Name: 3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 학습하세요 한깅 드롭 배양법을 사용하여 3D 스페로이드를 생성하는 간단한 세포 배양 기술을. 이 방법은 세포 간 상호작용 연구와 조직 공학 연구에 효율적으로 활용됩니다.

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저자는 기술 지원을 위해 박사 Dongxuan 지아 감사하고 싶습니다. 이 문서에 나타나는 이미지 중 일부는 박사 말콤 S. 스타 인 버그, 분자 생물학의학과, 프린스턴 대학교와 공동으로했다. 저자는 또한 국방 전립선암 연구 프로그램 (보조금 PC - 030482와 PC - 991552)의 계열 NCI / NIH (부여 R01CA118755)은 관대한 지원을 감사드립니다.

1. 단일 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 자기편 세포 배양은 90 % 합류로 성장해야 뭘로 monolayers는 PBS로 두 번 씻어서해야합니다. 잘 배수 후, 0.05 % 트립신 - 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 MLS를 (100mm 접시)을 추가하고, 37 품어 ° C를 세포가 분리까지. 전체 중간 2 MLS를 추가하고 부드럽게 세포가 정지 때까지 혼합물을 씹다에 5 ML의 피펫을 사용하여 trypsinization를 중지합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> RT에서 5 분 10 MG / ML DNAse 주식 품어 40 μl를 추가합니다. 5 분 200 XG에 소용돌이 짧게하고 원심 분리기. </li><li> 뜨는 취소 1 ML 전체 조직 문화 매체와 펠렛을 씻으십시오. 반복 후, 전체 조직 문화 매체 2 MLS에 resuspend 세포. </li><li> hemacytometer, 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 카운트 및 2.5 X 10 6 세포 / ML로 농도를 조정합니다. 이 예제에 대한 BioRad TC10 자동 세포 계수기가 사용되었습니다. </li></ol> 2. 공중 드랍스의 형성. <ol><li> 60mm 조직 문화 요리와 접시의 바닥에서 개최 PBS 5 MLS을에서 뚜껑을 제거합니다. 이것은 수화 챔버 역할을합니다. </li><li> 뚜껑을 반전하고 뚜껑의 하단에 10 μl 방울을 입금 20 μl pipettor을 사용합니다. 만지지만큼 방울은 너무 충분히 떨어져 배치되었는지 확인합니다. 접시 당 최소한 20 방울을 배치하는 것이 가능합니다. </li><li> 37 PBS - 채워진 바닥 챔버와 부화 ° C / 5 % CO 95분의 2 %의 습도에 뚜껑을 반전 매일 방울 모니터와 세포 시트 또는 집계 중 하나가 형성 때까지 알을 품다. 스테레오 현미경은 집계 형성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 일단 시트 양식, 그들이 둥근 바닥 유리 쉐이크로 전송할 수 있습니다 전체 미디어 중 3 MLS가 포함된 37 흔들어 물을 욕조에 incubated flasks ° C와 spheroids 양식까지 5% CO 2. </li></ol> 3. 노트 <ol><li> 셀 크기에 따라 농도는 위 또는 아래로 조정해야 할 수 있습니다. </li><li> 세포 멤브레인가 걸려 드롭 형성 이전에 형광 염료를 intercalating 물들일 수 있습니다. </li><li> 서로 다른 두 가지 세포 유형이 differentially 매달려 방울의 형성 이전에 1:1 (또는 다른) 비율 스테인드 및 혼합 수 있습니다. 이들은 암, stromal 세포, 배아 조직, 또는 유전적으로 특정 접착제 서명을 가지고 설계 세포 수 있습니다. </li><li> 세포 cadherin 기능을 보존하기 위해 0.05 %의 트립신 / 2 MM의 칼슘을 사용하여 조직 문화 요리에서 분리 수 있습니다. </li><li> 실험에 따라 시트 크기는 어느 측정할 수있다, 또는 집계는 기계적 시험 또는 생화 학적 또는 분자 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 시트 또는 회전 타원체 형성은 일반적으로 24 시간 이내에 발생하지만 세포 유형에 따라 더 오래 걸릴 수도 있습니다. 그림 1은 치료 전립선암 MAT - LyLu (MLL) 드롭 문화를 걸려의 세포 (그림 1A) 또는 25 μm의 MEK 억제제 PD98059로 치료 세포의 배양 18 시간 후 촬영한 이미지를 나타냅니다. 세포 시트의 표시 압축에 MEKi 처리 결과를 참고. 압축은 10-20의 크기 (또는 이상) 방울에 걸려 치료 그룹 사이의 평균 크기를 비교 측정하여 계량하실 수 있습니다. 우리는 픽셀의 전체 이미지 영역을 나타내기 위해 입자 분석을 적용 뭘로 우리는 일반적으로 이진 모드로 이미지를 다음 각 이미지를 thresholding 변환하여 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다. 이것은 그때 쉽게 평방 미크론으로 변환할 수 있습니다. 그림 2는 치료와 MEKi - 대우 MLL 세포의 크기 비교를 나타냅니다. 학생의 T - 테스트 (P는 &lt;0.0001)에 의해 비교처럼 언급, MEKi 치료는 크게 시트 크기를 줄일 수 있습니다. 이 비교를 위해, 치료 및 치료 세포의 각 10 집계가 측정되었다. 그림 3은 드롭 문화를 걸려 24 시간 쉐이크 목욕 2 일 후에 형성된 여자 배아 간 회전 타원체를 나타냅니다. 매달려 드롭 분석도 공간적 위치가 채택 나타내기 위해 하나 이상의 셀 유형을 포함하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 병아리 배아 간세포는 형광 막 - intercalating 염색 물들일하고 다른 형광 마커 물들일되었습니다 여자는 배아 심장 세포와 혼합, 격리 수 있습니다. 대신 나머지보다 intermixed되는 그림 4A 쇼, 간, 심장 세포가 한 다른에서 "정렬 아웃"하는 경향과 채택 영역 - 내 - 어 - 구형의 심장 세포가 간 세포에 의해 싸여있는 구성. 이 구성은 간장과 심장 세포 사이의 세포 접착의 차이에 의해 설명하실 수 있습니다. 이 개념은 췌장 아일릿 세포 조직 5와 세포가 동일한 I이 세포 집단 사이의 정렬, 수륙 양용 3 teleost 4 배아의 배아 배아 계층 조직 사이의 동작을 정렬 세포를 설명하는 데 사용되었습니다 차동 접착 가설에 codified입니다N cadherin (6 그림 4B)의 같은 종류의 표현 수준 이외의 모든 존중합니다. 이 결과는 세포 집단 사이의 접착에 간단한 변화를 기술하는 방법 보여주는 경우에 특히 중요한 것은 예를 들어, 장기 구조의 생성을 초래할 수, 췌장 아일릿 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1.하거나 부재 (A) 또는 앞에서 18 시간 동안 드롭 문화를 걸려에서 incubated 세포의 이미지 (B) MEK 억제제 PD98059 25 μm의 중. 이미지는 니콘 이클립스 TE 300 epifluorescence 현미경 및 Photometrics CoolSnap ES 디지털 카메라를 사용하여 캡처한되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 쥐의 전립선 암 세포의 MLL MEKi 유발 압축의 양을 정함. 위에서 설명한대로 집계 크기가 결정되었습니다 뭘로 치료 및 MEKi - 대우 MLL 세포 매달려 놓기 문화가 18 시간 동안 incubated되었습니다. 골재 크기의 통계적 분석은 학생의 T - 테스트로했다. 별표 상당히 더 작고 컴팩트 집계에 치료 및 MEKi - 치료 세포 및 제안 MEKi - 치료 결과 사이의 집합 크기에 통계적으로 의미 차이 (P는 &lt;0.0001)을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 인큐베이터에서 다음 18 시간 동안 드롭 문화를 걸려 / 48 시간 동안 목욕을 흔들어에 여자는 배아 간세포 잠복기에 의해 형성 회전 타원체. 이 이미지는 니콘 SMZ800 스테레오 현미경과 소니 블랙 CCD 카메라를 사용하여 캡처한되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 드롭 문화 식이란 다른 세포 유형 간의 행동 아웃 정렬 보여줍니다. 패널에서이 병아리 배아 간세포는 PKH - 2 막 intercalating 염색 물들일되었으며 PKH - 26 묻은 여자는 배아 심장 세포와 같은 비율로 혼합. 패널 B에서는 2.4:1의 비율에서 표면에 N - CAD 표현이 N - cadherin - transfected L 세포 클론은 (LN4 및 LN2a), 또한 형광 막 intercalating 염료 PKH - 2 및 PKH - 26 물들일되었습니다 (시그마 - 알드리치), 동등한 비율로 혼합하여 방울 7 걸려으로 교양. 문화 18 시간 후, 세포 시트 떨고 flasks로 전송된 다른 48 시간 동안 incubated. 집계가의 2 % paraformaldehyde에서 수정되었습니다 생리 인산염 버퍼와 니콘 Optiphot - 2 현미경에 부착된 BioRad MRC600 스캐닝 레이저 공촛점 현미경 시스템을하셨습니다. 녹색과 적색 두 채널의 광학 부분이 수집되었으며 바이탈 이미지를 갖춘 실리콘 Graphix 크림슨 VGX 워크 스테이션은 Voxel보기 울트라 이미징 소프트웨어는 생성된 해부 구성을 공개, 두 채널에 잘못된 색상을 지정하고 이미지를 병합하는 데 사용되었습니다. (A) pseudocolor 파란색으로 간세포 (8)에 의해 심장 세포의 집합 보여주는 봉함을 통해 공촛점 광학과 (여기 의사 - 색상 노란색). N - cadherin (적색) (6)의 낮은 수준을 표현하는 사람들에 의해 높은 N - cadherin 표현 전지 (녹색)의 집계 보여주는 봉함을 통해 (B) 공촛점 광학 섹션을 참조하십시오.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

연구는 3 차원 컨텍스트 (3D)에 culturing 세포는 독특한 세포 형태학 및 엄격한 2 차원 (2D) 문화 시스템 9 비교할 때 신호를 생성하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, fibroblast - 인구 콜라겐 젤는 3D에서 fibroblast의 형태는 2D 10,11에서 관찰와는 상당히 별개의 것을 보여줍니다. 마찬가지로, 3D 문화는 내유 상피 세포의 조직과 관련된 차별을 일으킬 수. 3D 문화 시스템은 정상 및 악성 세포를 구분하는 데 사용되었으며 정상 표현형로 변형 세포의 복귀를 지원하기 위해 표시되었습니다, 적절한 자극 12,13 주어. 올바른 조직 구조도 장거리를 위해 필수적인 것으로 표시되었습니다 항상성, apoptosis의 억제, 그리고 CID - 9 내유 상피 세포 14 차별 표현형의 유지. 전지가 기존의 monolayer 문화 15 3 - D 구성 및되지 성장했다 경우에만 마우스 다세포 약물 저항은 E...

<ul><li> 자동 세포 계수기 (BioRad TC10) </li><li> CO 2 게이블 표지 모델 3540 (랩 라인)과 물 목욕을 흔들어 </li></ul>

3d spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

세포 세포 결합 및 세포 - 하층 부착의 연구는 역사적으로 딱딱한 기판에 점착 성의 monolayer 문화에서 수행되었습니다. 조직 내에서 세포 그러나, 세포는 많은 가까운 이웃과 세포외 기질 구성 요소와 친밀한 연결을 설정하는 밀접하게 포장 조직 내에 대량 일반적으로 쌌다 있습니다. 따라서, 화학 환경 및 3D 조직 내에서 세포에 의해 경험 물리적 강제는 monolayer 문화에서 자란 세포에 의해 경험보다 근본적으로 다릅니다. 이것은 현저하게 세포 형태학 및 신호에 영향을 보여줘왔다. 여러 가지 방법이 콜라겐 젤 1 또는 biomaterial 공사장 공중 발판 2 세포의 캡슐을 포함하여 3 차원 세포 배양을 생성 고안되었습니다. 이러한 방법은 유용하면서 정상 조직에있는 친밀한 직접 세포 세포 접착 아키텍처를 요점을 되풀이하지 않습니다. 오히려, 그들은 더 밀접하게 대략적인 문화 시스템은있는 단일 세포는 느슨하게 ECM 제품의 3D meshwork 이내에 분산됩니다. 여기, 우리는 세포가 드롭 문화 매달려에 배치하고 그들이 세포가 서로와 세포외 기질 구성 요소와 직접 접촉하는 진정한 3D spheroids를 형성 때까지 생리 조건 하에서 incubated하는 간단한 방법을 설명합니다. 방법은 전문적인 장비를 필요로하지 않고 셀 - 셀 또는 셀 ECM 상호 작용에 영향을 elucidating에 관심이있을 것으로 매우 소량의 모든 생물 학적 요원의 추가 포함 적용할 수 있습니다. 방법은 또한 서로 다른 세포 인구가있는만큼 셀 사이의 공간 관계를 지정에서 셀 - 셀 또는 셀 - ECM 상호 작용의 역할을 명료하게하다하는 공동의 문화 두 (또는 그 이상)에 사용할 수 있습니다. 세포 세포 결합 및 세포 - ECM 부착은 악성 침입, 상처 치유, 및 조직 공학에 응용 프로그램을 위해 배아 개발, 종양 - stromal 세포 상호 작용 연구의 기초입니다. 이 간단한 방법은 biomechanical 속성 측정이나 생리학 관련 모델에서 분자와 생화 학적 분석을 위해 세포 집계와 같은 조직을 생성하는 수단을 제공합니다.

우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

세포 간 응집 및 세포-기질 부착에 관한 연구는 역사적으로 단단한 기질에 부착된 단층 배양 세포를 대상으로 수행되어 왔습니다. 세포 ...

본 실험의 목적은 3D 조직 유사 스테로이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 세포를 회수하고 단일 세포 현탁액을 생성함으로써 수행됩니다. 그다음, 세포 현탁액 방울을 조직 배양 접시의 뒤집힌 뚜껑 아랫면에 도포합니다.그런 다음 뚜껑을 뒤집어 수화 챔버 위에 덮습니다. 마지막 단계는 응집체가 형성될 수 있도록 현탁 방울(hanging drops)을 24~48시간 동안 배양하는 것입니다. 이후 이를 진탕 수조로 옮겨 최대 5일 더 배양할 수 있습니다.최종적으로, 응축 분석, 조직 표면 10 대칭성 또는 에피 형광 현미경 검사를 통해 응집체 응집력이나 세포 분류의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 기존의 2D 조직 배양과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 3D에서 배양된 세포가 조직 환경 내의 세포가 겪는 세포 간 상호작용을 더 밀접하게 모방한다는 것입니다. 이제 PI조차도 수행할 수 있을 만큼 이 방법이 매우 간단하다는 것을 보여드리기 위해 시연하겠습니다.이 실험을 시작하려면, 90% 합류도(confluency)에서 부착 세포를 수확하십시오. 먼저, 배양액을 흡입하여 제거하고 PBS로 세포 시트를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고, 단층 세포층 위에 0.05% trypsin-EDTA 용액 2 mL를 피펫으로 분주합니다.플레이트를 37 °C 조직 배양 인큐베이터에 넣고 세포가 떨어져 나올 때까지 배양합니다. 다음으로, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내어 효소 처리를 중단시킵니다. 완전 배지 2 mL를 첨가합니다.5 mL 피펫을 사용하여 세포가 완전히 부유될 때까지 혼합물을 트라이투레이션(tritrate)합니다. 그다지 세포 부유액을 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 10 mg/mL DNA 용액 40 µL를 세포 부유액에 피펫팅하여 넣고, 상온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.세포 현탁액을 짧게 볼텍싱한 후 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 흡입하여 제거하고, 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁하여 세척합니다. 원심분리 과정을 반복하고 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁합니다.다음으로, 자동 세포 계수기 또는 혈구 계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 배지를 이용하여 세포 현탁액의 최종 농도를 2.5 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 그 후, 행잉

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

이 동영상은 흑색종 세포를 이용하여 행잉 드롭 방식으로 3차원 스페로이드를 생성하는 기술에 대해 설명합니다. 생성된 체외 3차원(3D) 유기형 흑색종 스페로이드 모델은 악성 흑색종의 생체 내 구조를 묘사할 수 있으며 종양 내 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

행잉 드롭 방법(Hanging Drop Method): 3D 흑색종 스페로이드를 생성하는 기술

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

학습하세요 한깅 드롭 배양법을 사용하여 3D 스페로이드를 생성하는 간단한 세포 배양 기술을. 이 방법은 세포 간 상호작용 연구와 조직 공학 연구에 효율적으로 활용됩니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

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