3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

이 실험의 목적은 스테로이드와 같은 3D 조직을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 세포를 수확한 다음 단일 세포 현탁액을 생성함으로써 달성됩니다. 세포 현탁액의 다음 방울, 조직 배양 접시에서 거꾸로 된 뚜껑의 아래쪽에 증착됩니다.

그런 다음 뚜껑을 수화 챔버로 뒤집습니다. 마지막 단계는 응집체가 형성될 수 있도록 24-48시간 동안 매달린 방울을 배양하는 것입니다. 그런 다음 진탕 수조로 옮겨 최대 5일 동안 더 배양할 수 있습니다.

궁극적으로, 압축 분석, 조직 표면 10 대칭 또는 epi 형광 현미경 검사를 통해 응집력 또는 세포 분류의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 기존의 2D 조직 배양과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 3D에서 성장한 세포가 조직 환경에서 세포가 경험하는 세포 상호 작용을 더 밀접하게 모방한다는 것입니다. 이 방법을 시연하여 PI도 할 수 있을 정도로 간단하다는 것을 보여드리겠습니다.

이 실험을 시작하려면 90%co fluency에서 부착 세포를 수확합니다. 먼저 배양 배지를 흡인하고 PBS로 세포 시트를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 EDTA 용액에서 2 밀리리터의 0.05 % 트립을 단층 층에 피펫팅합니다.

플레이트를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 넣고 세포가 분리될 때까지 배양합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 화를 중지합니다. 2 밀리리터의 완전한 매체를 추가합니다.

5ml 피펫을 사용하여 세포가 완전히 현탁액이 될 때까지 혼합물을 삼중분파합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 밀리리터당 10밀리그램의 40마이크로리터를 피펫으로 DNA 용액을 세포 현탁액에 넣고 배양 후 5분 동안 실온에서 배양합니다.

세포 현탁액을 잠시 소용돌이친 다음 200배 중력에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 S 상층액을 흡입하고 버린 다음 팔레트를 1ml의 완전한 배지에 다시 현탁시켜 세척합니다. 펠릿에서 원심분리와 리스를 1밀리리터의 완전한 배지에 반복합니다.

다음으로, 자동 세포 계수기 또는 혈구 분석기를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 배지를 사용하여 세포 현탁액을 밀리리터당 6개 세포에 대해 2.5 곱하기 10의 최종 농도로 조정합니다. 그런 다음 행잉 드롭의 형성으로 진행하십시오.

60mm 조직 배양 접시의 뚜껑을 제거하고 접시 바닥에 PBS 5ml를 피펫으로 주입하여 수화 챔버를 준비합니다. 플레이트의 뚜껑을 뒤집고 뚜껑 아래쪽에 최대 2010마이크로리터의 세포 현탁액을 떨어뜨립니다. 방울이 닿지 않도록 충분히 떨어져있는지 확인하십시오.

방울 배양액이 들어 있는 뚜껑을 PBS가 들어 있는 접시 바닥에 다시 부드럽게 끼웁니다. 배양 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 설정하고 밤새 배양합니다.

매일 방울을 모니터링하고 세포 시트 또는 응집체가 형성될 때까지 배양을 계속합니다. 세포 시트 또는 응집체가 형성되면 3ml의 완전한 배지를 포함하는 둥근 바닥 유리 셰이커 플라스크로 옮깁니다. 세포 시트 또는 응집체를 포함하는 플라스크를 흔들리는 수조에서 배양합니다.

해부 현미경으로 스테로이드 형성을 시각화할 수 있을 때까지 약 24시간 동안 섭씨 37도와 5% 이산화탄소로 유지합니다. 스테로이드가 형성되면 스테로이드 형성에 대한 실험적 조작의 효과는 서면 프로토콜에 설명된 절차에 따라 정량화될 수 있습니다. 또한 이전에 포함된 형광 염료의 멤브레인 삽입은 이제 형광 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다.

이 명시야 현미경 이미지는 행잉 드롭 방법을 사용하여 18시간 배양 후 쥐 전립선암 다발성 경화 세포의 응집을 보여줍니다. 이 이미지는 행잉 드롭 방법을 사용하여 18시간 배양 후 형성된 MLL 세포의 두 번째 응집체를 보여줍니다. 이들 세포는 MEK 억제제 PD 9, 8, 0, 5, 9 25 마이크로몰의 존재 하에서 배양되어, 실질적으로 더 조밀한 세포 응집체를 생성하였다.

여기에서는 MEK 억제제 처리된 MLL 행잉 드롭 배양물, 응집체 크기와 처리되지 않은 대조군 응집체 크기의 차이를 입증합니다. 별표는 P가 0.0001보다 작다는 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 학생들이 결정한 바와 같이, 처리되지 않은 응집체와 MEK 억제제로 처리된 응집체를 비교한 결과, MEK 억제제 처리는 훨씬 더 작고 더 조밀한 응집체를 생성한다는 것을 시사합니다.

이 이미지는 Nikon Smz 800 실체 현미경을 사용하여 캡처한 것으로, 18시간 동안 매달아 배양 배양에서 병아리 배아 간 세포를 배양하여 형성된 스테로이드를 보여줍니다. 그런 다음 섭씨 37도의 흔들리는 수조에서 48시간 동안 사용합니다. 이 컨포칼 현미경 이미지는 행잉 드롭 배양을 진행하기 전에 특정 세포 집단을 행잉 드롭 방법을 사용하여 공동 배양할 때 발생하는 분류 동작을 보여줍니다: 병아리 배아 간 세포는 pkh 2개의 멤브레인 인터 코팅 염료와 병아리 배아로 염색되었습니다.

심장 세포는 PKH 26으로 염색하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 혼합하고 매달아 떨어뜨렸습니다. 배양은 18시간 동안 수행된 후 섭씨 37도의 흔들리는 수조에서 48시간 동안 배양했습니다.

광학 섹션에서 노란색으로 표시된 심장 세포가 간 세포로 둘러싸여 있음을 알 수 있습니다. 여기서는 유사 색상이 파란색이며, 두 개의 nardi 및 transfected L 세포 클론이 표면에서 NCA를 발현합니다. 2.4 대 1의 비율로 형광막으로 염색하여 염료를 조합하고, PKH 2와 PK KH 26을 동일한 비율로 혼합하여 이전과 같이 매달린 방울로 배양하였다.

이 예에서, 유사 녹색인 고급 cadian 발현 세포는 유사 색상인 빨간색인 낮은 수준의 en cadian을 발현하는 세포로 둘러싸여 있습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 30분 이내에 완료할 수 있습니다.