무균 실험실 기술 : Serological Pipettes 및 Micropipettors로 볼륨 이동

본 시연에서는 실험대 위에서 세롤로지컬 피펫과 마이크로 피펫을 이용한 부피 전이 시의 무균 실험 기법을 제시합니다. 번젠 버너 불꽃으로 생성된 무균 구역 내에서 작업하십시오. 용도에 적합한 부피 전이 도구를 선택하십시오.

그런 다음 배양 시약과 재료의 멸균 상태를 유지하면서 멸균 상태가 훼손되지 않도록 적절히 사용하고, 액체를 정밀하게 흡입하여 함께 처리하십시오. 이러한 절차는 오염원을 최소화하고 기초 실험의 정밀도를 확보하는 데 필수적입니다. 초기에는 액체를 옮길 때 멸균 상태를 유지하면서 기기를 정밀하게 설정 및 정확하게 읽고, 기기 및 실험실 재료의 조작을 조율하는 것이 어려울 수 있습니다.

살아있는 표본을 다룰 때 실험의 성공을 위해서는 실험실 내 무균 조작법(septic technique)을 숙달하는 것이 필수적이므로, 이러한 절차가 완전히 익숙해질 때까지 시간을 투자하여 학습하십시오. 벤치에서 작업하는 동안, 실험실 코디네이터인 Dr.Chris Reddy가 프로토콜을 시연할 것입니다. 모든 실험 절차를 시작하기 전에는 항상 항균 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻으십시오. 먼저 흐르는 따뜻한 물에 손을 적십니다.

그 다음 비누를 바르고 힘 있게 문질러 골고루 펴 바릅니다. 엄지손가락, 손가락 등, 손등, 손톱 밑을 포함한 모든 표면에 마찰이 생기도록 손을 문지릅니다. 그 후 잔여 비누가 남지 않도록 깨끗이 헹구고, 홀더에서 나온 페이퍼 타월을 사용하여 건조합니다.

마지막으로, 새 종이 타월을 사용하여 수도꼭지를 잠그고 실험대 작업 영역을 정리합니다. 그런 다음 용기에서 미리 적셔진 소독 티슈를 꺼내 전체 영역을 닦아냅니다. 점화기 조명을 사용하여 소독제가 증발하도록 둡니다.

분젠 버너입니다. 불꽃을 조절하여 중앙에 파란색 원뿔 모양의 내염이 형성되게 합니다. 실험대 위의 멸균 구역 근처에 절차에 필요한 모든 준비물을 배치합니다.

또한, 모든 재료에 라벨이 제대로 부착되었는지 확인하십시오. 세롤로지컬 피펫은 플라스틱 또는 유리, 일회용 또는 재사용 가능, 플러그 유무 등 선택 사항이 다양합니다. 다양한 크기의 피펫은 피펫에 용액이 과하게 채워지는 것을 방지하는 배리어 역할을 하는 플러그로 보정되어 있습니다.

세롤로지컬 피펫 또한 두 가지 방식으로 보정된다는 점에 유의하십시오. 상단에 이중 링 표시가 있는 TD 피펫은 팁 부분의 부피가 배출되지 않도록 보정되었습니다. 여기서는 보여주지 않지만, TC 피펫은 모든 부피를 배출하도록 보정되어 있으므로 반드시 블로우 아웃(blow out) 해야 합니다. 개별 포장된 멸균 플라스틱 세롤로지컬 피펫을 사용하여 무균 조작법으로 진행하며, 밀봉된 끝부분부터 시작하여 종이를 조심스럽게 벗겨냅니다.

슬리브 전체를 제거하지 마십시오. 그 대신 피펫 핸들의 팁 부분, 즉 눈금 표시 위의 피펫 상단부만 보호한 상태에서 벌브 펌프나 건과 같은 피펫 보조 도구를 세롤로지컬 피펫의 상단 끝에 고정하십시오. 한 손으로는 피펫 보조 도구를 잡고, 다른 한 손으로는 플라스틱 피펫에서 종이 슬리브를 제거하십시오.

금속 보관함에 보관된 유리 혈청학적 피펫의 경우, 보관함 상단을 헐겁게 하여 캡을 제거하고 캡과 보관함의 열린 끝부분을 화염 멸균합니다. 그 다음, 소독된 벤치 위에 캡을 옆으로 눕혀 놓습니다. 보관함을 수평으로 잡고 흔들어 한두 개의 피펫 상단이 나오게 합니다.

약 1인치 정도 돌출되게 하십시오. 캐니스터를 옆으로 눕히고 다른 피펫을 건드리지 않은 상태에서 피펫 하나를 꺼냅니다. 피펫의 하단 팁이 손이나 비멸균 표면에 닿지 않도록 주의하십시오.

피펫 에이드를 부착하십시오. 그런 다음 유리 피펫의 하단 3분의 1 부분을 분젠 버너 불꽃 속의 파란색 원뿔 부분에 1~3초 동안 통과시키십시오. 이제 멸균 배지가 들어 있는 병의 캡을 제거하십시오.

한 손의 약지와 손바닥 사이에 병을 잡고, 같은 손의 엄지, 검지, 중지로 피펫 에이드를 조작하는 동안 다른 한 손으로 병을 45도 각도로 기울여 병 입구를 분젠 버너의 불꽃에 통과시킵니다. 멸균된 피펫 팁을 배지에 넣습니다. 그런 다음 피펫 에이드를 사용하여 눈금 표시를 확인하며 액체를 흡입합니다.

피펫으로 흡입되는 부피를 모니터링하여 부피를 정확하게 읽으십시오. 피펫을 수직으로 세우고 액체의 메니스크스를 눈높이에서 정면으로 확인하십시오. 다시 한번 병의 입구를 분젠 버너 불꽃에 통과시키십시오.

그 다음 캡을 닫습니다. 배지 병을 옆으로 치워 둡니다. 그런 다음 멸균 튜브를 준비하여 무균적으로 처리합니다.

앞서 설명한 대로 캡을 제거합니다. 튜브의 입구 부분을 화염 멸균하여 무균 구역을 조성합니다. 샘플이 튀지 않도록 유량을 조절하며 피펫으로 배지를 튜브에 분주합니다.

입구를 화염 멸균합니다. 다시 캡을 닫고 튜브를 옆으로 치워 둡니다. 이제 피펫 에이드를 제거하고, 플라스틱 피펫은 지정된 손상성 폐기물 컨테이너에 버리며, 유리 피펫은 10% 표백액 용액에 담급니다.

마이크로 파이펫은 특정 부피 범위에 맞는 다양한 크기의 기구를 사용하여 미세 부피를 정밀하게 측정하고 분주할 수 있게 해줍니다. 멸균된 튜브와 플라스틱 팁을 준비하십시오. 또한, 미리 적셔진 소독 티슈를 사용하여 마이크로 파이펫을 닦아내십시오. 참고.

Volter는 가장 작은 눈금에 정확도가 반영된 마이크로 피펫의 유형에 따라 해석해야 하는 세 개의 숫자를 보여줍니다. 예를 들어, P 20은 2.0에서 20.0 µL 사이의 부피에 사용됩니다. 검은색으로 표시된 상단 숫자는 10 µL 단위의 수치를 나타냅니다.

두 번째 검은색 숫자는 마이크로리터 단위의 부피를 나타냅니다. 빨간색 숫자는 0.1 마이크로리터를 표시하므로, 각 눈금 한 칸은 0.02 µL의 증가분을 의미합니다. 먼저, 조절 노브를 돌려 숫자 표시창에 표시된 대로 디스펜서 부피를 설정하십시오.

마이크로 피펫의 설정 부피를 줄일 때는 썸휠을 천천히 돌려 눈금 표시에 맞춥니다. 설정 부피를 늘릴 때는 원하는 눈금 표시를 1/3바퀴 정도 지나칠 때까지 썸휠을 돌립니다. 그 다음 썸휠을 천천히 다시 돌려 목표 부피에 맞춥니다.

항상 멸균 플라스틱 일회용 팁을 사용하십시오. 마이크로 피펫 배럴 끝에 팁을 단단히 끼웁니다. 아래로 누르며 살짝 돌려 공기가 새지 않도록 밀봉합니다.

마이크로 피펫을 수직으로 잡으십시오. 마이크로 피펫에는 정지 상태, 1단 정지, 2단 정지의 세 가지 위치가 있음에 유의하십시오.

플런저의 푸시 버튼을 휴지 위치에서 첫 번째 정지 지점까지 눌러 설정 부피만큼의 공기를 밀어냅니다. 이제 푸시 버튼을 첫 번째 정지 지점까지 누른 상태에서 팁을 액체에 담급니다. 푸시 버튼을 천천히 놓아 액체를 팁 안으로 흡입합니다.

푸시 버튼이 정지 위치에 도달하면 액체가 팁 내부로 흡입될 때까지 기다립니다. 그런 다음 팁을 액체에서 제거합니다. 팁으로 흡입된 액체의 양을 육안으로 확인하고, 기포가 없는지 확인합니다.

팁을 액체를 받는 튜브 벽면에 10에서 45도 각도로 위치시킵니다. 이제 플런저의 푸시 버튼을 첫 번째 정지 지점까지 천천히 누릅니다. 액체를 배출합니다.

잠시 후, 푸시 버튼을 두 번째 멈춤 지점까지 눌러 잔류 액체를 모두 배출합니다. 팁을 액체에서 꺼낸 다음, 플런저를 휴지 위치로 되돌립니다. 마지막으로 마이크로 피펫의 배출 버튼을 눌러 팁을 지정된 날카로운 폐기물 전용 용기에 버립니다.

먼저 분젠 버너를 끕니다. 모든 소모품과 시약을 정리한 후, LabWare의 외부 표면을 소독 티슈로 닦아내고 보관 장소로 옮깁니다. 그다음 오염된 유리 기구와 유해 폐기물을 적절한 폐기 용기에 넣습니다.

소독제가 증발할 수 있도록 작업 영역 전체를 다시 한번 닦아냅니다. 마지막으로, 항균 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻습니다. 무균 조작법을 준수하지 않으면 배양물이 오염되어 실험이 지연될 수 있습니다.

세롤로지컬 피펫을 이용한 액체의 무균 전사는 25 milliliter e coli 배양액과 같은 순수 세균 배양물을 증폭시키는 데 필수적입니다. 또한, 세롤로지컬 피펫은 멸균 시험관으로의 무균 액체 전사를 용이하게 합니다. 본 예제에서는 시험관에 배지를 점적 투여하여 e coli의 순수 배양과 오염된 배양의 차이를 보여줍니다.

때로는 정밀한 부피 측정이 필요합니다. 이 경우, 배지의 이송이 부정확하게 이루어진 것이 분명합니다. 이 예시는 잘못된 부피의 버퍼가 이송된 모습을 보여줍니다.

학생은 12.5 µL를 분주하는 대신 125 µL를 분주했습니다. 볼륨 조절기의 숫자는 동일하게 설정되었지만, 작업에 부적절한 마이크로 피펫이 선택된 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 세롤로지컬 피펫과 마이크로 피펫을 사용하여 용액과 배양물을 옮기는 것과 같은 일상적인 실험 절차에서 멸균 상태를 유지하며 무균 조작법을 적용하는 방법에 대해 실무적인 지식을 갖추게 될 것입니다.

본 과정의 목표는 유리 기구, 피펫 팁, 배양 튜브 및 플라스크를 화염 멸균하는 것과 같은 예방 조치와 실험대 위에서 무균 구역 내에서 작업하는 것이 모든 실험에서 습관화되도록 하는 것입니다. 또한, 실험을 수행할 때 정확하고 정밀한 부피를 측정하고 분주하는 것이 필수적입니다. 이러한 부피 전송 도구의 올바른 사용법을 익히면 실험 결과의 신뢰성을 높일 수 있습니다.