모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

다음 실험의 전체적인 목표는 합성된 절지동물 신경펩타이드와 그에 대응하는 GPCR 간의 구조-활성 관계를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 중국 햄스터 난소(CHO) K1 공백 세포에 원하는 GPCR 발현 벡터를 형질전환하여 단일 세포 유래의 안정적 형질전환 세포주를 확보합니다. 두 번째 단계로, 칼슘 생물발광 플레이트 어세이에서 세포 내 생물발광을 측정하기 위해 리포터 유전자인 GCaMP를 운반하는 플라스미드를 해당 안정적 세포주에 형질전환합니다. 그 후, 이러한 재조합 세포에 펩타이드 리간드를 처리했을 때의 세포질 칼슘 수준을 결정하기 위해 칼슘 생물발광 플레이트 어세이를 수행합니다.

플레이 어세이의 리포터인 corrin을 통해 검출된 세포 내 칼슘 방출 유도 결과에 따라, 구조적으로 서로 다른 펩타이드나 서로 다른 펩타이드 농도를 재조합 세포에 처리했을 때 생물발광 단위에 차이가 있음이 나타났습니다. 트렌드 및 발현 프로토콜보다 재조합 GPCR을 발현하는 안정적 형질전환 클론 세포주를 활용하는 것의 주요 장점은 수용체 발현 수준이 더 균일하여 결과의 일관성을 확보할 수 있다는 점입니다. 또한, aquarium 단백질을 미토콘드리아로 표적화함으로써 생물발광을 통한 민감한 칼슘 측정이 가능함을 입증하였습니다. 오늘의 실험은 저의 연구실 소속 박사후연구원과 대학원생인 lie 및 Simon Kersch가 수행하겠습니다.

안정적인 세포주를 구축하려면 먼저 Chinese hamster ovary, K one empty 세포를 37°C의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 세포가 건강하게 성장하면 1x 항생제-항진균제가 포함된 성장 배지에서 empty 세포를 유지합니다. Chinese hamster ovary K one 세포를 T 25 조직 배양 플라스크에 접종하고, 세포 밀도가 약 30% con fluent가 될 때까지 항생제가 없는 성장 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다.

형질전환 전, 서면 프로토콜에 설명된 대로 관심 GPCR을 포함하는 DNA 발현 벡터를 준비하십시오. 해당 DNA를 100 µL의 Optum reduced serum medium과 혼합하십시오.

리포펙션 시약 6 µL를 무혈청 F 12 K 배지 100 µL에 혼합하고 실온에서 30~45분 동안 배양합니다. 배양 후, DNA 용액과 리포펙션 시약 용액을 방울방울 떨어뜨리듯 천천히 혼합합니다. 혼합물을 15 mL 튜브에 담아 실온에서 10~15분 동안 방치합니다.

트랜스펙션 혼합물을 신선한 F 12 K 배지 1.8 milliliters에 한 방울씩 천천히 섞어줍니다. 그 다음 세포를 PBS로 세척하고, 이 새로운 트랜스펙션 용액을 세포에 첨가합니다. 이후 18시간 동안 배양합니다.

배지를 항생제가 포함되지 않은 10% FBS 함유 F 12 K 배지로 교체하고 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 서면 절차에 기술된 대로 항생제가 포함되지 않은 10% FBS 함유 F 12 K 배지를 사용하여 세포를 두 개의 T 25 플라스크에 분할하여 접종합니다. 이후 18시간 동안 추가로 배양합니다.

배지를 선택 배지로 교체합니다. 그 후, 선택 배지를 사용하여 3~4주 동안 세포를 배양합니다. 이를 통해 플라스미드가 게놈 DNA에 안정적으로 삽입된 세포를 선택할 수 있습니다.

유지 배지를 사용하여 세포를 계속 배양하고, 예기치 않은 오염으로 인한 손실을 방지하기 위해 세포주를 주기적으로 동결 보존하십시오. 클론 세포주를 선별하려면, 먼저 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포를 트립신 처리하고 유지 배지로 원심 분리하십시오. 그 다음, 5 mL의 유지 배지에 세포를 재현탁하십시오.

세포 현탁액 0.5 milliliters를 취하여 신선한 유지 배지 4.5 milliliters를 추가해 10배 희석액을 만들고, 단일 세포를 선택하기 위해 96-well 플레이트의 12개 well에 이 10배 희석액 100 microliters씩 분주합니다. 이론적으로 100 microliters당 세포 한 개가 되도록 이 세포들을 약 19회 동안 10배 연속 희석하며, 각 연속 희석액 100 microliters를 96-well 플레이트의 12개 well에 분주합니다. 18시간 동안 배양한 후, 도립 광학 현미경 또는 형광 현미경으로 96-well 플레이트를 관찰하고, 단 하나의 단일 세포만 있거나 하나의 단일 세포에서 명확하게 분열된 두 개의 세포만 있는 것으로 보이는 well을 표시합니다.

배지를 3일마다 교체하며 매일 플레이트를 관찰하십시오. 세포가 약 80% confluency에 도달할 때까지 일주일 동안 배양하십시오. 그 후, 표시된 웰을 200 µL의 PBS와 트립신으로 헹굽니다.

PBS trypsin EDTA 용액 100 µL를 넣습니다. PBS trypsin EDTA 용액을 제거합니다. 유지 배지 100 µL를 추가하고, 각 표시된 웰의 세포를 유지 배지 1 mL가 들어 있는 6-웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.

6-well 플레이트에서 세포를 3일 동안 배양한 후, 각 세포를 개별 T 25 플라스크로 옮깁니다. 세포의 성능이 일관되지 않을 경우를 대비하여 세포주를 주기적으로 동결 보관하십시오. 가장 높은 반응을 보이는 세포주를 결정하기 위해, 수용체, 펩타이드, 리간드 또는 기타 양성 대조군 작용제와 같은 활성 리간드를 사용하여 칼슘 생물발광 분석법으로 옮겨진 세포들을 테스트합니다.

칼슘 생물발광 분석법은 이 비디오의 후반부에서 자세히 시연될 예정입니다. 실험을 진행하기 전에 단일 세포 선택 과정을 두 번째로 수행하십시오. 분석을 위해 클론 세포주를 선택하여 배양할 때는 계대 횟수를 기록하는 것이 매우 중요한데, 계대 횟수가 높은 세포는 T 25 플라스크에서 제대로 기능하지 않을 수 있기 때문입니다.

원하는 수용체를 발현하는 세포주를 유지 배지에서 약 90% 정도의 밀도로 배양합니다. 세포를 트립신 처리하고 원심 분리하여 다시 현탁한 후, 유지 배지로 세포를 약 10배 희석하고 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 그다음 세포 밀도를 ml당 약 2 x 10⁵ cells로 조정합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 2 ml를 분주하고 24시간 동안 배양하며, 칼슘 생물발광 플레이트 분석을 시작하기 전 세포 밀도가 약 60%가 되어야 합니다.

발현 벡터 구조체에 목적 리포터 유전자를 준비합니다. 여기서는 미토콘드리아 발현 쿼럼 리포터가 사용됩니다. 그런 다음 서면 프로토콜에 설명된 대로 1 µg의 리포터 플라스미드를 세포에 트랜스펙션합니다.

6-웰 플레이트에서 세포를 24시간 동안 배양한 후, 트립신 처리, 원심분리 및 재현탁하여 세포 수를 mL당 400,000 cells로 맞춥니다. 이를 96-웰 화이트 박막 바닥 마이크로 타이터 플레이트의 각 웰에 100 µL씩 옮기고, 약 80%의 밀도(confluence)에 도달할 때까지 다시 24시간 동안 배양합니다. 이는 생물발광 분석(bioluminescence assay)을 위한 최적의 세포 농도입니다. 다음 단계들은 암실에서 수행해야 하지만, 여기서는 편의상 밝은 곳에서 보여줍니다.

시연을 위해, 웰당 90 µL씩 사용할 수 있도록 5 µM CHO terezin이 포함된 칼슘 제거 DME 배지를 충분히 준비합니다. 플레이트에서 기존 배지를 제거하고 각 웰에 90 µL씩 추가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 암실에서 3시간 동안 배양하면 세포 테스트 준비가 완료됩니다.

본 시연은 생물 발광 모드의 Nova star 플레이트 리더를 사용하여 수행됩니다. 퍼지를 시작하려면, 암실 상태에서 기기 펌프 플레이트를 플레이트 홀더에 넣어야 합니다. 1.5 milliliter EOR 튜브에서 펩타이드를 가용화하십시오.

웰당 10 µL의 10x 펩타이드 용액을 처리하기에 충분한 양의 칼슘 무첨가 DME와 배지를 준비합니다. 사용 전 펩타이드 용액의 흡입 깊이와 위치 결정을 설정합니다. 세포에 10 µL의 펩타이드를 처리하고 즉시 빛 방출 기록을 시작합니다.

본 시연에서 장비는 총 50초 동안 2초마다 각 웰의 465 nanometers 광방출을 기록하도록 설정되었습니다. 실행이 완료되면 장비 펌프를 세척하십시오. 각 펩타이드 샘플에 대해 이 과정을 반복하고 데이터를 저장한 후, 분석이 끝나면 장비 펌프를 다시 세척하십시오.

각 웰의 빛 방출 데이터는 소프트웨어 프로그램에 의해 Microsoft Excel 데이터 시트로 자동 전송됩니다. Excel의 데이터를 Prism Software 4.0에 붙여넣으십시오. x축에는 다양한 펩타이드 농도를, y축에는 생물 발광 단위(bioluminescence units)를 표시하여 그래프를 생성하십시오.

Y축에서 비선형 회귀 곡선 적합 분석을 선택하여 각 펩타이드의 농도 반응 곡선과 그에 해당하는 EC50 값을 구합니다. 데이터 분석을 위해 각 실험은 3회 반복해야 합니다. 중국 햄스터 난소(CHO) K1 세포에서 발현시켰을 때, 모기 *Aedes aegypti* 유래의 키닌 수용체는 다중 리간드 수용체로 작용하였으며, 1nM의 낮은 농도에서도 기능적으로 반응하였습니다.

칼슘 생물발광 플레이트 분석법을 사용하여 단독으로 테스트한 세 가지 내인성 eighties 키닌의 결과입니다. 통계적으로 유의미한 차이를 보이는 EC 50 값은 eighties aegypti 키닌 3의 경우 약 16 nanomolar, eighties aegypti 키닌 2의 경우 26 nanomolar, eighties aegypti 키닌 1의 경우 49 nanomolar로 측정되었으며, 이에 따른 효능 순위는 eighties 키닌 3가 가장 강력하고 eighties 키닌 1이 가장 약한 것으로 나타났습니다. 다음은 칼슘 생물발광 플레이트 분석법을 통해 진드기 키닌 수용체를 발현하는 Chinese hamster ovary K 1 세포주에서 확인한 6가지 alpha amino ISO butyric acid 키닌 유사체의 활성 비교 결과입니다.

Y축은 각 아날로그에 대해 관찰된 농도에서의 생체 발광량을 모든 테스트 농도에서 관찰된 최대 반응에 대한 백분율로 나타낸 최대 생체 발광 단위 백분율을 의미하며, KININE HEXA 펩타이드 F-F-F-S-W-G amide는 수용체 활성의 양성 대조군입니다. 단일 치환 키닌 아날로그인 double F 아미노 ISO butyric acid WG amide는 양성 대조군인 HEXA 펩타이드 KININE 아날로그보다 더 활성적이었으며, 두 개의 아미노낙산으로 치환된 KININE 아날로그인 aminobutyric acid FF aminobutyric acid WG amide는 테스트된 이중 치환 아날로그 중 가장 강력했습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 AGPCR을 발현시키고 칼슘 생체 발광 분석법을 통해 수용체에 대한 리간드의 구조-활성 관계를 분석하기 위한 클론 세포주를 확보하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.