Name: 모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 배우세요 칼슘 생물발광 분석법을 이용하여 Aedes aegypti와 Rhipicephalus microplus의 GPCR에서 펩타이드 구조-활성 관계를 분석하는 방법을. 안정적인 단일세포주를 확립하여 신경펩타이드 수용체 활성을 정량적으로 측정할 수 있습니다.

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DRS. 코펜하겐 대학 (덴마크)에서 CJP Grimmelikhuijzen와 마이클 윌리엄슨은 aequorin이 플라스미드 제공을위한 감사합니다. 우리의 공동 작업자, ARS - USDA (TX, 미국)에서 박사 로널드 J. Nachman는 펩타이드 합성 및 NOVOstar 플레이트 리더를 제공 인정받고 있습니다.

1. 안정적인 세포 라인의 구축 <ol><li> 관심의 GPCR을 복제하고 포유류의 시스템에 최적의 ribosomal 바인딩 (코작, 1986)의 시작 코돈 주변 5 '코작의 합의 순서 (GCCA / GCCATGG)을 통합 발현 벡터에 삽입. 여기서 우리는 모기 kinin 수용체 (.; Pietrantonio 외, 2005. 홈즈 외, 2003)에 대한 체크 kinin 수용체에 대한 플라스미드 pcDNA3.1/Bm-KR 및 플라스미드 pcDNA3.1/Aedae-KR을 사용합니다. 벡터는 포유 동물 세포에 선택에 대한 박테리아와 네오 마이신 (G418) 저항의 선택에 대한 암피실린 저항을 인코딩 - pcDNA3.1 (). </li><li> CHO - K1 빈 셀 (plasmids 제외) (ATCC, 머내서스, VA, 미국) 또는 37 T - 25 플라스크의 다른 원하는 세포주 (BD 팔콘) · 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 C (홈즈 외 그로 ., 2003). 별도로 명시하지 않는 한 모든 추가 incubations 이러한 조건 하에서 수행되어야합니다. 함께 성장 매체에서 빈 셀을 (F12K 매체 10% 태아 소 혈청)를 유지 1X 항생제 - Antimycotic (Invitrogen, CA). </li><li> 세포를 분리하기 위해 37 ° C.에 대한 모든 솔루션을 따뜻하게 T - 25 플라스크에 오래된 매체를 제거하고 PBS로 5 ML 씻어 후 PBS를 제거합니다. 세포를 trypsinize하려면 2 분 2 ML PBS - 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 (34 ML PBS, 2 ML 7.5 % 나트륨 중탄산염, 4 ML 10X 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))을 추가합니다. 3 ML 미디어를 추가하고 세포를 섞어 매체를 대기음 아래. 원뿔 튜브와 ~ 2백~3백g (1,000 RPM) 2 분 원심 분리기로 세포와 매체를 전송합니다. 뜨는 취소 5 ML 매체에서 다시 중지 세포. 신선한 매체 1시 5분 또는 1시 10분의 농도에 resuspended 세포를 희석하고 새로운 T - 25 플라스크에 5 ML을 전송. </li><li> 세포가 항생제없이 (2-3 일 정도) 건강하게 성장하는 씨앗 CHO - K1 세포를 T - 25 조직 문화 flasks로 성장 매체들이 야간 성장 후 그들은 약 30 %의 합류 (약 18 시간)까지. confluency의 정도는 거꾸로 형광 현미경 하에서 관찰 세포에 의해 결정하실 수 있습니다. </li><li> 각 샘플에 대해 다음과 섞어 준비 : <ol><li> 100 μl Opti - 멤 전 세럼 중간 (Invitrogen)을 감소와 함께 : 1-2 μg의 DNA (265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR의 사용 4μl 예)를 결합합니다. </li><li> DNA에 Lipofectin의 1:1 비율을 만들고, 100 μl F12K 혈청 무료로 중간에 6 μl Lipofectin 시약 (InvitrogenTM)를 섞는다. 30-45 분 실온에서 알을 품다. </li></ol> 부드럽게 (총 부피 = 200 μL)를 드롭 현명한 방식으로 1.5.2과 1.5.1에​​서 솔루션을 섞는다. 10-15 분 실온에서있게 해줘요. </li><li> 세포에서 오래된 성장 매체를 제거하고 5 ML F12K 혈청 무료 매체로 세포를 세척 후 F12K 혈청 무료 매체를 제거합니다. 15 ML 관에서 부드럽게 드롭 현명한 방식으로 신선한 F12K 매체의 1.8 ML로 transfection 혼합물을 섞는다. 그런 다음, PBS와 단계 1.5에서 세포를 씻어하고 세포에 transfection이 새로운 솔루션을 추가합니다. 18 시간 동안 부화. </li><li> 항생제없이 중간 플러스 10% 태아 소 혈청을 F12K와 하룻밤 부화 매체를 변경합니다. 또 18 시간 동안 항생제없이 F12K 매체 플러스 10% 태아 소 혈청 (분리 세포에 대한 단계 1.3 참조) 두 개의 T - 25 flasks로 세포를 분리. </li><li> 선택적 매체 (F12K 매체 플러스 800μg/ml GENETICIN와 10% 태아 소 혈청, Invitrogen)로 매체를 교체합니다. 3-4주에 대한 선택적 매체를 사용하여 세포 문화. 시간이지나면서이 안정적으로 자신의 게놈 DNA에 플라스미드를 통합해야 전지 선택합니다. 유지 보수 매체 (F12K 매체 플러스 400μg/ml GENETICIN와 10% 태아 소 혈청)를 사용하여 세포를 유지 계속합니다. 주기적으로 예기치 않은 오염의 경우에는 손실을 방지하기 위해 동결 미디어의 1시 1분 비율 (20 % DMSO와 선택적 중간)와 세포 라인을 정지. </li><li> clonal 세포 라인을 선택 : 첫 번째 단계로, trypsinize 및 단계 1.3 유지 보수 매체와 1.8 단계에서 세포를 원심 분리기. 다시 중지 전지 5 ML 유지 보수 매체에 세포의 0.5 ML은 일시 중단하고 10X 희석를 만들기 위해 신선한 유지 보수 매체 4.5 ML를 추가 가져가라. 단일 세포에 대한 선택 각 잘 ~ 100 μl를 추가, 96 잘 접시 12 우물에 10 배 희석을 전송합니다. </li><li> 100 μl 당 하나의 셀 (; 10X 직렬 dilutions의 총계 ~ 19 일반적으로 최종 희석은 10 -19 10 -11의 범위에서 될)의 이론적 최종 정지에 대해 이러한 세포의 10X 시리얼 dilutions을 계속 . 즉시 각 희석 다음, 96 잘 접시 12 우물에 희석 100 μl를 전송합니다. 18시간 보육 후, 거꾸로 빛 또는 유일한 하나의 세포를 포함하거나 분명 하나의 세포에서 나눈 두 세포를 포함하는 것처럼 형광 현미경 마크 웰스 이하 96 자 번호판을 관​​찰합니다. 모든 삼일 매일 및 변경 매체를 관찰 유지. </li><li> 우물은 80 % conflu 경우천만에 (주일), 200 μl PBS로 표시된 우물을 씻어 PBS - 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 100 μl으로 그들을 trypsinize. 잘 1 ML 유지 보수 매체와 6 자 판 잘 하나에 표시된 각 전송 세포. 3 일간 그 세포를 성장 다음 각 T25 플라스크에 세포를 전송합니다. 작용제의 펩티드 (2 절 참조)과 칼슘 bioluminescence 분석을 사용하여 이러한 세포를 테스트합니다. </li><li> 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석에서 가장 높은 응답 단계 1.11에서 1 셀 라인을 선택하고 두 번째로 단일 셀 선택 다음 단계 1.9-1.11에 대한 수행합니다. 주기적으로 세포 라인을 정지. </li><li> 단계 1.12에 설명되어있는 보조 선택에서 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석에서 가장 높은 응답 2-3 셀 라인을 선택하고 추가로 칼슘 bioluminescence 플레이트 assays를위한 문화에서 그들을 유지합니다. 통과 번호를 추적할 수 있습니다. 더 많은 구절과 셀 라인이 지속적으로 실적을 중지하면 당신은 항상 그들에게 돌아갈 수 있도록 때때로 초기 구절에서 세포 라인을 정지. </li></ol> 2. 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석 <ol><li> 발현 벡터에 관심있는 리포터 유전자를 Ligate. 여기 aequorin 플라스미드 mtAEQ/pcDNA1을 (DRS. CJP Grimmelikhuijzen과 마이클 윌리엄슨, 코펜하겐 대학, 덴마크의 선물) 사용됩니다. E.에있는 플라스미드를 변환 대장균 세포의 MC1061/PS (Invitrogen)과 QIAprep 스핀 miniprep 키트 (Qiagen 주식 회사)를 사용하여 정화. 최종 단계에서 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 아니라 물없이 트리스 버퍼와 플라스미드를 elute. </li><li> 보수 매체에서 원하는 수용체를 표현하는 단계를 1.13에서 세포 라인을 성장. 세포이 90 % 합류하는 경우, trypsinize 원심 분리기 다음 단계 1.3는 5 ML 유지 보수 매체에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 세포를 (유지 보수 매체에 대한 10 배) 희석하여 현미경 하에서 세포 카운터 (브라이트 - 라인 Hemacytometer)와 휴대폰 번호를 계산합니다. 약 2 × 10 5 세포 / ML에 휴대폰 번호를 조정 (9 사각형 중 하나에 평균 20 세포는 Hemacytometer에 보여주었다). 여섯 잘 접시의 각 우물에 미디어에 씨앗이 ML 희석 세포. 24 시간 (세포 배양 후 약 60 %에 도달해야 confluency)에 품어. </li><li> OPTI - 멤 매체에 6 우물 판에서 미디어를 변경합니다. 각 잘 들어, microfuge 튜브 4 μl FuGENE 6 Transfection 시약 (로체 Biochemicals)에 96 μl OPTI - 멤를 섞어 5 분 실온에서 앉아 보자. 각각의 튜브에 aequorin / pcDNA 1 플라스미드 DNA 1 μg를 추가하고 나서 부드럽게 15-20 분 상온에서 품어, 1 분 샘플을 흔들. 부드럽게 잘 번호판을 흔들어 동안 dropwise 방식으로 각 우물에 각 혼합물을 추가합니다. 6 시간 동안 접시를 부화하고 항생제없이 10% 태아 소 혈청을 포함하는 미디어를 F12K 수있는 매체를 변경합니다. </li><li> 24 시간 동안 식스 웰 플레이트에있는 세포를 잠복기 후, trypsinize 원심 분리기 및 단계 1.3로 세포를 다시 일시 중지합니다. 단계 2.1로 400,000 셀 / ML에 휴대폰 번호를 카운트하고 96 잘 흰색 얇은 바닥 microtitre 플레이트 (코스타 3610)의 각 우물에 100 μl (총 40,000 cells/100 μl)를 전송합니다. 80 %의 세포 confluency까지 24 시간 동안 부화. 이것은 bioluminescence 분석을위한 세포의 최적 농도이다. </li><li> 어둠 5 μm의의 coelenterazine (Invitrogen)에 포함된 칼슘이없는 DMEM 매체 (Invitrogen)의 90μl/well 준비 (coelenterazine 것은 민감한 빛입니다.) 2.4에서 접시를 타고 이전 미디어를 제거하고 각 우물에이 90μl를 추가합니다. 37 어둠 속에서 3 시간 동안 접시를 품어 ° C와 접시에있는 세포가 시험을 준비하는 이후 5% CO 2. </li></ol> 3. 악기 운영 및 데이터 분석 <ol><li> 각 bioluminescence 플레이트 판독기가 다릅니다. 우리는 bioluminensence 모드에서 NOVOstar (BMG의 Labtechnologies) 플레이트 판독기를 사용하여 우리의 분석을 수행합니다. 다른 악기를 사용하는 경우 프로토콜을 적응해야합니다. </li><li> 사용하기 전에 플레이트 판독기 펌프 (또는 PRIME 펌프) 정리. 접시 홀더에 접시를 올려 놓기 전에 방에 불을 끕니다. 플레이트 소유자가 폐쇄되면에 불을 켭니다. </li><li> 칼슘없는 DMEM 매체에서 펩티드를 (1.5 ML Eppendorf 튜브) Solubilize. "기음 깊이"를 사용하기 전에 펩타이드 솔루션의 "위치 결정"을 설정합니다. 펩티드의 농도 (FFFSWG - NH2, Aedes - K1 - 3, 또는 기타 원하는 펩타이드)를 다양한 10 μl (10X)로 세포를 도전 즉시 발광 녹음을 시작합니다. 우리는 50 초 총 시간에 대한 각 잘 매 2 초 동안 발광 (465 nm의)를 기록하는 악기를 설정했습니다. </li><li> 이러한 적극적인 아날로그 (아날로그 FFFSWGa이 타네 - Bageshwar 외. 2009 년, 사용되고있다)와 같은 벡터에만 transfected 세포로 대조군과 같은 긍정적인 컨트롤을 포함시키십시오. 부정적인 제어 (대표 결과를 참조) 기준 임계값을 설정하는 데이터 분석 중에 필요합니다.관련없는 비활성 펩타이드 또한 대조군으로 추가할 수 있습니다. </li><li> 실행이 완료되면, 악기 펌프 (또는 PRIME 펌프) 다음 다음 펩타이드 샘플 장소를 씻으십시오. 데이터를 저장하고 다시 펌프를 세척. </li><li> 데이터 처리 : Microsoft Excel의 데이터 시트에 각 우물에서 발광의 데이터를 전송합니다. </li><li> Excel에서 GraphPad 소프트웨어 주식 회사 (샌디에고, CA, 미국)에서 프리즘 소프트웨어 4.0 데이터를 붙여 넣습니다. 다양한 펩타이드의 농도는 X - 축이며 bioluminescence 단위는 Y 축입니다. 데이터를 정상화하려면 로그 - 반응 곡선을 플롯. 각 펩타이드에 대한 농도 - 반응 곡선을 얻기 위해 비선형 회귀 곡선에 맞게 분석 (변수 경사와 sigmoidal 선량 - 반응 방정식)을 선택합니다. 프로그램 플롯 결국 가치 및 EC 50 제공합니다. </li><li> 각 실험 데이터 분석을 위해 세 번 반복해야합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : CHO - K1 세포로 표현하면, 모기 Aedes aegypti kinin 수용체는 multiligand 수용체와 같은 행동과 기능의 세 endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3 1 NM으로 낮은 농도에 응답, 단독 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석을 사용하여 테스트 . Aedae - K -, 얻은 힘의 순위의 순서가 Aedae - K - 3, 16.04 NM의 각 EC 50 값에 따라 Aedae - K - 3&gt; Aedae - K - 2&gt; Aedae - K - 1,라고 그림 1 보여줍니다 통계 (Pietrantonio 외., 2005) (P &lt;0.05) 크게 달랐다 2, 26.6 NM 및 Aedae - K - 1, 48.85 NM. 우리는 또한 kinin 잔류물은 kinin 펩타이드 - 수용체 상호 작용에 대한 중요한 결정이 분석를 사용합니다. 곤충 kinin의 펩티드는 또한 핵심으로 알려진 생물 학적 활동에 필요한 최소한의 순서를 나타내는 C - 터미널 pentapeptide을 서로 나누세요. 표 1에서 kinin 펩타이드 코어 analogs는 핵심 kinin pentapeptide FFSWGa의 알라닌 대체 시리즈로 합성되었으며 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석 (타네 - Bageshwar 외., 2006)에 의해 테스트. 우리는 아미노산 PHE 1 TRP 4 두 수용체에 대한 곤충 kinins의 활동에 필수적인 것으로 나타났다. 분석은 또한 향상된 biostability위한 펩티드를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 표 2는 체크 재조합 kinin 수용체와 그림 2에서 테스트 아미노산 isobutyric 산성 (Aib)이있는 설계 kinin analogs은 칼슘에 의해 CHO - K1 세포 라인을 표현 틱 kinin 수용체 6 알파 - 아미노 isobutyric 산성 analogs의 활동 비교를 보여줍니다 보여줍니다 bioluminescence 플레이트 분석 (타네 - Bageshwar 외., 2009). hexapeptide 아날로그 FFFSWGa는 수용체 활동에 대한 긍정적인 제어에 추가됩니다. 아날로그 FF [Aib] WGA이 hexapeptide 제어 아날로그보다 적극적인 결과. 이 aminoisobutyric 산성 교체, [Aib] FF [Aib] WGA와 아날로그 (표 2 및 그림 2) 테스트를 두 번 교체 analogs 중 가장 강력했다. 이 분석이되었으며, Nachman 및 Pietantonio (2010), Nachman 외 볼 적용할 수있는 방법에 대한 더 많은 예제. (2009), 타네 - Bageshwar 외. (2008a), 그리고 타네 - Bageshwar 외. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Aedes의 견적은 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석하여 CHO - K1 E10 세포에 대한 효과적인 농도 (EC 50) kinins. 농도 - 반응 곡선의 y 축은 각에 대한 관찰 최대한 응답의 백분율로 표시 bioluminescence 단위로부터 얻은 것입니다 펩타이드. 데이터 포인트는 세 독립적인 실험을하는 동안 얻은 여섯 복제의 평균을 나타냅니다. 바 표준 오류를 나타냅니다. (A) Aedae - K1 EC 50 추정은 = 48 NM. (B) Aedae - K2 EC 50 추정은 = 26 NM. (C) Aedae - K3 EC 50 추정은 = 16 NM. EC 50 Aedae - K3 &lt;EC 50 Aedae - K2 &lt;EC 50 Aedae - K1, P는 &lt;0.05. 통계 분석 및 그래프는 GraphPad의 프리즘 4.0 소프트웨어와 함께했다. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석하여 CHO - K1 세포 라인을 표현 체크 kinin 수용체 6 알파 - 아미노 isobutyric 산성 analogs의 활동 비교. y 축은 농도에서 관찰 bioluminescence의 백분율로 각 아날로그에 대한 퍼센트 최대한 bioluminescence 단위를 나타냅니다 각 아날로그에 대한 검사를 모든 농도 사이에 관찰 최대한의 반응 비교. 통계 분석 및 그래프는 GraphPad의 프리즘 4.0 소프트웨어와 함께 수행했다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> 수용체 세포주 틱 </td><td colspan="2"> 모기 수용체 세포주 </td></tr><td> 펩티드 </td><td> EC 50 (NM) </td><td> 1 ㎜에서 최대한 bioluminescence 응답 </td><td> EC 50 (NM) </td><td> 1 ㎜에서 최대한 bioluminescence 응답 </td><tr><td> AFSWGa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12,800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10,600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10,800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFSWG - OH </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13,000 </td><td> 562 </td><td> 10,000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12,700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> 표 1. 추정 potencies (EC 50)와 진드기와 모기 수용체 transfected 세포 라인에 대한 테스트의 모든 펩티드의 최대한의 bioluminescence 응답 *. * EC 50 반 최대한의 반응을 유도하는 데 필요한 농도를 추정하고있다. I : bioluminescence 응답 미만 300 단위 (벡터 전용 transfected 세포 수준) 인 경우 비활성. A : 펩타이드 FFSWGa에있는 각각의 물질 알라닌로 대체되었습니다 위치. ND : 아날로그가 테스트했지만 역시 매우 활성화되지 이하 molarities에 적극 아니었 따라서 EC50 결정 수 없습니다되었습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> K - Aib - 1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 2 </td><td> [α MeF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 3 </td><td> AC - R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 4 </td><td> AC - R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 6 </td><td> [Aib - Aib - Aib - Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> 표 2. 아미노산 isobutyric 산성 (Aib)이있는 Kinin analogs (K)는 체크 재조합 kinin 수용체에 대한 테스트. AC : 아세틸, α 나 : α - 메틸 페닐알라닌, β3F : β3 - 페닐알라닌, : 아미드.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는이 프로토콜을 사용하여 Arachnida (진드기, 진드기 및 스파이더), 틱 k​​inin 수용체에서 발견된 최초의 neuropeptide 수용체의 기능 특성을 수행할 수있었습니다. 이 방법은 세 가지 기본 애플 리케이션을했다. 첫째, 기술은 리간드 활동 측정을 통해 수용체 deorphanization에 대해 적용할 수 있습니다. 둘째, 분석은 리간드 - 수용체 구조 - 활동 관계 (SAR)을 해결할 수 있습니다. 셋째, 방법은 약물 발견에 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 거의 모든 GPCR에 agonists 또는 antagonists의 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 작은 도서관의 심사를 위해이 프로토콜을 적응하기 시작하고 있습니다. 우리가 활용 세포 라인은 유비 쿼터스 G 단백질 G 16 표현하지 않습니다. 우리는 그것이 필요하지 않았기 때문에 GQ 단백질과 세포내 칼슘 캐스케이드를 통해 arthropod kinin 수용체가 신호를 여기에 같이 그들은 포유 동물 세포에 신호 특성을 보존.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO - K1 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL - 61 </td><td> 머내서스, VA, 미국 </td></tr><tr><td> F12K 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21,127 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15,400 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic </td><td> Invitrogen </td><td> 15,240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti - 멤 널 혈청 매체를 감소 </td><td> Invitrogen </td><td> 31,985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663 - 03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep 스핀 miniprep 키트 </td><td> Qiagen 주식 회사 </td><td> 19,064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfection 시약 </td><td> 로체 </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 흰색 얇은 바닥 microtitere 플레이트 </td><td> 코스타 </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘없는 DMEM 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21,068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C - 2944 </td><td></td></tr><tr><td> 브라이트 - 라인 Hemacytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td></td><td> 호셤, PA </td></tr><tr><td> NOVOstar </td><td> BMG의 Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 프리즘 소프트웨어 4.0 </td><td> GraphPad 소프트웨어 주식 회사 </td><td></td><td> 샌디에고, CA, 미국 </td></tr><tr><td> T - 25 T - 75 Flasks </td><td> BD 팰컨 </td><td> 353014 및 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 bioluminescence 분석 ( aedes aegypti)와 틱 ( rhipicephalus microplus) g 단백질 결합 수용체

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod 호르몬 수용체들은 많은 중요한 생리 및 행동 과정을 조절 같은 소설 살충제에 대한 잠재적인 공격 대상입니다. 그들의 대다수는 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)의 superfamily에 속합니다. 우리는 진드기와 모기의 arthropod kinin 수용체를 특성화에 초점을했습니다. Arthropod의 kinins는 myotropic, 이뇨제, 그리고 신경 전달 물질의 기능으로 다기능 neuropeptides 있습니다. 여기, 두 heterologous kinin에 곤충 kinins 구조 - 활동 관계를 체계적으로 분석하는 방법은 수용체 - 표현하는 것은 시스템에 설명되어 있습니다. 우리는 이뇨제, myotropic 및 / 또는 진드기와 모기의 소화 과정을 방해하는 잠재력을 지닌 biostable kinin analogs의 발전과 관련된 중요한 정보를 제공합니다. 남부 소 틱, Boophilus microplus (Canestrini), 그리고 모기 Aedes aegypti (리네 우스)에서 kinin 수용체는 안정 포유 동물 세포주 CHO - K1으로 표현했다. 이러한 수용체의 기능 분석은 이러한 재조합 세포 펩티드 신청시 세포질 칼슘 수준을 결정하는 세포 bioluminescence를 측정하는 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석을 사용하여 완료되었습니다. 이 방법은 aequorin 단백질, 발광 해파리로부터 격리 photoprotein을 활용합니다. 우리는 transiently 안정 kinin 수용체를 표현 세포 라인에 플라스미드 aequorin (mtAEQ/pcDNA1)을 transfected. 이러한 전지는 다음 어느 세포 aequorin와 단지 cofactor의 coelenterazine와 치료를했다. 이 증서에는 칼슘 농도 나타내는 발광 레벨을 방출, 칼슘의 존재에 나옵니다. kinin 수용체는 세포 내 칼슘의 출시를 통해 신호로, 신호의 강도는 펩타이드의 힘 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 수정 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜의 합성이며.. 그것은 기능 플레이트 assays (Staubly 외, 2002 스테이블스 외, 1997을 통해 포유류의 세포 라인에 GPCRs의 안정 표현에 대한 단계별 지침을 제시 ). 이 방법론을 사용하여, 우리는 모기와 틱 kinin 수용체를 표현하는 안정적인 세포 라인을 설정할 수 있었다 세 모기 kinins의 힘을 비교, 리간드 - 수용체 상호 작용에 대한 중요한 아미노산 위치를 식별하고, 펩타이드의 세미 처리량 검사를 수행 도서관. 곤충 kinins는 내생 peptidases로 빠르게 효소 저하의 영향 때문에, 그들은 심각 해충 제어하거나 endocrinological 연구 도구로 사용에 제한됩니다. 따라서, 우리는 그들의 힘 및 biostability을 향상 아미노산 isobutyric의 산성 (Aib)이있는 kinin analogs을 테스트했습니다. 이 펩티다제 방지 아날로그 biostable 곤충 kinin의 analogs의 개발에 중요한 단서를 나타내고 neuropeptide 기반 arthropod 제어 전략의 개발에 도움이됩니다.

이 프로토콜은 clonal 세포 라인 선택과 자신의 동족 GPCRs에 합성 arthropod neuropeptides의 구조 - 활동 관계를 분석하기 위해 칼슘 bioluminescence 분석에 대한 지침을 제공합니다. 이 분석은 합성 아날로그 설계 및 펩타이드 / 약물 리드 발견 수용체 deorphanization 및 구조 - 활동 관계 연구에 사용될 수 있습니다.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

절지동물 호르몬 수용체는 많은 필수적인 생리적 및 행동적 과정을 조절하므로 새로운 살충제의 잠재적 표적이 될 수 있습니다. ...

다음 실험의 전체적인 목표는 합성된 절지동물 신경펩타이드와 그에 대응하는 GPCR 간의 구조-활성 관계를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 중국 햄스터 난소(CHO) K1 공백 세포에 원하는 GPCR 발현 벡터를 형질전환하여 단일 세포 유래의 안정적 형질전환 세포주를 확보합니다. 두 번째 단계로, 칼슘 생물발광 플레이트 어세이에서 세포 내 생물발광을 측정하기 위해 리포터 유전자인 GCaMP를 운반하는 플라스미드를 해당 안정적 세포주에 형질전환합니다. 그 후, 이러한 재조합 세포에 펩타이드 리간드를 처리했을 때의 세포질 칼슘 수준을 결정하기 위해 칼슘 생물발광 플레이트 어세이를 수행합니다.플레이 어세이의 리포터인 corrin을 통해 검출된 세포 내 칼슘 방출 유도 결과에 따라, 구조적으로 서로 다른 펩타이드나 서로 다른 펩타이드 농도를 재조합 세포에 처리했을 때 생물발광 단위에 차이가 있음이 나타났습니다. 트렌드 및 발현 프로토콜보다 재조합 GPCR을 발현하는 안정적 형질전환 클론 세포주를 활용하는 것의 주요 장점은 수용체 발현 수준이 더 균일하여 결과의 일관성을 확보할 수 있다는 점입니다. 또한, aquarium 단백질을 미토콘드리아로 표적화함으로써 생물발광을 통한 민감한 칼슘 측정이 가능함을 입증하였습니다. 오늘의 실험은 저의 연구실 소속 박사후연구원과 대학원생인 lie 및 Simon Kersch가 수행하겠습니다.안정적인 세포주를 구축하려면 먼저 Chinese hamster ovary, K one empty 세포를 37°C의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 세포가 건강하게 성장하면 1x 항생제-항진균제가 포함된 성장 배지에서 empty 세포를 유지합니다. Chinese hamster ovary K one 세포를 T 25 조직 배양 플라스크에 접종하고, 세포 밀도가 약 30% con fluent가 될 때까지 항생제가 없는 성장 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다.형질전환 전, 서면 프로토콜에 설명된 대로 관심 GPCR을 포함하는 DNA 발현 벡터를 준비하십시오. 해당 DNA를 100 µL의 Optum reduced serum medium과 혼합하십시오.리포펙션 시약 6 µL를 무혈청 F 12 K 배지 100 µL에 혼합하고 실온에서 30~45분 동안 배양합니다. 배양 후, DNA 용액과 리포펙션 시약 용액을 방울방울 떨어뜨리듯 천천히 혼합합니다. 혼합물을 15 mL 튜브에 담아 실온에서 10~15분 동안 방치합니다.트랜스펙션 혼합물을 신선한 F 12 K 배지 1.8 milliliters에 한 방울씩 천천히 섞어줍니다. 그 다음 세포를 PBS로 세척하고, 이 새로운 트랜스펙션 용액을 세포에 첨가합니다. 이후 18시간 동안 배양합니다.배지를 항생제가 포함되지 않은 10% FBS 함유 F 12 K 배지로 교체하고 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 서면 절차에 기술된 대로 항생제가 포함되지 않은 10% FBS 함유 F 12 K 배지를 사용하여 세포를 두 개의 T 25 플라스크에 분할하여 접종합니다. 이후 18시간 동안 추가로 배양합니다.배지를 선택 배지로 교체합니다. 그 후, 선택 배지를 사용하여 3~4주 동안 세포를 배양합니다. 이를 통해 플라스미드가 게놈 DNA에 안정적으로 삽입된 세포를 선택할 수 있습니다.유지 배지를 사용하여 세포를 계속 배양하고, 예기치 않은 오염으로 인한 손실을 방지하기 위해 세포주를 주기적으로 동결 보존하십시오. 클론 세포주를 선별하려면, 먼저 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포를 트립신 처리하고 유지 배지로 원심 분리하십시오. 그 다음, 5 mL의 유지 배지에 세포를 재현탁하십시오.세포 현탁액 0.5 milliliters를 취하여 신선한 유지 배지 4.5 milliliters를 추가해 10배 희석액을 만들고, 단일 세포를 선택하기 위해 96-well 플레이트의 12개 well에 이 10배 희석액 100 microliters씩 분주합니다. 이론적으로 100 microliters당 세포 한 개가 되도록 이 세포들을 약 19회 동안 10배 연속 희석하며, 각 연속 희석액 100 microliters를 96-well 플레이트의 12개 well에 분주합니다. 18시간 동안 배양한 후, 도립 광학 현미경 또는 형광 현미경으로 96-well 플레이트를 관찰하고, 단 하나의 단일 세포만 있거나 하나의 단일 세포에서 명확하게 분열된 두 개의 세포만 있는 것으로 보이는 well을 표시합니다.배지를 3일마다 교체하며 매일 플레이트를 관찰하십시오. 세포가 약 80% confluency에 도달할 때까지 일주일 동안 배양하십시오. 그 후, 표시된 웰을 200 µL의 PBS와 트립신으로 헹굽니다.PBS trypsin EDTA 용액 100 µL를 넣습니다. PBS trypsin EDTA 용액을 제거합니다. 유지 배지 100 µL를 추가하고, 각 표시된 웰의 세포를 유지 배지 1 mL가 들어 있는 6-웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.6-well 플레이트에서 세포를 3일 동안 배양한 후, 각 세포를 개별 T 25 플라스크로 옮깁니다. 세포의 성능이 일관되지 않을 경우를 대비하여 세포주를 주기적으로 동결 보관하십시오. 가장 높은 반응을 보이는 세포주를 결정하기 위해, 수용체, 펩타이드, 리간드 또는 기타 양성 대조군 작용제와 같은 활성 리간드를 사용하여 칼슘 생물발광 분석법으로 옮겨진 세포들을 테스트합니다.칼슘 생물발광 분석법은 이 비디오의 후반부에서 자세히 시연될 예정입니다. 실험을 진행하기 전에 단일 세포 선택 과정을 두 번째로 수행하십시오. 분석을 위해 클론 세포주를 선택하여 배양할 때는 계대 횟수를 기록하는 것이 매우 중요한데, 계대 횟수가 높은 세포는 T 25 플라스크에서 제대로 기능하지 않을 수 있기 때문입니다.원하는 수용체를 발현하는 세포주를 유지 배지에서 약 90% 정도의 밀도로 배양합니다. 세포를 트립신 처리하고 원심 분리하여 다시 현탁한 후, 유지 배지로 세포를 약 10배 희석하고 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 그다음 세포 밀도를 ml당 약 2 x 10⁵ cells로 조정합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 2 ml를 분주하고 24시간 동안 배양하며, 칼슘 생물발광 플레이트 분석을 시작하기 전 세포 밀도가 약 60%가 되어야 합니다.발현 벡터 구조체에 목적 리포터 유전자를 준비합니다. 여기서는 미토콘드리아 발현 쿼럼 리포터가 사용됩니다. 그런 다음 서면 프로토콜에 설명된 대로 1 µg의 리포터 플라스미드를 세포에 트랜스펙션합니다.6-웰 플레이트에서 세포를 24시간 동안 배양한 후, 트립신 처리, 원심분리 및 재현탁하여 세포 수를 mL당 400,000 cells로 맞춥니다. 이를 96-웰 화이트 박막 바닥 마이크로 타이터 플레이트의 각 웰에 100 µL씩 옮기고, 약 80%의 밀도(confluence)에 도달할 때까지 다시 24시간 동안 배양합니다. 이는 생물발광 분석(bioluminescence assay)을 위한 최적의 세포 농도입니다. 다음 단계들은 암실에서 수행해야 하지만, 여기서는 편의상 밝은 곳에서 보여줍니다.시연을 위해, 웰당 90 µL씩 사용할 수 있도록 5 µM CHO terezin이 포함된 칼슘 제거 DME 배지를 충분히 준비합니다. 플레이트에서 기존 배지를 제거하고 각 웰에 90 µL씩 추가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 암실에서 3시간 동안 배양하면 세포 테스트 준비가 완료됩니다.본 시연은 생물 발광 모드의 Nova star 플레이트 리더를 사용하여 수행됩니다. 퍼지를 시작하려면, 암실 상태에서 기기 펌프 플레이트를 플레이트 홀더에 넣어야 합니다. 1.5 milliliter EOR 튜브에서 펩타이드를 가용화하십시오.웰당 10 µL의 10x 펩타이드 용액을 처리하기에 충분한 양의 칼슘 무첨가 DME와 배지를 준비합니다. 사용 전 펩타이드 용액의 흡입 깊이와 위치 결정을 설정합니다. 세포에 10 µL의 펩타이드를 처리하고 즉시 빛 방출 기록을 시작합니다.본 시연에서 장비는 총 50초 동안 2초마다 각 웰의 465 nanometers 광방출을 기록하도록 설정되었습니다. 실행이 완료되면 장비 펌프를 세척하십시오. 각 펩타이드 샘플에 대해 이 과정을 반복하고 데이터를 저장한 후, 분석이 끝나면 장비 펌프를 다시 세척하십시오.각 웰의 빛 방출 데이터는 소프트웨어 프로그램에 의해 Microsoft Excel 데이터 시트로 자동 전송됩니다. Excel의 데이터를 Prism Software 4.0에 붙여넣으십시오. x축에는 다양한 펩타이드 농도를, y축에는 생물 발광 단위(bioluminescence units)를 표시하여 그래프를 생성하십시오.Y축에서 비선형 회귀 곡선 적합 분석을 선택하여 각 펩타이드의 농도 반응 곡선과 그에 해당하는 EC50 값을 구합니다. 데이터 분석을 위해 각 실험은 3회 반복해야 합니다. 중국 햄스터 난소(CHO) K1 세포에서 발현시켰을 때, 모기 *Aedes aegypti* 유래의 키닌 수용체는 다중 리간드 수용체로 작용하였으며, 1nM의 낮은 농도에서도 기능적으로 반응하였습니다.칼슘 생물발광 플레이트 분석법을 사용하여 단독으로 테스트한 세 가지 내인성 eighties 키닌의 결과입니다. 통계적으로 유의미한 차이를 보이는 EC 50 값은 eighties aegypti 키닌 3의 경우 약 16 nanomolar, eighties aegypti 키닌 2의 경우 26 nanomolar, eighties aegypti 키닌 1의 경우 49 nanomolar로 측정되었으며, 이에 따른 효능 순위는 eighties 키닌 3가 가장 강력하고 eighties 키닌 1이 가장 약한 것으로 나타났습니다. 다음은 칼슘 생물발광 플레이트 분석법을 통해 진드기 키닌 수용체를 발현하는 Chinese hamster ovary K 1 세포주에서 확인한 6가지 alpha amino ISO butyric acid 키닌 유사체의 활성 비교 결과입니다.Y축은 각 아날로그에 대해 관찰된 농도에서의 생체 발광량을 모든 테스트 농도에서 관찰된 최대 반응에 대한 백분율로 나타낸 최대 생체 발광 단위 백분율을 의미하며, KININE HEXA 펩타이드 F-F-F-S-W-G amide는 수용체 활성의 양성 대조군입니다. 단일 치환 키닌 아날로그인 double F 아미노 ISO butyric acid WG amide는 양성 대조군인 HEXA 펩타이드 KININE 아날로그보다 더 활성적이었으며, 두 개의 아미노낙산으로 치환된 KININE 아날로그인 aminobutyric acid FF aminobutyric acid WG amide는 테스트된 이중 치환 아날로그 중 가장 강력했습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 AGPCR을 발현시키고 칼슘 생체 발광 분석법을 통해 수용체에 대한 리간드의 구조-활성 관계를 분석하기 위한 클론 세포주를 확보하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

체외에서 성인 모기에 형광 기자를 표현하는 alphavirus transducing 시스템을 사용 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 대신 또는 기자 이외에 관심있는 단백질을 표현하는 적응 수 있습니다.

Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

출처: Lark, A. R., et. al., 생물 발광 칼슘 지표 GFP-aequorin을 기반으로 한 생체 내 기능적 뇌 이미징 접근 방식. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 Green을 사용한 칼슘 역학의 실시간 이미징을 보여줍니다. 초파리 심부 뇌 구조에서의 형광 단백질-aequorin 생물 발광.

초파리 뇌 구조에서 칼슘 과도 현상을 연구하기 위한 생물 발광 이미징

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

초파리의 앞다리와 주둥이는 미각 감각 뉴런의 풍부한 레퍼토리를 포함하고 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 미각 페로몬의 외인성 적용 시 살아있는 파리의 앞다리와 주둥이에 있는 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정하는 방법을 제시합니다.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

설명된 것은 계란을 계산하고 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하여 개별 모기의 해치 비율을 결정하는 시간과 공간 절약 방법이며, 이는 실질적으로 fecundity 및 불임 검사의 규모와 속도를 증가시킬 수 있습니다.

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

AC-DC 전기 침투를 사용하여 사람의 손에 있는 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동을 연구하기 위한 절차가 설명되어 있습니다.

인간의 손에 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동 연구를 위한 AC-DC 전기 침투 검사

배우세요 칼슘 생물발광 분석법을 이용하여 Aedes aegypti와 Rhipicephalus microplus의 GPCR에서 펩타이드 구조-활성 관계를 분석하는 방법을. 안정적인 단일세포주를 확립하여 신경펩타이드 수용체 활성을 정량적으로 측정할 수 있습니다.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

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