뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

이 절차의 전체적인 목적은 뉴트의 수정체 재생을 연구하기 위해 홍채 색소 상피 세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 수면 용액으로 뉴트를 마취시킨 후 안구를 적출함으로써 수행됩니다.

절차의 두 번째 단계는 먼저 망막 조직을 제거한 후 각막 홍채 조각을 등쪽과 배쪽 절반으로 절단하여 안구 조직으로부터 홍채 색소 상피 세포를 분리하는 것입니다. 그 후 홍채 세포를 기질로부터 분리하여 2주 동안 체외 배양합니다. 2주간의 배양 후, IPE 세포를 응집시킨 다음 최적화된 수신체에 이식합니다.

한 달간의 치유 기간 후, 조직학적 분석을 통해 등쪽 및 배쪽 IPE 세포의 수정체 재생 잠재력을 확인할 수 있습니다. 미세 해부 및 수술을 위한 수많은 숙련된 기술이 필요하므로, 학습하기 어려운 세포 배양 및 이식 단계에서 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 우선 최소 7마리의 누드마우스를 0.1% Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid로 마취시킨 후, 포셉과 수술용 가위를 사용하여 결막과 함께 눈꺼풀을 절개하여 안구를 외과적으로 적출합니다. 그런 다음 시신경을 절단합니다.

이제 적출한 눈을 빠르게 후드로 옮겨 lugo's ethanol로 3초간 멸균합니다. 그 다음, 칼슘과 마그네슘이 제거된 Hank 용액으로 눈을 2회 세척합니다. 이를 신선한 hanks 용액으로 옮긴 후 적출을 진행합니다.

메스를 사용하여 눈에 절개창을 냅니다. 그런 다음 가위를 사용하여 각막 가장자리를 따라 절개합니다. 수정체를 제거하고 공막과 함께 남은 망막 조직을 잘라냅니다.

15번 메스를 사용하여 홍채 각막 복합체를 신선한 hanks 용액이 담긴 배양 접시로 옮깁니다. 복합체를 등쪽과 배쪽 절반으로 분리합니다. 등쪽 홍채는 공막의 등쪽에 검은 점이 있는 것으로 식별하며, 배쪽 홍채는 V자형 절개선으로 식별합니다.

복측 홍채와 배측 홍채를 분리합니다. 1 mL의 L 15 용액이 들어 있는 35 mm 디쉬에 홍채 조각들을 수집합니다. 배측과 복측 절반을 각각 별도의 디쉬에 보관하십시오.

이제 접시에 150 µL의 dispa 용액을 넣고 27 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 기질로부터 IPE 세포를 수집하기 위해, 핀셋을 사용하여 수집된 모든 조직 조각에서 IPE 세포를 조심스럽게 벗겨냅니다.

다음으로, IPE 세포를 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 상온에서 1000 RPM으로 2분간 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 펠렛을 1 milliliter의 Hanks 용액에 재현탁하고, 세포를 분리하기 위해 원심분리를 반복합니다. Hanks 용액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다.

1:250 trypsin 용액 1 mL에서 27 °C로 2시간 동안 배양한 후, 세포를 세척하기 위해 원심 분리하여 trypsin을 제거합니다. L 15 용액 1 mL를 넣고 다시 원심 분리하며, 이 세척 과정을 한 번 더 반복한 후 신선한 L 15 800 µL로 교체하고 피펫으로 세포를 용액 속에 부드럽게 현탁합니다. 이제 콜라겐이 코팅된 24-well 플레이트에 세포를 분주합니다.

일반적으로 7개의 N에서 얻는 수득량은 등쪽 세포 4개 웰과 배쪽 세포 4개 웰입니다. 2주 후에 27°C에서 2주 동안 디시를 배양하십시오. 여기에서 보여주는 IPE는 렌즈 재생 과정에서의 기능을 조사하기 위해 유전자를 transfection할 수 있습니다.

2주 동안 배양한 복측 IPE 세포는 등측 세포와 동일한 형태를 보입니다. 등측 및 복측 홍채 세포 모두 이 단계까지 색소 침착이 유지된다는 점에 유의하십시오. IPE 세포를 이식하기 전, 400 µL의 신선한 배양액에 20 µL의 dyse를 첨가하여 세포를 응집시켜야 하며, 플레이트를 가볍게 흔든 후 27 °C의 배양기에서 하룻밤 동안 세포를 유지합니다.

다음 날, 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 떼어낸 후 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 이제 튜브를 원심분리하고 상층액을 1 milliliter의 L 15로 교체하여 세포를 세척합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 세포 현탁액 10 microliters를 사용하여 표준 방법으로 세포 수를 계산합니다.

계산이 완료되면, 응집체당 200 µL의 L 15에 3000 내지 5,000개의 세포를 준비합니다. 이제 세포를 원심 분리하고 48시간 동안 배양합니다. 27 °C에서 세포를 수용 동물에 이식할 수 있습니다.

성체 제브라피시가 움직임을 멈출 때까지 마취액에 넣어 마취시키는 것으로 시작합니다. 이제 메스 날을 사용하여 눈의 각막에 절개선을 만듭니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 수정체를 제거합니다.

수정체를 제거한 후, IPE 세포 응집체를 안구 복측의 각막 조직 바로 아래에 배치합니다. 이제 뉴트를 별도의 용기에 옮기고 회복될 때까지 기다립니다. 이 기간 동안 회복 중인 조직이 손상되지 않도록 뉴트를 조심스럽게 다루십시오.

이식된 세포가 새로운 수정체로 재생되기까지는 한 달의 시간이 필요합니다. 한 달이 지난 후, 응집 세포가 이식된 새로운 눈을 적출하여 조직을 고정합니다. 표준 탈수 프로토콜을 사용하여 고정된 조직을 임베딩 몰드에 매립한 후, 15 µm 두께로 절편을 만들어 적절하게 염색합니다.

응집체를 렌즈가 없는 눈에 이식한 후, 등쪽 IPE 세포 유래 응집체는 새로운 수정체 형성을 유도합니다. 복측 이식물이 있는 눈에서도 등쪽 홍채로부터 숙주 수정체 유도가 관찰됩니다. 복측 IPE 세포로 준비된 응집체에서는 수정체 유도가 관찰되지 않으나, six 3 유전자가 과발현되거나 레티노산이 존재하는 경우에는 복측 응집체로부터 수정체 유도가 관찰됩니다.

또한, 발달 후 눈의 등쪽 홍채로부터 숙주 수정체 유도가 관찰됩니다. 이 기술은 수정체 재생 분야의 연구자들이 새로운 관점에서 다양한 유전자의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.