Name: 외상성 뇌 손상 연구를위한 Neuronal 셀의 충동 가압 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 Kolsky bar 장치를 이용한 신경세포 충동 가압법으로 외상성 뇌손상 메커니즘을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 정밀한 압력 제어와 세포 손상 평가를 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

외상 기계를위한 육군-UNL 센터 (국방부 / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI : 박사 Namas 찬드라), UNL 뜻하는 상 (26-1110-0033 -001 저자는 자금 소스를 감사드립니다 , PI : 임).

1. Neuronal 세포 배양 <ol><li> neuronal 세포, astrocytes, 그들의 공동 문화 등 뇌 세포가 세포 모델로 사용할 수 있습니다. 타당성 데모로서, 셀 라인 neuronal 세포의 충동 가압이 제공됩니다. </li><li> SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포 (ATCC, CRL-2266)은 18mm 직경의 유리 coverslips에 배양되어 있습니다. 셀 3의 밀도에 놓는 아르 × DMEM로 구성된 성장 미디어를 사용 10 3 셀 / cm 2 10% 태아 소 혈청과 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충. 세포 배양 유리 슬라이드는 37 ° C.에서 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 보관 </li><li> SH-SY5Y 세포의 neuronal 세포 분화를 구하려면 셀이 추가로 미디어를 7 일 동안 10 μM retinoic 산 (RA)로 보충 미디어와 취급 이틀마다 변경했습니다. 일 7, 세포는 가압 될 준비가 된 것입니다. </li></ol> 2. 가압 설비 : Kolsky 바 <ol><li> Kolsky 바, 드1949 년 Kolsky 1 일까지 veloped, 매우 높은 로딩 속도에서 재료의 기계적 성질을 측정하기 위해 사용되었습니다. 장치는 바 사이의 접촉에 배치 샘플과 막대가 두 개로 구성되어 있습니다. 사건 표시 줄에 생성 된 응력 파, 파도가 반영하고 전송 파도로 분할 샘플로 전파합니다. 샘플에서 스트레스가 전송 파도에 비례합니다. 본 연구에서는, 우리는 설정 Kolsky의 두 바 사이에 위치 할 셀 가압 챔버를 사용합니다. </li><li> 두 알루미늄 합금 바 (각 6 m 길이)를 정렬 황동 베어링에 의해 정지되며, 체외 세포 가압 챔버에서이 막대 사이에 끼어 있습니다. 상류 바 한쪽 끝에 고정 130파운드 질량과 사고 바 있습니다. 마찰 클램프가 원하는 펄스 기간을 제공하는 위치에 배치됩니다. 클램프의 관심을 유도하고 질량 및로드 지원 사이의 가위 잭을 강화함으로써, 사고 바 클램프 - 질량 섹션 사전-C입니다원하는 수준 ompressed. 유압 시스템에 갑자기 휴식에 클램프를 잠급 노치 볼트를 강요하는 것은 빠르게 미리 저장된 압축을 출시하기 때문에 압력 펄스를 생성합니다. 이 사건 바을 통해 전파, 테스트 챔버 피스톤 드라이브, 충동 챔버 내의 유체 및 세포를 pressurizes. 차례로 챔버 압력은 전송 바 하류에 전파 압력 펄스를 시작합니다. 바에서의 압력 펄스와 관련된 변종이 45 볼트에 흥분 복합 높은 저항 스트레인 게이지로 측정하고 있습니다. 게이지 신호는로드의 역사 제 1 MHz의 주파수에서 디지털 오실로스코프로 기록됩니다. </li><li> 체외 세포 가압 챔버에서는 피스톤 실린더로 구성되어 있습니다. 실린더는 2.6 cm 내부 직경 3.8 cm 외경을 가지고 있으며, 캐비티의 밑바닥에 도청 작은 구멍이 있습니다. 그 구멍은 세포 샘플 설치하는 동안 공기와 과도한 유체 배출구 역할을합니다. 피스톤은 7.5 cm 길이와 동일한 바 소재로 만들어진다. 피스톤은 낮은 마찰 인감의 역할 배관공 (테플론) 테이프 2 ~ 3 층으로 싸여 있습니다. 엔드 캡은 오래 32mm이며, 로딩 중에 유리 coverslips을 (세포 배양되는에) 확보 두 개의 작은 스테인레스 스틸 나사가 있습니다. </li></ol> 3. Neuronal 셀의 충동 가압 <ol><li> 모든 가압 챔버 부품은 압력솥을 사용하여 소독하고 UV 빛 아래에서 유지됩니다. 챔버의 조립은 세포 배양 후드 안쪽에 수행됩니다. 챔버의 배기 나사가 느슨하게 구멍의 밑바닥에 공기에 종사하고 있습니다. 사전 예열 (37 ° C) 신선한 성장 미디어 거품을하지 않고 챔버에 pipetted 있습니다. 그런 다음 셀 배양 유리 슬라이드는 픽업하고 있으며, (외부에 직면 세포) 피스톤의 뚜껑에 표시됩니다. 작은 보유 나사는 그 자리에 개최 할 수있는 슬라이드에 아래로 강화됩니다. 세포 배양 유리 슬라이드와 피스톤 삽입 조금 전n 인물 챔버의 구멍, 그리고 어셈블리가 가장 높은 지점에서되는 통풍구를 기울입니다. 배기 나사가 제거되고 피스톤을 먼저 한 다음 기포, 과도한 유체를 강요 구멍에 밀어 있습니다. 어느 참조 마크 나 지그는 모든 테스트에 동일한 문화 미디어 볼륨을 보장하기 위해 가이드로 사용됩니다. 챔버에있는 미디어의 축 크기가 6mm에 있습니다. 배기 나사를 살균하고 꽉 챔버 물을 만들기 위해 그것을 교체하십시오. 챔버는 않는 경우, 테플론 랩이 교체하거나 강화해야 할이 정적 하중에 따라 누출해서는 안됩니다. </li><li> 이 시점에서, Kolsky 바 시스템이 재설정됩니다. 무거운 질량은 원래의 위치로 다시 이동하고 새로운 잠금 볼트는 사용 된 (깨진)를 대체합니다. 약 200 PSI에 유압으로 새로운 잠금 볼트를 유도합니다. 원하는 값보다 약간 높은 압력으로 사건 바의 사전로드 섹션을 압축 가위 잭을 사용하고, 다음의 전체 마찰을 참여 할을 백업잭의 나사. 데이터 수집은 이제 무장되어 있습니다. </li><li> 조립 셀 가압 챔버는 시스템에 장착된다. 그것은 작은 실험실 가위 잭에서 지원하는 V 블록에 배치하고 두 개의 막대로 정렬되어 있습니다. 가벼운 기름 층 사이에 에어 갭을 제거하는 함께 간섭 표면을 문질러과 그리스 각 인터페이스에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> 시험은 이제 시작 할 준비가되어 있습니다. 클램프 잠금 볼트는 빠르게 유압 클램프 드라이버를 펌핑하여 침입을 강요하고 있습니다. 결과를 클램프가 분리되며 데이터 수집이 표시됩니다. 세포 가압 내역은 전송 바 게이지의 측정에서 결정됩니다. 사용 된 전송 표시 줄이 충분히 인 경우 측정이 부정적인 압력을 게재 위치이는 지점에 첫 번째 장애에서해야합니다. 거품이 덫 경우 전송 펄스의 기간은 사건 펄스보다 짧을 수 있습니다. 크기는 사건 펄스의 도달하지 않을 수 있습니다,하지만 충분히 경도가 있어야합니다하역하기 전에 g 고원. 그렇지 않으면, 밀봉 된 챔버 또는 어셈블리 및 바 사이의 misalignment에서 큰 기포 하나가 발생했을 수도 있습니다. </li><li> 세포 가압 챔버 그런 다음 제거하고 세포 배양 후드 내부 분해된다. 배기 나사가 제거되고 피스톤이 챔버의 무료 당겨 있습니다. 세포 배양 유리 슬라이드는 피스톤의 끝에서 가져옵니다. </li></ol> 4. 가압 셀 행동을 평가 <ol><li> 가압 후, 세포는 즉시 검사 할 수 있습니다 또는 더 이상 시험을 incubated. 적절한 무균 조작 과정을 통해 장기적 후 부화이 가능합니다. </li><li> 가압 셀은 모든 분자와 세포 생물학 기법을 면밀히 검토 할 수 있습니다. 특히 neuronal 세포 가압를 들어, assays는 neurite 가지의 압력 유발 변경, 미세 소관 cytoskeletal 변화, neuronal 유전자 expre을 평가, 외상성 뇌 손상 조건에서 세포와 분자 생리학을 조사 할 수ssion, apoptosis 등은 수행 할 수 있습니다. 제어 세포 샘플, 동일한을 배양 아르 세포는 같은 기간 동안 가압 챔버 내부에 보관하지만, 가압되지는 (그래서, 챔버 제어를 호출)를 사용 때문입니다. </li><li> neurite 가지의 변화를 평가를 들어, 가압 및 챔버 제어 셀은 즉시 가압 및 사후 부화의 1, 24 H 후 광학 현미경으로 검사합니다. neuronal 세포 이미지의 예는 '대표 결과'섹션 (그림 2)에 표시됩니다. neurite 길이 변경 고를 immunofluorescent 착색 및 이미지 분석하여 정량화 할 수 있습니다. 셀은 0.05 % V / V 트윈-20 세척 버퍼로 헹구어 4 % W / V paraformaldehyde 솔루션으로 고정하고, 0.1 % 브이 / v 튼 X-100 솔루션을 permeabilized 있습니다. 1 % w / v를 소 혈청 알부민 솔루션으로 차단 한 후에 세포 tetramethylrhodamine의 isothiocyanate (TRITC) - 복합 phalloidin와 incubated 수 있습니다. 셀의 Immunofluorescent 이미지는 형광등을 사용하여 이동합니다현미경과 가압 및 제어 세포에 대한 neurites의 길이는 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 평가합니다. </li><li> neurites는 axons 또는 수석으로 식별 할 수 있습니다. axons 또는 수석의 형태학의 변화를 평가하기 위해 실험 위에서 설명한 각 구조를 검출 항체를 사용하여 반복 할 수 있습니다, 즉 수석에 대한 axons와 미세 소관 - 관련 단백질 (MAP2) 항체에 대한 neurofilament (NF) 항체. </li><li> 미소는 뉴런의 핵심 cytoskeletal 구성 요소 중 하나이며, 미소에 손상 neuronal 부상의 마커로 사용되었습니다.이 미세 소관은 β-tubulin 항체를 사용하여 immunofluorescently 시각화 할 수 있습니다. 셀은 후 가압 0, 24 H 후 고정 β-tubulin 항체 물들과 형광 현미경에 의해 관찰된다. </li><li> neuronal 및 apoptotic 유전자 발현에 대한 충동 가압의 효과를 평가하기 위해, 총 RNA는 가압 및 제어 세포에서 추출됩니다. 일반전자의 발현은 우리의 게시 된 프로토콜과 유사 정량 RT-PCR 또는 실시간 RT-PCR을 수행하여 검사를 할 수 있습니다. 3 </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 압력 프로파일의 예는 가압 챔버 내에서 세포에 적용. Kolsky 바 장치를 성공적으로 0.7에 대한 MS의 기간이있는 2 MPA 수준, 단일 펄스 타입 충동적인 가압를 생성합니다. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 충동 가압에 neuronal 세포 응답의 예라고 할 수 있습니다. SH-SY5Y 세포는 챔버 제어 세포에 비해 두 MPA 쇼 독특한 neurite / 축삭 고장에서 충동 적 가압에 노출. 6. 어려움과 솔루션 <ol><li> 상공 회의소 실링은 극복 할 주요 장애물 중 하나입니다. 그것은 강한 것입니다O-링과 다양한 디스크 가우 징 및 증가 마찰의 문제를 가지고 놀이. 마찰 효과를 제거뿐만 아니라 가우 징, 테플론 배관 테이프 피스톤 녹음의 간단한 방법을 방지하기 위해 사용됩니다. 이 문제를 해결하여 원하는 압력 수준과 기간을 생산하고 있습니다. </li><li> 가압 neuronal 세포 행동은, 보조 외상성 뇌 손상 메커니즘이나 장기적 효과를 평가 특히 오랜 후 배양 시간 후에 검사해야합니다. 세포 함유 챔버는 Kolsky 바로 이동 pressurizing 및 세포 배양 후드로 다시 이동하는 동안 잠재적 인 조건을 unsterile에 노출되어 있습니다. 챔버 부품 및 / 분해 세포 배양 후드 내부의 세포 배양 슬라이드와 챔버의 조립에 적절한 작업의 사전 살균을 통해 장기적인 후 부화는 몇 주까지 가능합니다. </li><li> 데이터의 재현성 세포 기계 자극 실험에서 중요한 매개 변수입니다. 우리의 장치 reproducibilit에 대한neuronal 세포 응답의 Y는 충동 적 가압 프로필을 원하는 방법을 결정, 압력 수준과 기간 모두에서 반복적으로 얻어진다. 우리가 각 가압 용 얻은 압력 프로파일을 기록하기 때문에, 원치 않는 압력 프로필에서 세포 응답 데이터를 수동으로 나중에 제외 할 수 있습니다. </li><li> 챔버 조립, 전송 및 Kolsky 바, 가압, 전송 - 다시, 그리고 챔버 분해에 마운트를 포함한 전체 가압 단계는, 이하의 10 분을. 다음 세포 배양 슬라이드는 이전 가압 후 바로 가압 될 수 있습니다. 따라서, 가압 실험의 충분한 수를 효율적으로 완료 할 수 있습니다. 우리의 설정은 18mm 직경 유리 coverslips을 활용합니다. 하나의 가압 실험은 기판의 크기로 인해 immunoblotting 서쪽에 충분한 단백질을 (그리고 또한 부분적으로 가압 세포의 일부가 죽었 때문에) 제공하지 않습니다. 세명의 반복 가압 실험은 immunobl에 필요한 단백질 양을 제공합니다otting. 다시 말하지만, 재현성이 압력 프로필로 할 때마다 검사합니다. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

체외 실험 기술의 대부분은 외상성 뇌 손상 조건에서 뇌 세포 손상을 공부를 위해 시도되었습니다. 이러한 이것은 짧은 기간 과압이 외상성 뇌 손상에 대한 지배 물리적 요소입니다 것으로 간주되었습니다 / astrocyte 스트레칭, 흐름 유도 전단 응력 신경 세포, 체중 드롭, 스타일러스가 찢어진, 레이저 절개, lithotripsy 등 4,5이 포함되어 있습니다. 특히 6,7를 , 외상성 뇌 손상 폭발의 충격파는 밀리 초의 주문 펄스 기간이 있습니다. 4 이러한 가정하고 관찰을 바탕으로, 과도 가압 할 수있는 기압계 챔버는 개발 및 외상성 뇌 손상 조건 하에서 뇌 세포의 행동을 평가에 사용되었습니다. 예를 들어, 유체 타악기 barotrauma 챔버 0.5 MPA에 20-30 밀리 긴 기간 및 최대 피크 압력과 압력 펄스에 외상성 뇌 손상에서 인간 glial 세포의 동작을 검사하는 데 사용되었다. 6 최근 VandeVord 외 7. 사용 금속 astrocyte 세포를 검사하기 위해 볼 인상적인 기압계 챔버외상성 뇌 손상에 따라 행동하지만, 금속 공을 여러 압력 펄스를 생산 놀라운. 본 연구에서는, 우리는 단일 펄스 타입 충동적인 압력을 생성하는 새로운 세포 가압 장치를 개발했습니다. 장치는 우리의 8 기타의 연구 재료 시험 장치로 사용 된 Kolsky 바 설정을 기반으로 개발되었습니다. 매우 높은 로딩 속도 1,9 Kolsky 바의 재료 시험 기능을 할 수 있다는 것이 수정되었습니다 가압 챔버 (그림 1)에서 배양 세포에 단일 펄스 형 압력을 적용합니다. 우리는 성공적으로 충동적인 압력의 크기와 기간을 조절할 수 있습니다. 대표 셀 응답, 우리는 unpressurized 챔버 제어 세포에 비해 두 MPA 압력 SH-SY5Y neuronal 세포에서 중요한 neurite 및 axonal 손실을 표시 보여 주었다. 결론적으로, 우리는 특별히 고안된 Kolsky을 사용하여 새로운 충동 셀 가압 장치를 개발바 장치와는 외상성 뇌 손상 조건에서 neuronal 세포 반응을 조사에 잠재적 인 사용을 보여 주었다. 우리는 또한이 기술은 세포의 종류가 다양한 수준과 기간에 충동 적 압력에 노출 될 수 있다는 매우 다양한됩니다. 따라서 장치는 세포의 손상뿐만 아니라 적극적으로 자신의 기능과 운명 결정에 세포를 자극 용뿐 아니라, 충동 적 압력 유발 세포 mechanotransduction의 동작을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) 인간 neuroblastoma 세포에게 </li><li> 18mm 직경 유리 coverslips </li><li> 세포 배양 매체 : DMEM, 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 </li><li> 유도 neurogenesis에 대한 Retinoic 산 (10 μM) </li><li> Kolsky 바 충동 가압 장치 </li><li> 피스톤 실린더 세포 가압 챔버 </li><li> 피스톤에 세포 배양 coverslip 보안을위한 스테인리스 나사 </li><li> 셀 챔버와 Kolsky 바 사이의 인터페이스에 대한 그리스 </li><li> 가압 (정착액, 항체, 형광 염료, PCR 용품, 등)에 세포 반응을 평가하기위한 일반 분자 생물학 공급 </li></ul>

외상성 뇌 손상 연구를위한 neuronal 셀의 충동 가압

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

소설 충동 세포 가압 실험은 폭발 유발 외상성 뇌 손상을 (외상성 뇌 손상) 조사 Kolsky 바 장치를 사용하여 개발되었습니다. 우리는 폭발 외상성 뇌 손상과 관련된 충동 가압는 체외에서 neuronal 세포에 적용하는 방법이 비디오 문서에 보여줍니다. 이것은 기록 된 세포 가압 챔버 내에서 전체 압력 역사와 함께 전문 Kolsky 바 장치에 의해 생성 잘 제어 압력 펄스를 사용하여 달성된다. 가압 neuronal 세포는 가압 한 후 즉시 검사, 또는 서로 다른 neurite 손실 친척을 유도 우리는 약 2 MPA에 그 충동 가압을 관찰 axonal / neurite 가지, neuronal 유전자 발현, apoptosis 등의 충동 가압의 장기적인 효과를 검토 할 더 incubated 아르 unpressurized 세포합니다. 우리 기술은 잘 제어 PR에서 뇌 세포의 충동 가압을 통해, 외상성 뇌 손상 폭발의 분자 / 세포 메커니즘을 조사 할 새로운 방법을 제공합니다크기와 기간을 essure.

소설 충동 세포 가압 실험은 폭발 - 유도 외상성 뇌 손상의 분자 / 세포 메커니즘을 조사하기 위해 Kolsky 바 장치를 사용하여 개발되었습니다.

외상성 뇌 손상 연구를위한 Neuronal 셀의 충동 가압

폭발로 인한 외상성 뇌손상(TBI)을 조사하기 위해 Kolsky 바 장치를 이용한 새로운 충동적 세포 가압 실험법이 개발되었습니다. ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 외상성 뇌 손상 연구를 위해 배양된 뇌 세포에 충격적 가압을 가하고 이를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 레티노산(retinoic acid)을 사용하여 배양된 세포의 신경 분화를 유도함으로써 수행됩니다. 다음으로, 신경 세포를 ksky bar 기반 세포 가압 장치에 배치하고 폭발로 인한 외상성 뇌 손상과 관련된 크기와 지속 시간의 충격압에 노출시킵니다.마지막으로, 세포 손상 및 외상성 뇌 손상의 가능한 메커니즘을 평가하기 위해 세포에 분자 생물학적 분석을 수행합니다. 현미경 검사 결과, 2 megapascal 강도와 0.7 millisecond 지속 시간의 충격 가압 시 신경세포 사멸과 신경돌기 축삭 구조의 손실이 나타났습니다. 유체 타격법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 음압 구간이 없으며 지속 시간이 정밀하게 제어된다는 점입니다.이 방법은 충격 압력, 크기, 지속 시간 및 하중 형태에 따른 신경 세포 사멸 또는 손상의 임계값과 같이 외상성 뇌손상(TBI) 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 지금까지 저희 연구 그룹에서는 이 방법을 폭발 유도 TBI 연구에 사용해 왔으나, 충격 유도 TBI와 같은 다른 유형의 외상성 뇌손상 연구에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차는 Chen fang 교수 연구실의 대학원생 Matthew와 제 연구실의 기술자 li ha가 시연할 예정입니다.본 실험에서는 Ksky 바를 세포 가압 장치로 설정하여 사용합니다. 이 장치는 정렬된 황동 베어링에 의해 매달린 두 개의 6m 알루미늄 합금 바와 인 비트로(in vitro) 세포 가압 챔버로 구성됩니다. 두 바 사이에 끼워진 세포 가압 챔버는 피스톤 실린더로 이루어져 있습니다.실린더 캐비티 바닥에는 작은 구멍이 뚫려 있어, 세포 시료를 설치하는 동안 공기와 과잉 액체를 배출합니다. 피스톤은 바와 동일한 튜브로 제작되었으며 테플론 테이프를 두세 겹으로 감아 만들어졌습니다. 엔드 캡은 두 개의 작은 스테인리스 스틸 나사로 유리 커버 슬립을 고정합니다.본 시연에서는 SH SY five Y 인간 신경모세포종 세포를 사용합니다. 하지만 이 프로토콜은 많은 세포 모델 배양에 적용 가능합니다. 세포를 직경 18 mm 유리 커버슬립에 3000 cells/cm² 밀도로 분주합니다.보충된 DMEM에서 세포를 배양하는 동안, 10 micromolar 레티노산(retinoic acid)을 배지에 첨가하여 7일 동안 세포의 분화를 유도하며, 배지는 2일마다 교체합니다. 7일째에 세포는 잘 발달된 신경돌기 축삭 구조를 나타내며 가압 준비가 완료됩니다. 모든 가압 챔버 부품을 오토클레이브로 멸균하고, 챔버를 조립하는 동안 UV 램프 아래에 보관하십시오.배양 후드 내에서 챔버의 통기 나사가 공기 배출구에 느슨하게 체결되어 있는지 확인하십시오. 공동의 바닥 부분에 갓 제조한 따뜻한 배양액을 채웁니다. 그다음, 세포가 바깥쪽을 향하도록 세포 배양 유리 슬라이드를 피스톤 캡에 나사로 고정한 후, 피스톤을 챔버 공동 내에 조심스럽게 장착하십시오.벤트 나사를 제거하고 벤트를 위쪽으로 기울인 다음, 피스톤을 챔버 내부의 미리 설정된 기준선까지 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 셀 가압 챔버 내에 약 6 mm의 유체 깊이가 남게 됩니다. 기포가 유입되지 않도록 주의하며, 벤트 나사를 소독한 후 다시 장착하여 챔버를 수밀 상태로 만듭니다.챔버는 정하중 상태에서 누설이 없어야 합니다. Ksky 바 시스템을 재설정하십시오. 무거운 질량을 원래 위치로 되돌리고 잠금 볼트를 다시 장착하십시오.잠금 볼트는 핀이 부러질 때까지 입사봉의 이동을 방지하는 클램핑 힘을 유지합니다. 유압 잭을 사용하여 새 잠금 볼트를 약 200 PSI까지 체결하십시오. 가위형 잭을 사용하여 입사봉의 예하중 구간을 원하는 값보다 약간 높은 압력으로 압축한 다음, 잭 나사의 전체 마찰력이 작용하도록 약간 풉니다. 이제 가압 시간이 약 1밀리초이므로 데이터 수집 장치를 설정하십시오.휘트스톤 브리지 회로에 2000 ohm 스트레인 게이지를 사용하여 샘플링 주파수를 1 MHz로 설정하십시오. 송신봉의 전압은 45 V로 설정해야 합니다. 피스톤이 송신봉을 향하도록 셀 챔버를 장착하십시오.셀 챔버를 소형 실험실 시저스 잭(scissors jack)으로 지지되는 V 블록에 놓고 두 막대와 정렬시킵니다. 각 접촉면에 그리스를 얇게 바르고, 표면을 부드럽게 문질러 접촉면 사이의 공기를 제거합니다. 이제 시스템 준비가 완료되었습니다.데이터 수집 장치를 활성화하고 유압 클램프 드라이버를 빠르게 펌핑하여 테스트를 수행합니다. 이렇게 하면 잠금 볼트가 파손되어 클램프가 분리되고, 그 결과 압력파가 세포로 전달됩니다. 테스트 후, 배양 후드 내에서 챔버로부터 슬라이드를 꺼내 세포 거동 평가를 진행합니다.숙련되었을 때, 이 장치를 사용하여 시간당 약 9개의 세포 배양 슬라이드를 가압할 수 있습니다. 판독값을 분석할 때 투과 바 신호의 시작 부분에서 기포로 인한 오류가 나타날 수 있으나, 본 시연에서는 나타나지 않습니다.투과 막대(transmittance bar)가 충분히 길다면, 가장 중요한 데이터는 첫 번째 교란과 함께 시작되어 측정값이 음압을 나타내는 지점에서 종료되어야 하며, 이 전압 판독값은 스트레인 게이지 분석을 통해 세포가 경험하는 응력에 비례합니다. 투과 펄스의 지속 시간은 입사 펄스보다 짧을 수 있습니다. 세포 가압 챔버 내 유체에 작은 기포가 갇혀 있는 경우, 투과 펄스의 크기가 입사 펄스의 크기를 초과하지 않을 수 있으나, 하중 제거 전까지 충분히 긴 평탄부(plateau)를 가져야 합니다.그렇지 않은 경우, 밀폐된 챔버 내에 커다란 공기 방울이 갇혀 있거나 어셈블리와 바(bar)의 정렬이 맞지 않는 것입니다. 가압 후, 세포를 즉시 검사하거나 이후 검사를 위해 추가로 배양할 수 있습니다. 가압된 세포를 동일하게 처리되었으나 가압되지 않은 챔버 대조군 세포와 비교하여, 배양 후 다양한 시점에서 광학 현미경으로 신경돌기 길이의 변화를 평가합니다.액틴 면역형광 염색은 세포골격의 변화를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 또한, 미세소관 관련 단백질 2(microtubule associated protein two) 항체를 사용하여 주요 신경세포 마커 중 하나의 변화를 시각화할 수 있습니다.충격 가압이 신경 세포 및 세포 사멸 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하려면, 필요한 경우 R-T-P-C-R과 같은 표준 분자 생물학 기법을 사용하십시오. 면역 블로팅에 필요한 충분한 세포 용해물은 동일한 압력을 가한 여러 세포 샘플로부터 수집할 수 있습니다. 본 예시의 가압 프로파일에서 ksky bar 장치는 광학 현미경 이미지에서 확인되는 바와 같이, 배양된 신경 세포에 약 0.7 millisecond 지속 시간의 2 megapascal 수준 단일 펄스형 충격 압력을 성공적으로 가하였습니다. 2 megapascal 충격 압력을 받은 SHSY five Y 인간 신경 세포는 가압하지 않은 대조군 세포와 비교하여 뚜렷한 신경 돌기 축삭 붕괴를 보입니다.이 절차를 수행할 때는 항상 유체 가압 챔버를 이와 같이 잡아야 하며, 그렇게 하지 않을 경우 배양 후 세포가 음압에 노출될 수 있습니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 제어된 가압 조건 하에서 외상성 뇌 손상의 세포 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. Army UNL Center for Trauma Mechanics의 연구비 지원에 감사드립니다.

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 영상은 쥐의 두개골 개방 외상성 뇌 손상을 유도하는 과정을 보여주며, 두개골을 뚫고 구멍을 뚫고 뼈 피판을 제거하여 뇌 피질을 노출시키고 높은 압력을 가하여 외상을 유발하는 절차를 보여줍니다. 그런 다음 상처를 봉합하여 후속 실험을 위해 마우스 모델을 준비합니다.

임팩터 프로브를 사용하여 외상성 뇌 손상 마우스 모델 생성

체외에서 외상성 뇌 손상 모델은 생체 뇌의 변형으로 재현하기 위해 개발되고있다. 스트레치에 의한 손상은 성상 세포, 뉴런, glial 세포, 대동맥, 뇌 혈관 내피 세포에 대한 고용되었습니다. 그러나 우리의 시스템은 체외 TBI 모델을 설정하는 BBB의 합법적 인 모델을 구성하는 속성을 가지고 혈액 뇌 장벽 (BBB) ​​모델을 사용합니다.

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

외상성 뇌 손상(TBI)은 여전히 심각한 건강 문제로 남아 있습니다. 통제된 피질 충격 수술 모델을 사용하여 TBI의 영향과 가능한 치료 방법에 대한 연구를 수행할 수 있습니다.

외상성 뇌 손상에 대한 제어 피질 충격 모델

이 문서는 기본 폭발 외상 성 뇌 손상의 새로운 모델을 설명합니다. 압축 공기 구동된 충격 튜브는 단일 충격파를 마우스 hippocampal 슬라이스 문화 체 외에 노출 하는 데 사용 됩니다. 이것은 높은 처리량을 가진 재현할 수 뇌 조직 손상 생성 하는 간단 하 고 빠른 프로토콜 이다.

모델을 새로운 시험관에 폭발 외상 성 뇌 손상의

여기, 선물이 ex vivo 혈관 반응성 결정 다음 주 폭발 외상 성 뇌 손상 (bTBI) 절연, 가압, 설치류 중간 대뇌 동맥 (MCA) 세그먼트를 사용 하 여 위한 방법을 설명 하는 프로토콜. bTBI 유도 충격 관로 알려진 또한 고급 폭발 시뮬레이터 (ABS) 장치를 사용 하 여 수행 됩니다.

가압된 설치류에 폭발을 이용한 Neurotrauma의 효과 중간 대뇌 동맥

여기서 우리는 성인, 수컷 위스타 래트에서 측면 유체 타악기 손상(FPI) 모델을 사용하여 심한 TBI를 유도하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 연속적인 비디오 EEG 기록을 수집하고 외상 후 간질 발생과 일치하는 간질 방전을 모니터링하기 위해 무선 원격 측정 시스템의 사용을 입증합니다.

무선 비디오-EEG 시스템 사용으로 측면 유체-타악기 유도 외상성 뇌 손상 다음 간질 방전 모니터링

여기에서 우리는 열린 머리 통제된 피질 충격을 통해 뮤린 외상성 뇌 손상의 유도를 위한 프로토콜을 기술합니다.

외상성 뇌 손상의 유도에 대한 제어 피질 영향의 뮤린 모델

우리는 여기에 설치류를위한 폭발파 모델의 프로토콜을 제시하여 경증에서 중등도의 외상성 뇌 손상의 신경 생물학적 및 병리 생리학적 효과를 조사합니다. 우리는 압력 센서가 장착 된 가스 구동식 벤치 탑 설정을 구축하여 폭발로 인한 경증에서 중등도의 외상성 뇌 손상을 안정적이고 재현 가능한 생성이 가능하도록했습니다.

설치류의 폐쇄 머리 경미한 외상성 뇌 손상의 전임상 평가를위한 저강도 폭발파 모델

뇌타박상을 동반한 뇌골 출혈 및 신경 염증은 심각한 2차 뇌 손상을 유발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 제어 피질 영향(CCI) 모델을 자세히 설명하여 연구원들이 출혈, 타박상 및 외상 후 면역 반응을 연구하고 잠재적인 치료법을 탐색할 수 있도록 합니다.

외상성 출혈 타박상 및 신경염증에 대한 전임상 제어 피질 영향 모델

여기에 제시된 것은 마우스를 사용하여 반복적인 저강도 폭발 노출을 생성하는 방법입니다.

마우스에서 매우 반복적인 낮은 수준의 폭발 노출 모델링

이 프로토콜은 안구, 뇌 및 척수 외상을 포함하여 마우스에서 폐쇄 시스템 중추 신경계(CNS) 손상을 유도하도록 설계된 맞춤형 과압 공기 시스템을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 연구자들이 고유한 CNS 외상 연구를 위해 시스템을 쉽게 조정하고 확장할 수 있는 프레임워크를 제공하는 것입니다.

국소, 폐쇄 시스템 중추 신경계 손상 시스템

배우세요 Kolsky bar 장치를 이용한 신경세포 충동 가압법으로 외상성 뇌손상 메커니즘을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 정밀한 압력 제어와 세포 손상 평가를 가능하게 합니다.

외상성 뇌 손상 연구를위한 Neuronal 셀의 충동 가압

더 많은 동영상 탐색