3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

이 실험의 목적은 3D 조직 유사 스테로이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 세포를 수확한 후 단일 세포 현탁액을 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포 현탁액 방울을 조직 배양 접시의 뒤집힌 뚜껑 아랫면에 배치합니다.

그 후 뚜껑을 뒤집어 수화 챔버 위에 덮습니다. 마지막 단계로, 응집체가 형성될 수 있도록 현수적(hanging drops)을 24에서 48시간 동안 배양합니다. 이후 이를 진탕 수조로 옮겨 최대 5일 더 배양할 수 있습니다.

최종적으로 응집 압착 분석, 조직 표면의 대칭성 확인 또는 형광 현미경 관찰을 통해 응집체 응집력이나 세포 분류의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존의 일반적인 2D 조직 배양과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 3D에서 배양된 세포가 조직 환경 내의 세포들이 겪는 세포 간 상호작용을 더 밀접하게 모방한다는 점입니다. 이제 PI조차도 수행할 수 있을 만큼 매우 간단한 이 방법을 시연해 보겠습니다.

본 실험을 시작하려면, 90% 합류도(confluency)에서 부착 세포를 수확하십시오. 먼저, 배양액을 흡입하여 제거하고 PBS로 세포 시트를 두 번 헹굽니다. 그 다음 PBS를 흡입하여 제거하고 0.05% Trypsin-EDTA 용액 2 mL를 단층 세포층 위에 피펫으로 분주합니다.

플레이트를 37 °C 조직 배양 인큐베이터에 넣고 세포가 떨어져 나올 때까지 배양합니다. 그 다음, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 효소 처리를 중단합니다. 2 mL의 완전 배지를 첨가합니다.

5 mL 피펫을 사용하여 세포가 완전히 부유될 때까지 혼합물을 트라이튜레이션(trituration)합니다. 그 후 세포 부유액을 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 10 mg/mL DNA 용액 40 µL를 세포 부유액에 피펫팅하여 넣고, 실온에서 5분 동안 배양합니다.

세포 현탁액을 짧게 볼텍싱한 후 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액 S를 흡입하여 제거하고, 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁하여 세척합니다. 원심분리를 반복하고 펠렛을 1 mL의 완전 배지에 다시 현탁합니다.

다음으로, 자동 세포 계수기 또는 혈구 계수기(hemo cytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 배지를 사용하여 세포 현탁액의 최종 농도가 2.5 × 10⁶ cells/mL가 되도록 조정하십시오. 그 후 행잉 드롭(hanging drops) 형성을 진행하십시오.

60 mm 조직 배양 접시의 뚜껑을 제거하고 접시 바닥에 5 mL의 PBS를 피펫팅하여 습윤 챔버를 준비합니다. 플레이트의 뚜껑을 뒤집고 뚜껑 안쪽에 세포 현탁액을 20~10 µL씩 방울 형태로 피펫팅합니다. 이때 방울들이 서로 닿지 않도록 충분한 간격을 두고 배치하십시오.

드롭 배양물이 담긴 덮개를 PBS가 들어 있는 접시 바닥 위에 조심스럽게 다시 덮습니다. 배양 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 37 °C, 5% carbon dioxide, 95% 습도로 설정하고 하룻밤 동안 배양합니다.

매일 드롭(drop)의 상태를 관찰하고, 세포 시트(cell sheet) 또는 응집체가 형성될 때까지 배양을 계속합니다. 세포 시트 또는 응집체가 형성되면, 이를 3 mL의 완전 배지가 들어 있는 라운드 바텀 유리 쉐이커 플라스크(round bottom glass shaker flask)로 옮깁니다. 세포 시트 또는 응집체가 포함된 플라스크를 진탕 수조(shaking water bath)에서 배양합니다.

스테로이드 형성이 해부 현미경으로 관찰될 때까지 약 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 조건에서 유지합니다. 스테로이드가 형성되면, 서면 프로토콜에 설명된 절차에 따라 실험적 조작이 스테로이드 형성에 미치는 영향을 정량화할 수 있습니다. 또한, 이전에 포함된 형광 염료의 막 삽입 여부를 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.

이 명시야 현미경 이미지는 현탁 방울법(hanging drop method)을 사용하여 18시간 동안 배양한 후 쥐 전립선암 MLL 세포의 응집 상태를 보여줍니다. 이 이미지는 현탁 방울법을 이용한 18시간의 배양 후 형성된 MLL 세포의 두 번째 응집체를 보여줍니다. 이 세포들은 25 $\mu$M의 MEK 억제제 PD 9 8 0 5 9가 존재하는 환경에서 배양되었으며, 그 결과 세포 응집체가 상당히 더 조밀하게 형성되었습니다.

여기에서는 MEK 억제제를 처리한 MLL 현수 적하 배양(hanging drop culture)의 응집체 크기와 처리하지 않은 대조군 응집체 크기 간의 차이가 나타나 있습니다. 별표는 P 값이 0.0001 미만인 통계적으로 유의미한 차이를 나타냅니다. 이는 미처리 응집체와 MEK 억제제 처리 응집체 간의 student T-test로 결정되었으며, MEK 억제제 처리가 응집체의 크기를 유의미하게 작고 더 조밀하게 만든다는 것을 시사합니다.

이 이미지는 Nikon Smz 800 실체 현미경을 사용하여 촬영되었으며, 병아리 배아 간 세포를 hanging drop 배양으로 18시간 동안 배양한 후, 37 °C의 진탕 수조에서 48시간 동안 배양하여 형성된 스테로이드를 보여줍니다. 이 공초점 현미경 이미지는 hanging drop 방법을 사용하여 특정 세포 군집을 공동 배양했을 때 나타나는 sorting out 거동을 보여줍니다. hanging drop 배양을 진행하기 전, 병아리 배아 간 세포는 pkh two 막 간 코팅 염색약과 병아리 배아로 염색되었습니다.

심장 세포를 PKH 26으로 염색하였습니다. 이후 세포 현탁액을 혼합하여 행잉 드롭(hanging drop)법으로 배양하였습니다. 18시간 동안 배양한 후, 37 °C의 진탕 항온수조에서 48시간 동안 추가로 배양하였습니다.

광학 절단면을 통해 노란색으로 염색된 심장 세포가 간 세포에 둘러싸여 있는 것을 확인할 수 있습니다. 여기에서 파란색으로 가상 염색된 것은 표면에 NCA를 발현하는 두 개의 nardi 및 transfection된 L 세포 클론입니다. 2.4 대 1의 비율로, 동일한 비율로 혼합된 형광 막 결합 염료인 PKH 2와 PK KH 26으로 염색되었으며, 이전과 동일하게 매달린 방울(hanging drop) 방식으로 배양되었습니다.

이 예시에서는 녹색으로 가상 채색된 high-end cadian 발현 세포들이 적색으로 가상 채색된 낮은 수준의 en cadian 발현 세포들에 의해 둘러싸여 있습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 30분 이내에 완료할 수 있습니다.