두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

이 절차의 목표는 두 개의 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수에서 안정적인 생체 내 이미징을 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 마취제 혼합물로 동물을 마취시켜 안정적이면서도 차분한 호흡 리듬을 달성함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 척추를 원하는 수준으로 노출시킨 다음 in vivo에서 이미지화할 수 있도록 아래에 있는 척수를 노출시키는 후판 절제술을 수행하는 것입니다.

세 번째 단계는 동물을 척추 안정 장치에 올려 놓는 것입니다. 마지막 단계는 노출된 척수 분절을 격리하는 것입니다. 생체 내 이미징을 준비하기 위해 궁극적으로 두 개의 광자 현미경을 사용한 생체 내 이미징을 통해 세포의 동적 거동 및 살아있는 척수의 다른 세포 유형 또는 구조와의 상호 작용을 자세히 설명하는 결과를 얻을 수 있습니다.

생체 내에서 척수를 이미지화하려는 이전의 시도에 비해 이 기술의 주요 장점은 후처리가 필요하지 않고 즉시 평가하고 추가 분석에 사용할 수 있는 도로 생체 내 이미징 데이터를 생성한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 척수 손상 또는 질병 후 치료로 확장되는데, 예를 들어 척수 손상 외에 부상 후 축삭 변성 또는 재생의 진행을 실시간으로 연구할 수 있기 때문입니다. 이 기술은 척수에서 질병 병리가 두드러지는 다발성 경화증 또는 근위축성 측삭 경화증과 같은 질병의 동물 모델에서 염증 또는 신경 퇴행성 과정의 진행을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

동물의 무게를 잰 것으로 절차를 시작합니다. 다음으로, 마취제 혼합물을 복강내 주사하여 동물을 마취합니다. 실험 내내 동물의 깊은 마취를 보장하기 위해 규칙적인 발가락 꼬집기를 수행하고 원래 용량의 절반의 마취제를 시간당 또는 필요에 따라 보충합니다.

그런 다음 인공 눈물 연고를 눈에 바르면 각막 탈수와 손상을 예방할 수 있습니다. 트리밍 도구로 동물 등의 털을 다듬고 날카로운 칼날로 남은 털을 면도하십시오. 면도한 부위를 소독한 후 동물을 현미경으로 관찰하고 원하는 척추 높이에서 약 1.5cm 위의 작은 세로 절개를 만들어 절차를 시작합니다.

피하 결합 조직을 조심스럽게 수축시켜 뒤쪽 근육 조직을 노출시킵니다. 그런 다음 원하는 수준에서 척추주위근육을 척추에서 조심스럽게 분리합니다. 각 가시돌기의 양쪽 근육을 분리하기 위해 가능한 한 적게 절개하십시오.

그런 다음 라미네이트 표면에서 분리된 근육을 긁어냅니다. 필요한 경우 작은 혈관 소작기를 사용하여 경미한 출혈을 조절하십시오. 밑에 있는 라미네이트가 충분히 노출될 때까지 근육을 계속 긁어내고 제거할 라미네이트를 명확하게 식별할 수 있습니다.

척추의 각 측면에 있는 척추 클램프의 진입 부위를 준비하려면 척추 주위 근육 사이에 구부러진 가위의 끝을 삽입하고 근육 조직을 조심스럽게 옮겨 클램프가 삽입될 4개의 포켓을 만듭니다. 곧은 치아 끝 집게로 척추를 들어 올려 척수를 건드리지 않고 얇은 판 아래에 구부러진 뭉툭한 가위를 안전하게 삽입할 수 있습니다. 그런 다음 한쪽 뼈를 천천히 절제하고 다른 쪽은 면봉을 사용하거나 절개 부위 옆에 미리 자른 작은 젤 폼 흡수성 젤라틴 스폰지 조각을 삽입하여 경미한 출혈을 제한하여 후판 절제술을 수행합니다.

그런 다음 예열된 멸균 인공 뇌척수액을 사용하여 조직을 씻습니다. 척추 안정화 장치는 Nagate STSA 복합 척수 클램프의 주요 구성 요소와 Nagate MA six N 헤드 홀딩 어댑터로 맞춤 설계되었습니다. 스테인리스 스틸 베이스 플레이트는 두 개의 나가(naga) 부분을 정렬하여 고정하여 동물의 머리를 지지하고 척추와 꼬리를 고정하도록 만들었습니다.

동물을 안정시키기 위해 전체 장치가 낮아진 현미경 스테이지의 현미경 렌즈 아래에 맞아야 한다는 점을 명심하십시오. 먼저 척추 안정화 장치의 베이스 플레이트에 있는 고도 패드에 놓습니다. 머리 고정 어댑터에 머리를 고정한 후 척추 clamp 동물의 전방 후방 축을 따라 동물의 전방 축을 따라 후판 절제술 옆에 있는 후판 절제술을 놓습니다.

노출된 척수 위로 수침 렌즈를 내릴 수 있는 충분한 공간을 확보하기 위해 동물의 ROS 코달 축을 기준으로 약 45도 각도로 두 개의 클램프를 배치합니다. 그런 다음 꼬리 바닥에 세 번째 클램프를 놓아 이미징 실험에서 고도 패드를 제거한 후 동물의 몸체를 매달아 놓을 수 있습니다. 다음으로, A CSF에서 척수 유지를 용이하게 하기 위해 노출된 척수 주위에 작은 젤 밀봉 웰을 구축합니다.

그런 다음 In vivo 이미징을 시작할 준비가 되면 고도 패드를 제거하고 안정화 장치를 예열된 현미경 챔버로 가져와 내려진 현미경 스테이지에 놓습니다. 후판 절제술을 렌즈에 맞춰야 합니다. 수침 렌즈를 A CSF 용액에 조심스럽게 내리고 척추 클램프 또는 젤 씰에 닿지 않는지 확인합니다.

에피 형광을 사용하여 관심 영역을 식별하고 나중에 집중합니다. 레이저 스캐닝 모드로 전환하고 이미지 조직에 존재하는 형광에 대해 적절한 2개의 광자 레이저 여기, 파장, 이색성 및 대역 통과 필터를 사용하여 생체 내 이미징을 수행합니다. 영상 실험이 끝나면 척추 안정화 장치에서 동물을 제거합니다.

후판 절제술 주변의 젤 씰을 조심스럽게 닦아내고 청소하십시오. 후판 절제술 위에 등 근육을 잘 봉합합니다. 그런 다음 절개 부위를 봉합하고 in vivo에서 필요한 Zack 이미지의 투영으로 여기에 표시된 Betadine으로 면봉으로 닦은 후 이미지 정렬 없이 Z축을 따라 투영합니다.

이미지는 척수에 있는 빨간색의 혈관과 함께 녹색으로 둘러싸인 고밀도 GFP 양성 미세아교세포를 보여줍니다. 다음은 혈관 벽에 부착된 단일 미세아교세포의 고배율 이미지로, 그 과정의 일부는 혈관 주위로 확장되고 일부는 척수 실질을 향해 확장됨을 자세히 보여줍니다: 다음은 두 개의 다른 세션에서 동일한 YFPH 라인 마우스의 척수에서 재배치 및 reim 이미지화된 동일한 YFP 표지 축삭 분절의 반복적인 생체 내 이미징의 예입니다 5일 간격. 이것은 이틀 연속으로 척수에서 생체 내에서 이미징된 동일한 혈관 구조와 미세아교세포를 보여주는 반복 이미징의 또 다른 예입니다.

다음은 척수에서 생체 내에서 획득한 대표적인 타임랩스 시퀀스입니다. 이 순서는 녹색으로 표시된 미세아교세포의 미세한 돌기의 역동적인 행동과 혈관 구조와의 상호 작용을 빨간색으로 자세히 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 원시 이미지는 배경 노이즈, 밝기 및 대비에 대해서만 수정되었으며, 타임랩스 동영상은 이미지 정렬 없이 이미지 스택을 순차적으로 거부하여 구성되었습니다.

개별 평면의 호주식 선택을 평균화하면 혈관은 미세아교세포의 이미지와 유사한 범위의 Z 평면을 통과합니다. 이미지 볼륨의 깊이는 38미크론입니다. 이것은 단일 Z 평면 수준에서 이미징 방법의 안정성을 보여주는 타임 랩스 시퀀스입니다.

CX three, CR one GFP 이형접합 마우스의 척수에서 동일한 단일 Z plane을 KXA 믹스로 마취하고 척추 안정화 장치에 배치하면 연속 프레임 사이의 이미지 변위가 최소화됩니다. 특히 이 시퀀스의 속도는 초당 1프레임으로 마우스의 호흡 속도보다 빠릅니다. 경미한 잔류 변위는 아마도 동물의 심장 박동 때문일 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 절개 횟수를 최소한으로 제한하고 경미한 출혈이 발생하는 즉시 제한하도록 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이제 이 비디오를 시청한 후에는 두 개의 현미경 검사를 사용하여 마우스 전원 코드에서 안정적인 생체 내 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.