외상성 뇌 손상 연구를위한 Neuronal 셀의 충동 가압

본 실험 절차의 전반적인 목표는 외상성 뇌 손상 연구를 위해 배양된 뇌 세포에 충격적 가압을 가하고 이를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 레티노산(retinoic acid)을 사용하여 배양된 세포의 신경 분화를 유도함으로써 수행됩니다. 다음으로, 신경 세포를 ksky bar 기반 세포 가압 장치에 배치하고 폭발로 인한 외상성 뇌 손상과 관련된 크기와 지속 시간의 충격압에 노출시킵니다.

마지막으로, 세포 손상 및 외상성 뇌 손상의 가능한 메커니즘을 평가하기 위해 세포에 분자 생물학적 분석을 수행합니다. 현미경 검사 결과, 2 megapascal 강도와 0.7 millisecond 지속 시간의 충격 가압 시 신경세포 사멸과 신경돌기 축삭 구조의 손실이 나타났습니다. 유체 타격법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 음압 구간이 없으며 지속 시간이 정밀하게 제어된다는 점입니다.

이 방법은 충격 압력, 크기, 지속 시간 및 하중 형태에 따른 신경 세포 사멸 또는 손상의 임계값과 같이 외상성 뇌손상(TBI) 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 지금까지 저희 연구 그룹에서는 이 방법을 폭발 유도 TBI 연구에 사용해 왔으나, 충격 유도 TBI와 같은 다른 유형의 외상성 뇌손상 연구에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차는 Chen fang 교수 연구실의 대학원생 Matthew와 제 연구실의 기술자 li ha가 시연할 예정입니다.

본 실험에서는 Ksky 바를 세포 가압 장치로 설정하여 사용합니다. 이 장치는 정렬된 황동 베어링에 의해 매달린 두 개의 6m 알루미늄 합금 바와 인 비트로(in vitro) 세포 가압 챔버로 구성됩니다. 두 바 사이에 끼워진 세포 가압 챔버는 피스톤 실린더로 이루어져 있습니다.

실린더 캐비티 바닥에는 작은 구멍이 뚫려 있어, 세포 시료를 설치하는 동안 공기와 과잉 액체를 배출합니다. 피스톤은 바와 동일한 튜브로 제작되었으며 테플론 테이프를 두세 겹으로 감아 만들어졌습니다. 엔드 캡은 두 개의 작은 스테인리스 스틸 나사로 유리 커버 슬립을 고정합니다.

본 시연에서는 SH SY five Y 인간 신경모세포종 세포를 사용합니다. 하지만 이 프로토콜은 많은 세포 모델 배양에 적용 가능합니다. 세포를 직경 18 mm 유리 커버슬립에 3000 cells/cm² 밀도로 분주합니다.

보충된 DMEM에서 세포를 배양하는 동안, 10 micromolar 레티노산(retinoic acid)을 배지에 첨가하여 7일 동안 세포의 분화를 유도하며, 배지는 2일마다 교체합니다. 7일째에 세포는 잘 발달된 신경돌기 축삭 구조를 나타내며 가압 준비가 완료됩니다. 모든 가압 챔버 부품을 오토클레이브로 멸균하고, 챔버를 조립하는 동안 UV 램프 아래에 보관하십시오.

배양 후드 내에서 챔버의 통기 나사가 공기 배출구에 느슨하게 체결되어 있는지 확인하십시오. 공동의 바닥 부분에 갓 제조한 따뜻한 배양액을 채웁니다. 그다음, 세포가 바깥쪽을 향하도록 세포 배양 유리 슬라이드를 피스톤 캡에 나사로 고정한 후, 피스톤을 챔버 공동 내에 조심스럽게 장착하십시오.

벤트 나사를 제거하고 벤트를 위쪽으로 기울인 다음, 피스톤을 챔버 내부의 미리 설정된 기준선까지 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 셀 가압 챔버 내에 약 6 mm의 유체 깊이가 남게 됩니다. 기포가 유입되지 않도록 주의하며, 벤트 나사를 소독한 후 다시 장착하여 챔버를 수밀 상태로 만듭니다.

챔버는 정하중 상태에서 누설이 없어야 합니다. Ksky 바 시스템을 재설정하십시오. 무거운 질량을 원래 위치로 되돌리고 잠금 볼트를 다시 장착하십시오.

잠금 볼트는 핀이 부러질 때까지 입사봉의 이동을 방지하는 클램핑 힘을 유지합니다. 유압 잭을 사용하여 새 잠금 볼트를 약 200 PSI까지 체결하십시오. 가위형 잭을 사용하여 입사봉의 예하중 구간을 원하는 값보다 약간 높은 압력으로 압축한 다음, 잭 나사의 전체 마찰력이 작용하도록 약간 풉니다. 이제 가압 시간이 약 1밀리초이므로 데이터 수집 장치를 설정하십시오.

휘트스톤 브리지 회로에 2000 ohm 스트레인 게이지를 사용하여 샘플링 주파수를 1 MHz로 설정하십시오. 송신봉의 전압은 45 V로 설정해야 합니다. 피스톤이 송신봉을 향하도록 셀 챔버를 장착하십시오.

셀 챔버를 소형 실험실 시저스 잭(scissors jack)으로 지지되는 V 블록에 놓고 두 막대와 정렬시킵니다. 각 접촉면에 그리스를 얇게 바르고, 표면을 부드럽게 문질러 접촉면 사이의 공기를 제거합니다. 이제 시스템 준비가 완료되었습니다.

데이터 수집 장치를 활성화하고 유압 클램프 드라이버를 빠르게 펌핑하여 테스트를 수행합니다. 이렇게 하면 잠금 볼트가 파손되어 클램프가 분리되고, 그 결과 압력파가 세포로 전달됩니다. 테스트 후, 배양 후드 내에서 챔버로부터 슬라이드를 꺼내 세포 거동 평가를 진행합니다.

숙련되었을 때, 이 장치를 사용하여 시간당 약 9개의 세포 배양 슬라이드를 가압할 수 있습니다. 판독값을 분석할 때 투과 바 신호의 시작 부분에서 기포로 인한 오류가 나타날 수 있으나, 본 시연에서는 나타나지 않습니다.

투과 막대(transmittance bar)가 충분히 길다면, 가장 중요한 데이터는 첫 번째 교란과 함께 시작되어 측정값이 음압을 나타내는 지점에서 종료되어야 하며, 이 전압 판독값은 스트레인 게이지 분석을 통해 세포가 경험하는 응력에 비례합니다. 투과 펄스의 지속 시간은 입사 펄스보다 짧을 수 있습니다. 세포 가압 챔버 내 유체에 작은 기포가 갇혀 있는 경우, 투과 펄스의 크기가 입사 펄스의 크기를 초과하지 않을 수 있으나, 하중 제거 전까지 충분히 긴 평탄부(plateau)를 가져야 합니다.

그렇지 않은 경우, 밀폐된 챔버 내에 커다란 공기 방울이 갇혀 있거나 어셈블리와 바(bar)의 정렬이 맞지 않는 것입니다. 가압 후, 세포를 즉시 검사하거나 이후 검사를 위해 추가로 배양할 수 있습니다. 가압된 세포를 동일하게 처리되었으나 가압되지 않은 챔버 대조군 세포와 비교하여, 배양 후 다양한 시점에서 광학 현미경으로 신경돌기 길이의 변화를 평가합니다.

액틴 면역형광 염색은 세포골격의 변화를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 또한, 미세소관 관련 단백질 2(microtubule associated protein two) 항체를 사용하여 주요 신경세포 마커 중 하나의 변화를 시각화할 수 있습니다.

충격 가압이 신경 세포 및 세포 사멸 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하려면, 필요한 경우 R-T-P-C-R과 같은 표준 분자 생물학 기법을 사용하십시오. 면역 블로팅에 필요한 충분한 세포 용해물은 동일한 압력을 가한 여러 세포 샘플로부터 수집할 수 있습니다. 본 예시의 가압 프로파일에서 ksky bar 장치는 광학 현미경 이미지에서 확인되는 바와 같이, 배양된 신경 세포에 약 0.7 millisecond 지속 시간의 2 megapascal 수준 단일 펄스형 충격 압력을 성공적으로 가하였습니다. 2 megapascal 충격 압력을 받은 SHSY five Y 인간 신경 세포는 가압하지 않은 대조군 세포와 비교하여 뚜렷한 신경 돌기 축삭 붕괴를 보입니다.

이 절차를 수행할 때는 항상 유체 가압 챔버를 이와 같이 잡아야 하며, 그렇게 하지 않을 경우 배양 후 세포가 음압에 노출될 수 있습니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 제어된 가압 조건 하에서 외상성 뇌 손상의 세포 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. Army UNL Center for Trauma Mechanics의 연구비 지원에 감사드립니다.