Name: 브레인 - 침투 Leukocytes의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 배우세요 TMEV 감염 마우스 뇌에서 백혈구를 분리하는 방법을. Percoll 및 Ficoll 그래디언트 원심분리를 사용하여 면역세포를 정제하고 유세포분석으로 표현형을 분석합니다. 이 기법은 신경면역학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 메이요 클리닉 (CLH)에서 조기 경력 개발 보너스로, NINDS (CLH)에서 부여 NS64571 지원하고, 도널드와 프랜시스 Herdrich (CLH)에서 후한 선물로.했습니다 우리는 도움을 메이오 클리닉 유동세포계측법 코어를 감사하고 싶습니다.

1. Intracranial 바이러스 주입 : 다음 기술은 수정 및 실험실 및 동료에 의해 광범위하게 활용되었습니다. 간단히, Theiler의 murine encephalomyelitis 바이러스 (TMEV) 또는 사기 - 감염의 다니엘의 변형의 intracranial 주입 (1, 10) 뇌 침투 leukocytes (BILs)를 이끌어내는 젊은 생쥐 (세 선호 5-6주)에 수행됩니다. 결과는 다니엘의 변형, 콩 변형 및 GDVII 스트​​레인 다를됩니다. BILs을 수확하기위한 목적으로, 생쥐는 TMEV의 2x10 5 PFU을 받고 24 시간 동안 감염됩니다. <ol><li> 자동 1 ML 해밀턴 주사기로 (27 게이지, ¼ 켄달에) 주입 바늘을 첨부 및 바이러스 10 μl를 제공하기 위해 설정할 수 있습니다. </li><li> 공기 방울에 세심한주의와 주사기에 10 μL DMEM에 TMEV을 그립니다. 경우 적절한, 가짜 감염된 생쥐는 바이러스가없는 DMEM 10 μl를 받게됩니다. </li><li> 직전 주사로, 아래 면화 기판과 전선 격자를 포함하는 벨 항아리에 isoflurane의 약 1 ML 잔. </li><li> 발가락 - 핀치에 무심하고 흡입 마취에 의해 고정화 벨 병 속에 와이어 그리드에 자리 마우스 direclty들이 가볍게 anesthetized 될 때까지, 약 10~15초. 마우스는 물질이 자극 및 부식성 수 있듯이, isoflurane 직접 접촉해서는 안됩니다. </li><li> 마취 동안 빠르게 면도 및 inking을 사용하여 두개골에있는 전두엽 피질 영역에 해당하는 좌표의 위치를​​하여 사출에 대한 생쥐를 준비합니다. 주사에 대한 일반적인 위치는 bregma에 앞쪽에 1mm과 오른쪽에있는 화살 봉합 (그림 1) 가로 1mm입니다. stereotactic 사출 일부 실험 상황에 맞게 수 있지만, 우리는 면도 또는 inking없이 무료로 직접 분사이 실험의 대부분에 적합한 것으로 나타났습니다. 두 축의 따라 바늘 지점과 모피 파팅 것은 사출에 적합합니다. </li><li> 주사를 만들기 위해선, 동양 약 3mm 깊이로 뼈를 통해 두개골과 언론에 바늘 직각. </li><li> 해밀턴 주사기 버튼을 눌러 철수하기 전에 두뇌를 입력 바이러스 2 초 대기하여 두뇌로 특급 바이러스. </li><li> 조심스럽게 바늘을 제거하고 깨끗한, 마른 새장에 마우스를 놓으십시오. 마우스 신속하게 마취에서 각성과 분 이내에 정상 기능을 재개하십시오. 동물의 안락사로, 같은 주사 사이트에서 과도한 출혈로 이상 증상을 전시 마우스에 적절한 관심을주고하는 것은 적절한 수 있습니다. 건강과 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 지침 국립 연구소에 6 준수를 취급 적절한 동물을 따라야합니다. </li></ol> 2. 브레인 - 침투 백혈구 세포 준비 : <ol><li> 10 ML RPMI 1640, 9 ML Percoll 1 ML 10X PBS 및 튜브 두뇌 제거 프로세스 동안 벤치에서 RT에 앉아 있어야 30 ML의 용량을 저장할 수있는 왕복 하단의 오크 리지 원심 분리기 튜브를 준비합니다. </li><li> 실온 (RT)에 Ficoll - Paque 플러스 가져와. </li><li> 수정 isoflurane 과다 5 동물을 안락사 빠르게 얼음 5 ML RPMI를 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 스테인레스 스틸 조직 주걱과 장소를 사용하여 두뇌를 제거합니다. 어떤 상황에서, PBS - 재관류는 BILs 준비에서 말초 혈액 세포를 순환 삭제하기위한 적절한 수 있습니다. 마우스 완전히 정상적으로 anesthetized 사전 PBS - 재관류하는 것입니다. </li><li> 두뇌와 7 ML 유리 Pyrex 브랜드 Tenbroeck 조직 분쇄기로 RPMI 솔루션을 전송하고 부드럽게 10-15 스트로크와 균질. </li><li> 균 질기와 두 pipet 위아래로 Pipet 추가 5 ML RPMI합니다. 전송 뇌 homogenate (약 10 ML) 이전에 준비 왕복 아래 튜브와 부드럽게 반전을 2-3 배 혼합합니다. </li><li> 베크맨 알레 그라 X - 22R 임상 원심 분리기에서 F0360 고정 각도 로터의 RT 30 분 7,800그램 아베의 뇌 homogenate를 스핀. </li><li> 원심 분리 후, 그라디언트의 꼭대기에 떠오르있다 myelin의 잔해를 제거합니다. 붉은 혈액 세포 펠릿 (그림 2) 위의 수레 백혈구 레이어를 수집합니다. </li><li> 50 ML 원뿔로 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 백혈구 레이어를 스트레인. RMPI과 함께 50 ML 볼륨에 솔루션을 가져 오십시오. </li><li> 스핀 튜브는 RT에서 5 분 1,500 RPM (600g 아베)에서 임상 원심 분리기에 희석 세포 현탁액을 포함. </li><li> 뜨는을 기음과 세포 펠릿를 수집합니다. 1 ML 외과 버퍼의 펠릿 (1 % 소 혈청 알부민, 0.02 % 나트륨 칼슘 마그네슘 azide와 무료 PBS)를 Resuspend 5 ML 라운드 바텀 외과 튜브에 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다. </li><li> 1 ML Ficoll - Paque 플러스와 함께 조심스럽게 밑받침 서스펜션. </li><li> 없이 브레이크와 RT 25 분 임상 원심 분리기에서 2,500 RPM (1400 준)에서 튜브를 스핀. </li><li> 1 ML의 피펫과 새로운 5 ML 외과 튜브로 전달 인터페이스 (그림 2)에서 하얀 솜털 레이어를 제거합니다. 와시 C4 ML 외과 버퍼와 엘스. </li><li> 펠렛 세포로 임상 원심 분리기에서 RT에서 5 분 1,500 RPM (600g 아베)에서 튜브를 스핀. </li><li> 뜨는을 기음과 세포 펠릿를 수집합니다. 적절한 버퍼에 백혈구 펠렛을 Resuspend하고 새로운 외과 튜브에 얼음 계속. </li><li> Trypan 파랑 배제함으로써 세포 생존을 평가하고 유동세포계측법에 의해 분석, 세포를 계산합니다. 일반적으로, 조사는 약 5 × 10 5 세포 / 동물를 얻기 기대할 수 있습니다. </li></ol> 3. 흐름 cytometric immunophenotyping <ol><li> leukocytes을 분리하고 계산 후, 임상 원심 분리기에서 1,500 RPM (600 준)에서 3 분 동안 세포를 스핀. </li><li> 다음 사항을 포함하는 버퍼를 차단에서 펠렛을 Resuspend : 2.4G2 하이 브리 도마 (FC 차단, anti-CD16/32)에서 뜨는 외과 버퍼, 그리고 10시 5분 1초의 비율로 태아 소 혈청과 4 30 분 품어 ° C . </li><li> 준비하고 4 30 분 1:200과 부화의 농도에서 차단된 세포 ° 어둠 속에 C로 세포 항원에 대한 항체 복합을 추가합니다. 스테인과 96 잘 V - 하단 플레이트에 200 μl의 세포를 품어. 적절한 컨트롤이 필요한 흠없는 셀 및 fluorochrome 보상 샘플을 포함합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트에 대한 적절한 로터를 사용하여 임상 원심 분리기에서 1,500 RPM (600 준) 3 분 RT에서 스테인드 세포를 스핀. </li><li> 뜨는을 대기음 부드럽게 3 번 아래 pipetting과로 200 μl 외과 버퍼로 세포를 씻어. </li><li> 두 번 이상 세척 기법을 반복합니다. </li><li> 세척 후, 2 % paraformaldehyde와 외과 튜브로 전송에서 세포를 resuspend. 고정은 Biosafety 레벨 2 시약에 감염된 세포의 흐름 cytometric 분석을 위해 필요합니다. </li><li> 수정된 유동세포계측법 방법 8 다음 BD 외과 Calibur에 고정 셀을 실행하고 오프라인 FlowJo, WinMDI 또는 기타 가능한 유동세포계측법 분석 소프트웨어를 사용하여 파일을 분석할 수 있습니다. </li><li> 샘플 당 50-100,000 이벤트의 분석은 일반적으로 적절한 immunophenotyping 필요합니다. </li></ol> 본 실험에 사용되는 직접 복합 항체 : CD45는 클론 30 F11과 함께 발견되었다. Ly6C / G는 복제 Gr1, RB6 - 8C5과 함께 발견되었다. CD11b는 클론 M1/70과 함께 발견되었다. F4/80는 클론 BM8과 함께 발견되었다. 4. 대표 결과 : 우리는 24 시간 이후 감염 (그림 3)에서 마우스 BILs에 대한 세포 phenotyping 결과를 보여줍니다. Leukocytes이 면역 세포를 감지하는 PerCP - 복합 방지 마우스 CD45 물들일 있었 PE - 복합 백신 마우스 Ly6C / G 세포를 감지하는 염증성 monocytes, APC - 복합 백신 마우스 CD11b와 APC - 복합 백신 마우스 F4/80를 검색하는 단핵구 혈통니다. 분석 BD 외과 Calibur 악기와 함께 연주했다. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 사출 사이트의 해부 지방화. 사출 사이트 bregma에 앞쪽에 1mm과 오른쪽에있는 화살 치료 측면 1mm에 위치해 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. leukocytes 및 BILs의 기울기 분리 일러스트. Leukocytes 처음에는 직접 myelin의 파편 층 아래와 Percoll 기울기에 RBC 펠렛 위의 수집하고 있습니다. 인터페이스에 하얀 솜털 층 (BILs)은 Ficoll 기울기로부터 수집됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 24 시간 후 감염. 마우스 leukocytes에서 두뇌 infilatrating leukocytes의 Immunophenotype은 조직 intracranial 감염 후 24 시간에서 동물에서 준비 homogenates의 차동 밀도 원심 분리에 의해 두뇌에서 고립되었다. 세포는 마우스 CD45에 대한 찬란 - 복합 항체 물들일 있었 Ly6C / G, CD11b, 그리고 F4/80. 초기 게이팅는 앞으로 분산형 (FSC), 셀 크기 (C)의 지표에 대한 CD45, 면역 세포의 마커를하려 의해 수행되었다. CD45 안녕 (A, D), CD45 이오 (B, E) 및 CD45 neg (F, G) 인구는 다음 단핵구와 대식 세포 마커 Ly6C / G, F4/80 (A, B의 상대적인 표현 수준을 분석했다 , F) 및 CD11b (D, E, G). Ly6C / G + F4/80 + CD11b + 염증 monocytes가 주변에서 이러한 세포의 침투와 일치 CD45 안녕 인구 (A, D)에 거의 독점적으로 발견되었습니다. 대조적으로, Ly6C/G-F4/80 이오 CD11b + macrophages은 CD45 이오 (B, E)와 CD45 neg (G) 주민 표현형과 일치 집단에 거의 독점적으로 발견되었습니다. 수많은 실험에서, 우리는 감염되지 않은 또는 사기 - infec의 두뇌에서 CD45 안녕 셀 또는 Ly6C / G + F4/80 + CD11b + 염증 monocytes을 관찰 적이 없다테드 마우스 (데이터가 표시되지 않음).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
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<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 정기적으로 뇌 세포 침투 준비의 품질 모두를 결정하는 유동세포계측법를 사용하고, 면역 세포, 2, 9의 다른 인구를 구별합니다. 급성 시간 지점에서 우리 BILs 메서드는 CD45hi 인구뿐만 아니라 CD45lo 인구의 macrophages 높은 비율 이내에 염증 monocytes의 높은 비율을 산출. 이것은 두뇌 속에 재현할 면역 반응이 견고하게 우리의 방법을 특징으로 할 수 없음을 나타냅니다. 이 기술은 마우스의 두뇌에서 면역 세포를 잘 특징 인구를 필요로 실험을 위해 특히 중요하다. 우리는 이전에 꼬리 정맥 주사 7을 통해 호스트 마우스에 leukocytes에 침투해 우리의 두뇌를 주사하여 입양 전송 실험을 수행 있고, 우리는 체외 실험 9 여러 통해 BILs를 묘사했습니다. 우리 BILs 준비는 주민 macrophages과 microglia을 포함하여 두뇌의 거주 세포에서 면역 세포의 다...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> 하우 랩 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 다니엘의 변형 </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> 둥근 바닥 오크 리지 원심 분리기 튜브 </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 로체 </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll - Paque 플러스 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan 블루 0.4 % (W / V) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 튜브 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 ML 유리 Pyrex 브랜드 Tenbroeck 조직 연삭기 </td><td> 어부 </td><td> 08-414 - 10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm의 셀 스트레이너 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 원뿔 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 시그마 </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF - PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 외과 튜브 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 하이 브리 도마 </td><td> ATCC </td><td> HB - 197 </td><td></td></tr><tr><td> 코스타 V - 바닥 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> 알레 그라 X - 22R 원심 분리기 또는 동급 </td><td> 베크맨 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 양동이와 로터 </td><td> 베크맨 </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> 고정 앵글 로터 </td><td> 베크맨 </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD 외과 Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7.5 </td><td> 트리 스타 (주) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> 클론 : 30 - F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> 클론 : RB6 - 8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> 클론 : M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> 클론 : BM8 </td></tr></tbody></table>

브레인 - 침투 leukocytes의 분리

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

우리는 생쥐의 두뇌 침투 leukocytes (BILs)를 준비하는 방법을 설명합니다. 우리는 어떻게 뇌 전체에서 침투 세포 백혈구 - 풍부한 인구를 정​​화하기 위해 신속한 intracranial 분사 기술과를 통해 Theiler의 murine encephalomyelitis 바이러스 (TMEV)와 마우스를 감염하는 방법을 보여줍니다. 간단히 마우스는 닫힌 챔버에서 isoflurane과 anesthetized되며 전두엽 피질에 해밀턴 주사기로 주입 자유 손으로입니다. 생쥐는 다음 Tenbroeck 조직 분쇄기로 RPMI에서 추출하여 균질 아르 isoflurane 과다 복용과 전체 뇌 감염 후 여러 시대에서 살해되었습니다. 두뇌 homogenates은 myelin 및 기타 세포 파편을 제거하는 연속 30 % Percoll 기울기를 통해 centrifuged 수 있습니다. 세포 현탁액은 다음 40 μm의에서 긴장 세탁 및 leukocytes을 선택하고 정화하는 불연속 Ficoll - Paque 플러스 기울기에 centrifuged 있습니다. leukocytes 그런 다음 세탁 및 유동세포계측법에 의해 immunophenotyping에 적합한 버퍼에 resuspended 있습니다. 유동세포계측법가 C57BL / 6 생쥐에 감염의 초기 단계에 타고난 면역 세포의 인구를 보여줍니다. 24 시간 이후 감염에서 면역 세포의 여러 하위 집합은 Gr1 +, CD11b +와 F4/80 + 세포의 풍부한 인구와 BILs에 존재한다. 따라서,이 방법은 두뇌의 급성 감염에 대한 면역 반응을 특성화에 유용합니다.

murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

마우스로부터 뇌 침윤 림프구(brain infiltrating leukocytes, BILs)를 분리하는 방법을 설명합니다. 본 영상에서는 Theiler's murine ...를 이용하여 마우스를 감염시키는 방법을 시연합니다.

이 실험 절차의 전반적인 목적은 TMEV(Theiler's mirroring encephalomyelitis virus)에 급성 감염된 마우스의 뇌에서 백혈구가 풍부한 선천성 면역 세포군을 얻는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 두개강 내에 TMEV를 감염시킨 후, 감염 24시간 후에 뇌를 채취하여 부드럽게 균질화함으로써 달성됩니다.절차의 세 번째 단계는 연속적인 perca 및 불연속적인 fol 구배를 활용하여 백혈구가 풍부한 세포층을 선택적으로 정제하는 것입니다. 최종적으로, 뇌의 급성 감염에 대한 면역 반응에 관여하는 뇌 침윤 백혈구 집단의 표현형을 유세포 분석을 통해 특성화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Charles Howe 박사입니다.오늘 저희가 시연할 방법은 신경면역학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 급성 감염 동안 뇌로 침투하는 면역 세포는 무엇일까요? 오늘 이 방법을 시연할 사람은 Reagan la France입니다.내 실험실의 선임 연구 기술자인 Corey가 뇌로 침투하는 백혈구를 유도하는 과정입니다. 27게이지 바늘을 1mL 자동 Hamilton 시린지에 장착하고 시린지를 10 µL로 설정합니다. 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하며, 2 × 10⁵ PFU의 TMEV Daniel 균주가 감염된 DMEM 10 µL 또는 가짜 감염된 DMEM 10 µL를 시린지에 흡입합니다.5~6주령의 마우스를 마취하고, 마취 상태에서 발가락 꼬집기 시험을 통해 진정 상태를 확인합니다. 두개골의 전두엽 피질 영역에서 적절한 좌표를 신속하게 찾아 주사 준비를 합니다. 주사 시 바늘이 두개골과 수직이 되도록 방향을 잡고, 양쪽 AE에 맞춰 마우스 털을 정리한 후 바늘을 뼈 덮개 너머 약 3mm 깊이까지 밀어 넣습니다. 바이러스 감염된 DMEM 또는 모의 감염된 DMEM을 뇌로 주입하기 위해 Hamilton 시린지 버튼을 누르고, 배지가 뇌로 완전히 들어갈 때까지 2초간 대기한 후 바늘을 제거합니다.바늘을 조심스럽게 제거하고 마우스를 깨끗하고 건조한 케이지에 넣습니다. 마우스는 마취에서 빠르게 깨어나며, 두개내 바이러스 또는 sham 감염 24시간 후 1분 이내에 정상 기능을 회복합니다. 뇌 침윤 백혈구를 분리하기 전에, 라운드 바텀 Oakridge 원심분리 튜브에 10 milliliters의 RPMI 1649 milliliters의 per call 및 1 milliliter의 10 XPBS를 채운 후 튜브를 상온에서 보관합니다.FI call pack plus를 실온으로 맞추고, 15 mL 원추형 튜브에 5 mL의 RPMI를 채운 후 함께 얼음 위에 둡니다. 변형된 isof fluorine 과량 투여로 동물을 희생시킨 후, 뇌를 신속하게 적출하여 5 mL의 RPMI가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 뇌와 RPMI 용액을 7 mL Pyrex 브랜드 유리제 10 brook 조직 분쇄기에 옮기고, 10~15회 가볍게 스트로크하여 뇌를 균질화합니다.다음으로, RPMI 5 mL를 호모게나이저에 추가로 분주하고 솔루션을 두 번 피펫팅하여 섞어줍니다. 약 10 mL의 뇌 호모제네이트를 미리 준비한 라운드 바텀 릿지 원심분리관으로 옮기고, 튜브를 2~3회 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 이제 고정각 로터 원심분리기를 사용하여 뇌 호모제네이트를 상온에서 7,800 G로 30분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 밀도 구배의 상단으로 떠오른 수초 파편을 제거하십시오. 백혈구 층은 적혈구 펠릿 위에 떠 있습니다. 백혈구 층을 40 µm 세포 스트레이너로 걸러 50 mL 원추형 튜브에 담으십시오.용액의 최종 부피를 50 milliliter로 맞춥니다. 희석된 세포 현탁액이 담긴 튜브를 임상 원심분리기로 600 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 상온에서 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠릿을 수집합니다.펠릿을 1 mL의 FACS 버퍼에 다시 현탁하고, 세포 현탁액을 5 mL 원형 바닥 FACS 튜브에 넣습니다. 현탁액 아래에 상온의 Ficoll-Paque Plus 1 mL를 조심스럽게 층분리하여 넣습니다. 임상 원심분리기에서 FACS 튜브를 800 Gs로 25분 동안 원심분리합니다.실온에서 중단 없이, 1 mL 피펫을 사용하여 계면의 흰색 솜털 층을 제거하고 이를 새로운 5 mL FACS 튜브로 옮깁니다. 4 mL의 FACS 완충액으로 세포를 세척합니다. 이제 임상 원심분리기로 튜브를 다시 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.그런 다음 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 수집합니다. 백혈구 펠렛을 블로킹 버퍼에 재부유시킨 후 얼음 위에 보관합니다. 이어서 세포 수를 측정합니다.뇌 침윤 백혈구를 분리하고 계수한 후, 유세포 분석 면역표현형 분석을 위해 세포를 V-bottom 플레이트에 분주합니다. 그다지 임상 원심분리기를 사용하여 세포를 원심분리합니다.펠렛을 200 µL의 블로킹 버퍼에 다시 현탁시키고 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 1:200 농도로 항체를 첨가하고, 이번에는 암소 상태의 얼음 위에서 세포를 30분 더 배양합니다. 그 후 염색된 세포를 임상 원심분리기로 원심 분리한 다음 상층액을 흡입하여 제거합니다.펠렛에 fax 버퍼 200 µL를 첨가하고 피펫으로 세 번 부드럽게 섞어줍니다. 그 다음 원심분리기에서 동일한 방식으로 세포를 두 번 더 세척합니다. 최종 세척 후, 세포를 최종 농도 2% paraformaldehyde에 재현탁하고 염색된 세포를 fax 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 고정된 세포를 유세포 분석기에 제출하고 fax 분석 프로그램을 사용하여 파일을 오프라인으로 분석합니다.두개내 감염 24시간 후 동물로부터 준비된 조직 균질액을 밀도 구배 원심분리하여 뇌에서 마우스 백혈구를 분리하였습니다. 이 두 개의 점 도표(dot plot)에서 볼 수 있듯이, Ly6C 양성, F4/80 양성, CD11b 양성 염증성 단핵구는 거의 전적으로 CD45 high 집단에서 발견되었으며, 이는 말초로부터 이러한 세포들이 침윤했음을 시사합니다. 반대로, Ly6C 음성, F4/80 low, CD11b 양성 대식세포는 거의 전적으로 왼쪽 두 패널의 CD45 low 집단과 가장 오른쪽 패널의 CD45 음성 집단에서 발견되었으며, 이는 상주 표현형과 일치합니다.이 영상을 시청한 후에는 급성 감염된 동물의 뇌에서 백혈구를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 실험자가 면역 질환 encephalomyelitis와 쥐의 중추 신경계에서 mononuclear 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

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마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

이 비디오는 기계적 해리와 효소 분해를 사용하여 쥐의 뇌에서 종양에 침투하는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 다음에는 추가 분석을 위해 면역 세포를 수집하기 위해 밀도 구배 원심분리가 수행됩니다.

쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한...

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

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이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

배우세요 TMEV 감염 마우스 뇌에서 백혈구를 분리하는 방법을. Percoll 및 Ficoll 그래디언트 원심분리를 사용하여 면역세포를 정제하고 유세포분석으로 표현형을 분석합니다. 이 기법은 신경면역학 연구에 필수적입니다.

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