 </li><li> 잠시 디 물에 헹굼. </li><li> 15 분 동안 PBS로 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 PBST (PBS에 0.​​2 % 트리톤 X - 100)에 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 PBS로 씻으십시오. </li><li> 한시간 솔루션 (10 % 염소 차 항체)를 차단에 놓습니다. </li><li> 하룻밤에 대한 기본 항체에 놓습니다. </li><li> 15 분 동안 PBS의 기본 항체를 씻으십시오. </li><li> 15 분 PBST로 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 PBS로 씻으십시오. </li><li> 어둠 속에서 2 시간 동안 차 항체에 플레이스 (PBS에 희석 1:100). </li><li> 십오분 각 후 마운트를위한 PBS, PBST, 그리고 PBS로 씻으십시오. </li><li> 형광 현미경 슬라이드를 관찰합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : culturing 뉴트 IR의이 절차는는 세포는 지느러미와 복부 IPE 세포의 재생 가능성을 연구하기 위해 활용되었습니다. 또한, 그것은 뉴트 안구의 렌즈 재생 메커니즘으로 기여하는 특정 유전자를 연구하는 것도 가능합니다. 전지은 2 주 동안 교양되었을 경우 (그림 1) 이들은 렌즈에서 재생 기능을 조사하는 유전자로 transfected 수 있습니다. 특히 관심의 복부 아이리스 유발 유전자 수 있습니다. 복부 홍채 세포가 렌즈에 transdifferentiate 수 없기 때문에 (그림 2) 후보 유전자의 유도 기능을 공부하실 수 있습니다. 과거에는이 기법을 사용하는 우리는 여섯 3이 넘는 retinoic 산성 렌즈 유도의 존재로 표현되었을 때 복부 홍채 6 관찰되었다 것으로 나타났습니다. 그림 3에서는 복부 이리스 집계는 지느러미 홍채 (화살표)에서 호스트 렌즈와는 다른이 아닌 완전히 성장과 차별화된 렌즈 (화살촉)에 상승을 준 것을 알 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. A) 도설 홍채 색소 상피 세포는 2 주 동안 체외에서 배양해. B) 복부 홍채 색소 상피 세포는 2 주 동안 체외에서 배양해. 착색은 지느러미와 복부 양쪽 홍채 세포에서이 단계로 계속합니다. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 교양 IPE 세포의 재생 능력. 지느러미 IPE 세포 집계 (화살촉)에서) 렌즈 유도. 지느러미 홍채 (화살표), DI에서 렌즈 유도 호스트 : 지느러미 홍채, 바이 : 복부 홍채, 르 : 렌즈 상피,면 : 렌즈 섬유. 복부 IPE 세포 집계 (화살촉)에서 렌즈 유도의 B) 부재. 지느러미 홍채 (화살표)에서 렌즈를 유도 호스트. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 복부 집계에서 렌즈 유도 여섯 - 3 transfected 및 retinoic 산성과 치료. 지느러미 홍채 (화살표)에서 렌즈를 유도 호스트. 복부 집계 (화살촉)에서 렌즈 유도.

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 newts에서 렌즈의 재생 메커니즘을 연구하기 위해 체외 시스템을 마련하였습니다. 집계 이후 (중 지느러미 또는 복부가 충실하게 자신이 재생이 기법 중 생체내 행동에 newts에 transgenesis에 필요한과 기능의 이득뿐만 아니라 기능을 실험 7, 8, 9의 손실에 대해 사용할 수있는 엄청난 노력을 경감 할 수 따릅니다. 또한 , 전체 집계 또는 붓꽃은 쉽게 성장 요소로 취급하고이 프로토콜의 설명에 그들의 영향을 조사합니다. 예를 들어 BMP 통로의 역할이 기술 6을 사용 연구되어 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Lugol&amp;rsquo; 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (amphotericin B 용액)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>24 well 콜라겐 코팅 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

뉴트의 렌즈 재생을 공부 culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

뉴트 및 axolotl 같은 도롱뇽은 팔다리, 척수, 눈, 뇌, 심장, 턱 1 꼬리로의 손실 신체 부위 중 많은 것들을 다시 생성하는 능력을 보유하고 있습니다. 특히, newts는 렌즈 재생 기능에 대해 고유합니다. 렌즈 제거시, 지느러미 홍채의 IPE 세포는 렌즈 세포에 transdifferentiate 결국 한 달 2,3의 새로운 렌즈를 형성하고 있습니다. 중생의이 속성은 복부 홍채 세포에 의해 전시되지 않습니다. 홍채 세포의 재생 가능성은 체외 교양 IPE 세포에의 이식을하여 공부하실 수 있습니다. 문화, 지느러미 및 복부 홍채 세포가 먼저 눈에으로부터 격리되고 이주 (그림 1)의 기간 동안 별도 양식. 이러한 교양 세포 reaggregated와 뉴트 아이로 다시 심어 있습니다. 과거 연구는 복부 집계가 4,5 (그림 2) 따라서 생체내 과정에서 recapitulating, 렌즈를 형성하지 않는 반면, 지느러미 reaggregate는 렌즈를 형성 능력을 유지하는 것으로 나타났습니다. 지느러미 및 복부 홍채 세포의 재생 가능성을 결정하는이 시스템은 렌즈 재생에 관련된 유전자 및 단백질의 역할을 공부에 매우 유용합니다.

뉴트에서 렌즈는 홍채 색소 상피 세포 (IPEs)의 transdifferentiation하여 지느러미 홍채에서 항상 다시 생성합니다. 여기서 우리는 뉴트의 눈에 문화 지느러미와 복부 뉴트 IPE 세포와 그 이식하는 절차를 설명합니다. 이식 세포 그런 다음 조직 sectioning과 immunohistochemistry으로 공부하고 있습니다.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

뉴트(newt)와 아홀로틀(axolotl)과 같은 도롱뇽류는 사지, 척수를 포함한 꼬리, 눈, 뇌 등 소실된 많은 신체 부위를 재생하는 능력을 가지고 있습니다.

이 절차의 전체적인 목적은 뉴트의 수정체 재생을 연구하기 위해 홍채 색소 상피 세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 수면 용액으로 뉴트를 마취시킨 후 안구를 적출함으로써 수행됩니다.절차의 두 번째 단계는 먼저 망막 조직을 제거한 후 각막 홍채 조각을 등쪽과 배쪽 절반으로 절단하여 안구 조직으로부터 홍채 색소 상피 세포를 분리하는 것입니다. 그 후 홍채 세포를 기질로부터 분리하여 2주 동안 체외 배양합니다. 2주간의 배양 후, IPE 세포를 응집시킨 다음 최적화된 수신체에 이식합니다.한 달간의 치유 기간 후, 조직학적 분석을 통해 등쪽 및 배쪽 IPE 세포의 수정체 재생 잠재력을 확인할 수 있습니다. 미세 해부 및 수술을 위한 수많은 숙련된 기술이 필요하므로, 학습하기 어려운 세포 배양 및 이식 단계에서 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 우선 최소 7마리의 누드마우스를 0.1% Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid로 마취시킨 후, 포셉과 수술용 가위를 사용하여 결막과 함께 눈꺼풀을 절개하여 안구를 외과적으로 적출합니다. 그런 다음 시신경을 절단합니다.이제 적출한 눈을 빠르게 후드로 옮겨 lugo's ethanol로 3초간 멸균합니다. 그 다음, 칼슘과 마그네슘이 제거된 Hank 용액으로 눈을 2회 세척합니다. 이를 신선한 hanks 용액으로 옮긴 후 적출을 진행합니다.메스를 사용하여 눈에 절개창을 냅니다. 그런 다음 가위를 사용하여 각막 가장자리를 따라 절개합니다. 수정체를 제거하고 공막과 함께 남은 망막 조직을 잘라냅니다.15번 메스를 사용하여 홍채 각막 복합체를 신선한 hanks 용액이 담긴 배양 접시로 옮깁니다. 복합체를 등쪽과 배쪽 절반으로 분리합니다. 등쪽 홍채는 공막의 등쪽에 검은 점이 있는 것으로 식별하며, 배쪽 홍채는 V자형 절개선으로 식별합니다.복측 홍채와 배측 홍채를 분리합니다. 1 mL의 L 15 용액이 들어 있는 35 mm 디쉬에 홍채 조각들을 수집합니다. 배측과 복측 절반을 각각 별도의 디쉬에 보관하십시오.이제 접시에 150 µL의 dispa 용액을 넣고 27 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 기질로부터 IPE 세포를 수집하기 위해, 핀셋을 사용하여 수집된 모든 조직 조각에서 IPE 세포를 조심스럽게 벗겨냅니다.다음으로, IPE 세포를 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 상온에서 1000 RPM으로 2분간 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 펠렛을 1 milliliter의 Hanks 용액에 재현탁하고, 세포를 분리하기 위해 원심분리를 반복합니다. Hanks 용액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다.1:250 trypsin 용액 1 mL에서 27 °C로 2시간 동안 배양한 후, 세포를 세척하기 위해 원심 분리하여 trypsin을 제거합니다. L 15 용액 1 mL를 넣고 다시 원심 분리하며, 이 세척 과정을 한 번 더 반복한 후 신선한 L 15 800 µL로 교체하고 피펫으로 세포를 용액 속에 부드럽게 현탁합니다. 이제 콜라겐이 코팅된 24-well 플레이트에 세포를 분주합니다.일반적으로 7개의 N에서 얻는 수득량은 등쪽 세포 4개 웰과 배쪽 세포 4개 웰입니다. 2주 후에 27°C에서 2주 동안 디시를 배양하십시오. 여기에서 보여주는 IPE는 렌즈 재생 과정에서의 기능을 조사하기 위해 유전자를 transfection할 수 있습니다.2주 동안 배양한 복측 IPE 세포는 등측 세포와 동일한 형태를 보입니다. 등측 및 복측 홍채 세포 모두 이 단계까지 색소 침착이 유지된다는 점에 유의하십시오. IPE 세포를 이식하기 전, 400 µL의 신선한 배양액에 20 µL의 dyse를 첨가하여 세포를 응집시켜야 하며, 플레이트를 가볍게 흔든 후 27 °C의 배양기에서 하룻밤 동안 세포를 유지합니다.다음 날, 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 떼어낸 후 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 이제 튜브를 원심분리하고 상층액을 1 milliliter의 L 15로 교체하여 세포를 세척합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 세포 현탁액 10 microliters를 사용하여 표준 방법으로 세포 수를 계산합니다.계산이 완료되면, 응집체당 200 µL의 L 15에 3000 내지 5,000개의 세포를 준비합니다. 이제 세포를 원심 분리하고 48시간 동안 배양합니다. 27 °C에서 세포를 수용 동물에 이식할 수 있습니다.성체 제브라피시가 움직임을 멈출 때까지 마취액에 넣어 마취시키는 것으로 시작합니다. 이제 메스 날을 사용하여 눈의 각막에 절개선을 만듭니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 수정체를 제거합니다.수정체를 제거한 후, IPE 세포 응집체를 안구 복측의 각막 조직 바로 아래에 배치합니다. 이제 뉴트를 별도의 용기에 옮기고 회복될 때까지 기다립니다. 이 기간 동안 회복 중인 조직이 손상되지 않도록 뉴트를 조심스럽게 다루십시오.이식된 세포가 새로운 수정체로 재생되기까지는 한 달의 시간이 필요합니다. 한 달이 지난 후, 응집 세포가 이식된 새로운 눈을 적출하여 조직을 고정합니다. 표준 탈수 프로토콜을 사용하여 고정된 조직을 임베딩 몰드에 매립한 후, 15 µm 두께로 절편을 만들어 적절하게 염색합니다.응집체를 렌즈가 없는 눈에 이식한 후, 등쪽 IPE 세포 유래 응집체는 새로운 수정체 형성을 유도합니다. 복측 이식물이 있는 눈에서도 등쪽 홍채로부터 숙주 수정체 유도가 관찰됩니다. 복측 IPE 세포로 준비된 응집체에서는 수정체 유도가 관찰되지 않으나, six 3 유전자가 과발현되거나 레티노산이 존재하는 경우에는 복측 응집체로부터 수정체 유도가 관찰됩니다.또한, 발달 후 눈의 등쪽 홍채로부터 숙주 수정체 유도가 관찰됩니다. 이 기술은 수정체 재생 분야의 연구자들이 새로운 관점에서 다양한 유전자의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

a-system-for-culturing-iris-pigment-epithelial-cells-to-study-lens

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 토끼 망막과 망막 신경절 GFP 또는 세포에 subcellular 마커의 다양한 인코딩 plasmids의 입자 - 중재 유전자 전송의 해부와 인큐베이션을 보여줍니다.

어른 토끼 망막의 Organotypic 문화

FGF - 2의 존재 양식 때 쥐 렌즈 상피 조직의 중심 지역의 Explants는 동기 구별. 이러한 문화의 Immunofluorescence 현미경은 유전자 발현 및 단말 차별과 연관된 신호 이벤트에 대한 소설 정보를 제공하실 수 있습니다.

터미널 차별 유학을위한 준비 및 랫 렌즈 상피 Explants의 문화

우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

이 비디오에서는 토끼 모델에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 절차를 보여줍니다. 이 세포는 망막 퇴행성 질환에 대한 치료 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다.

IPE 및 RPE 세포 분리: 토끼 눈에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 기술

이 동영상은 채취한 소의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포와 홍채 색소 상피(IPE) 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 분리된 세포를 배양하여 안구 질환 치료에서 자신의 역할을 연구할 수 있습니다.

소의 눈에서 RPE 및 IPE 세포 분리: 소 1차 색소 상피 세포를 수확하고 배양하는 절차

여기에 설명된 것은 본래의 미세환경 내에서 상피 조직의 손상 반응 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 임상적으로 관련된 생체 외 모의 백내장 수술 모델의 확립입니다.

임상 적으로 구축<em&gt; 전의 VIVO</em기본 미세 환경에서 상피 상처 복구 조사를위한&gt; 모의 백내장 수술 모델

이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

이 원고는 백내장 및 후낭 혼탁(PCO)에 대한 재현성을 개선하고 연구를 지원하는 것을 목표로 하는 1차 수정체 상피 세포(LEC) 배양을 위한 자세한 비디오 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 렌즈 박리, LEC 분리 및 검증에 대한 단계별 지침을 제공하며, 특히 이 분야의 초보자에게 귀중한 가이드 역할을 합니다.

Mouse Primary Lens 상피 세포 배양 최적화: 트립신화에 대한 종합 가이드

본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.

Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

안구 수정체가 망막에 빛을 집중시키는 기능은 조직의 투명도, 생체역학, 굴절률에 따라 달라집니다. 이 리뷰는 수정체의 3차원 구조를 강조하고 조직 항상성을 유지하는 복잡한 메커니즘을 논의합니다.

포유류 안구 렌즈에 초점을 맞춘 주제: 발달, 해부학, 생리학, 투명성, 생체역학, 그리고 연령 관련 도전 과제

학습하세요 뉴트의 홍채 색소 상피 세포 배양 및 이식 기법을 통해 수정체 재생 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 실험은 재생 의학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

더 많은 동영상 탐색