Name: 두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 척수의 생체내 이미징 방법을 두 광자 현미경과 맞춤형 척수 고정 장치를 활용하여 세포 역학을 고해상도로 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 호흡으로 인한 움직임 인공물을 최소화하여 장기간 연구가 가능합니다.

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이 작품은 국립 다중 경화증에 의해 지원되었다 부여 사회 적응 및 / 또는 Davalos 외., J Neurosci 방법에서 reprinted KA 피규어와 영화 DD와 NIH / NINDS 보조금 NS051470, NS052189 및 NS066361에 RG4595A1 / T. 2008 3월 30일, Elsevier의 허가를 169 (1) :1 - 7 2,008 저작권.

1. 척추 안정화 장치를 구축 <ol><li> Narishige STS - A 콤팩트 척수 클램프 및 Narishige MA - 6N 헤드 개최 어댑터를 주문. </li><li> 사용자 정의 디자인과 척추와 꼬리가 고정되어있는 반면 동물의 머리가 지원 있도록 스테인레스 스틸베이스 플레이트는 정렬의 두 Narishige 부품을 개최합니다. 전체 장치가 일반적으로 인하 현미경 무대에서 현미경 렌즈 아래에 적합해야한다는 점에 유의하십시오. </li></ol> 2. 동물 수술 <ol><li> 미리 열 현미경의 공기 가열 장치와 챔버 37에서 유지 ° C. </li><li> 동물의 무게를 100 MG 케타민을 15 MG xylazine 및 무균 조건 하에서 0.9 % NaCl 용액에 희석 체중 kg 당 2.5 MG의 acepromazine을 사용하여 마취 혼합합니다. </li><li> 마취 혼합 (KXA) intraperitoneally을 주입하여 동물을 마취. 정기 발가락 곤란은 전반에 걸쳐 깊은 마취를 보장하기 위해 수행되어야합니다실험. 시간별 또는 필요에 따라 절반 원래의 복용과 함께 보충. </li><li> 수술을 수행하는 동안 열 지원을 제공하는 작은 동물 가열 패드를 사용합니다. </li><li> 각막 탈수 및 손상을 방지하기 위해 눈 위에 인공 눈물 연고를 적용합니다. </li><li> 트리밍 장치와 그리고 완전히 절개 주변에서 머리카락을 제거하는 날카로운 칼날로 먼저 동물의 다시 쉐이브. </li><li> 면도 머리카락을 제거하고 알코올 패드로 면도 피부 표면을 소독. </li><li> 원하는 척수 수준 (흉부 척추는 여기 참조)을 통해 피부의 작은 (~ 1.5 cm) 세로 절개를 수행합니다. </li><li> 신중하게 retracting 피하 결합 조직을하여 다시 근육을 폭로. </li><li> 조심스럽게 원하는 수준의 척추 칼럼에서 paravertebral 근육을 구분합니다. 각 spinous 과정의 양쪽에서 근육을 분리하고 분리된 근육을 밀고 가장 적은 수 incisions를 수행판상 표면에서 방법입니다. </li><li> 즉시 주동이의 및 laminectomy에 꼬리 제거 될 얇은 판을 선택하고 척추 양쪽에있는 척추 클램프에 대한 항목의 사이트를 준비합니다. 조심스럽게 클램프가 삽입됩니다 네 주머니를 만들기 위해 근육 조직을 치환. </li><li> 척수를 건드리지 않고 얇은 판 아래에있는 곡선 야기한 팁 가위 안전 삽입을 허용하기 위해 곧바로 이빨 - 팁 포셉와 척추 기포탑. 천천히 반대편에 다음 한쪽에있는 뼈 절단 및하여 laminectomy을 수행합니다. </li><li> 면봉을 사용하거나 사소한 출혈을 제한 incisions 옆에 precut 작은 gelfoam 흡수성 젤라틴 스폰지 조각을 삽입합니다. 필요한 경우 추가로 출혈을 제어하는​​ 작은 선박 cauterizer을 사용합니다. 조직을 씻어 살균 preheated 인공 뇌척수 (ACSF)를 사용합니다. </li></ol> 3. 생체내 이미징에 대한 열 및 척수 준비 안정화 <ol><li> Plac E는 척추 안정화 장치의 기본 판에있는 해발 패드에 동물과 머리 들고 어댑터에 머리를 보호할 수 있습니다. </li><li> laminectomy (그림 1) 측면 미리 준비 포켓에있는 동물의 앞쪽에 - 사후 축을 따라 STS - A 장치의 척추 클램프를 놓습니다. 두 클램프는 ~ 45 각도로 배치해야 ° 노출된 척수 (그림 1) 이상의 물을 침지 렌즈를 낮추는 충분한 공간을 허용하기 위해 동물의 때리고 - 꼬리 축에 대한 상대. </li><li> 동물의 시체가 이미징 실험 (그림 1)의 기간 동안 상승 패드의 제거 후 공중에 정지 수 있도록 꼬리의 기지에서 STS - A 장치의 세 번째 클램프를 놓습니다. </li><li> ACSF에서 척수의 유지 보수 및 생체내 이미징에서이 솔루션의 현미경 렌즈의 집중을 촉진하기 위해 노출된 척수 주위 Gelseal (Amersham Biosciences 주식 회사)의 작은 우물을 빌드합니다. </li></ol>jove_title "&gt; 4. 마우스 척수의 생체내 이미징에서 두 광자 현미경과 <ol><li> 현미경을 포함 preheated 챔버 내부의 척추 안정화 장치의 동물을 전송하고 똑바로 렌즈 (그림 1)에서 laminectomy를 배치 낮아 현미경 스테이지에 안전. </li><li> ACSF 솔루션 그것은 척추 겸자 또는 Gelseal을 만지지하지 않도록해야 할로 조심스럽게 물 침지 렌즈를 낮춥니다. </li><li> 관심 영역을 식별하고 그것에 초점을 epifluorescence 사용합니다. 레이저 스캔 모드로 전환하고 fluorophores에 대한 필터가 몇 군데 조직에있는 적절한 두 광자 레이저 여기 파장, dichroics 및 대역 통과를 사용하여 생체내 이미징에서 수행합니다. </li></ol> 5. 반복적인 이미징 및 사후 수술 치료 <ol><li> 이미징 실험 끝에, 척추 안정화 장치에서 마우스를 제거하고 조심스럽게 laminectomy 주변에서 Gelseal 닦으십시오.지역을 잘 청소하십시오. </li><li> 복원하고 laminectomy 위에 다시 근육을 봉합. </li><li> laminectomy을 통해 피부를 복원하고 봉합, betadine 그것을 면봉. </li><li> 한 ML 영양 및 수화 보충 Lactated Ringers 솔루션 (박스터 헬스케어),뿐만 아니라 subcutaneously 진통 치료를 (0.1 밀리그램 / kg buprenorphine) 제공합니다. </li><li> 살균 처리 intraperitoneally을 (마우스 당 0.03 ML, 2.27 %의 enrofloxacin 주사용 항균 솔루션) 관리할 수 있습니다. </li><li> 장소 마취에서 완전히 회복까지 가열 패드에 동물과 이후 개별적으로 그것을 집. </li><li> 포스트 operatively 2-3 일동안은 수술과 진통제 치료마다 8~12시간 후 첫 3~5일 매일 살균 관리를 반복합니다. 정상적인 동작 및 전체 복구를 위해 매일 동물을 모니터링합니다. </li><li> 같은 laminectomy를 통해 다시 이미징 들어, 봉합 피부와 근육을 열고 섹션 2에서 설명한 단계를 반복 - 4. </li><li> 다시 찾을 수 previously 이전 10 설명된대로지도의 혈액 vasculature를 사용하여 지역을 몇 군데. </li></ol> 6. 대표 결과 모든 동물의 절차는 캘리포니아, 샌프란 시스코 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회가 정한 지침에 따라 수행 및 연방 규정에 따라 아르되었습니다. 척추 안정화 장치의 사진과 현미경 렌즈 아래에있는 장치에 마우스의 위치를​​ 보여주는 도식은 그림 1에 표시됩니다. 동물의 몸을 아래 호흡 움직임에 대한 충분한 공간을 허용하는 것은 척수의 생체내 이미징의 안정 보장합니다. 그것이 Cx3cr1 GFP / + 형질 전환 마우스 18 척수의 생체내에 몇 군데했습니다 그림 2 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 보여줍니다, 하는 microglia는 endogenously GFP으로 표시됩니다. 그림 3 반복 쇼 예제그것이 형광 척수 axons의 단백질 (YFP - H 라인 3)와 microglia을 (Cx3cr1 GFP / + 생쥐)를 표현 생쥐에서 동일한 척수 영역에서 수행된 같은 생체내 이미징 인치 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 두 광자 현미경을 사용하여 생체내 이미징에 대한 마우스 척추 안정화. (A) 맞춤 제작 스틸베이스 플레이트는 STS - Narishige 컴팩트 척수 클램프와 MA - 6N Narishige를 지원하고 정렬하는 데 사용됩니다 여기에 그림과 같이 머리 어댑터를 들고. 척추 안정화 장치에 KXA 마취와 anesthetized 성인 유전자 변형 생쥐의 (B) 적절한 위치합니다. 삽입은 즉시 rostrally 및 caudally laminectomy와 노출된 척수 조직에 척추 클램프의 위치를​​ 보여줍니다. &lt;IMG 고도 = "그림 2"SRC = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg"/&gt; 그림 2. anesthetized 생쥐의 척수에 고밀도 microglial 세포와 혈관의 생체내 이미징에서. 의 예상하지만, 비 정렬 Z - 스택 (A) 혈관과 가까이 CX3CR1 GFP / + 마우스 (빨강, rhodamine dextran의 IV 주입으로 표시)의 척수에 높은 고밀도 GFP 양성 microglia (녹색). (B) 높은 배율 이미지 (A) 선박 주변에 확장 프로세스와 척수의 실질 향해 혈관의 벽에 붙어 하나의 microglial 세포와 같이 표시. 스케일 바, 10μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3.들은 다른 일에 대한 이전 및 anesthetized 생쥐의 척수에서 reimaged 것처럼 동일한 axonal 세그먼트와 microglia의 생체내 이미징 반복. (A) YFP - 실험실 일 0과 5 eled axons. (B). 그들 주위 동일한 혈관 구조와 microglial 세포가 일 0과 1 Cx3cr1 GFP / + 마우스의 척수의 생체내에 몇 군데. 스케일 바, 10μm. 영화 1. 대표 timelapse 시퀀스 마우스 척수에서 생체내에 인수했다. 이 시퀀스는 밀도가 높은 형광 구조로 채워진 조직 내에서 시간이 지남에 따라 vasculature (빨강, rhodamine dextran의 IV 주입으로 표시)과 세부 좋은 microglial 공정 역학 (녹색)과 상호 작용에 보여줍니다. RAW 이미지는 배경 노이즈, 밝기 및 대비를 위해 수정되었으며 timelapse 영화는 평균 또는 개별 비행기의 Z - 선택, 이미지 정렬하지 않고, Z - 돌출 순차적으로 획득한 이미지 스택에 의해 건설되었습니다. 혈관이 microglia의 이미지로 Z 비행기의 비슷한 범위로 이동합니다. Z 평면 깊이 : 38 μm의.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov은 "&gt; 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오. 영화 2. Timelapse 시퀀스는 단일 Z - 비행기의 수준에서 이미징 메서드의 원료 안정성을 보여주는. KXA의 마취에서 척수 안정화 장치에 배치 CX3CR1 GFP / + 마우스의 척수에서 동일한 단일 Z - 비행기의 빠른 수집은보다 빠른 1 프레임 / s의 스캔 속도로 연속 프레임 사이의 최소한의 이미지 변위를 보여줍니다 마우스의 호흡 속도. 미성년자 잔여 변위 아마 심장이에 의한 것은. <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

방법은 여기서 설명하는 것은 허용에 대한 안정적이고 두 광자 현미경을 사용하여 anesthetized 생쥐의 척수에서 인구 밀도가 높은 형광 세포 구조의 생체내 이미징의 반복. 달성 안정성은 맞춤 제작 척추 안정화 장치와 호흡 유발 운동 유물을 감소 마취 처방의 결과입니다. 척추 안정화 장치는 마우스 본체 아래 호흡 공간을 허용하고 상용 척추 클램프 및 헤드 장착 부분 (그림 1)를 사용하여 만들 수 있습니다. 방법은 법으로서, 높은 재현성이고 지속적으로 광범위한 이미지 후처리 (Fig.2와 비디오 1)하지 않고 실험 분석에 사용할 수있는 원시 데이터를 생성합니다. 이 기술은 따라서 상용 형광 마우스 라인 (Figs. 1-3 및 비디오 1)의 풍부 세포 세포 상호 작용 연구에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 인구 밀도가 높은 세포 구조지만,뿐만 아니라 문제를 해결할 수LSO는 빠른 속도로 세포 기능이나 반응 (비디오 1, 2)를 발생. 예를 들면, 그것은 양적 시간이 지남에 따라뿐만 아니라 거리 chemotac...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Rhodamine B dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 에 희석 70 kDa, ACSF (3 % W / V) </td></tr><tr><td> 케타민을 HCL </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC 번호 : 67457-001-10 </td><td> 주사용, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> 로이드 실험실 </td><td> 나다 번호 : 139-236 </td><td> Xylazine의 주사용, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> 나다 번호 : 117-531 </td><td> 주사용, 10mg/ml </td></tr><tr><td> 인공 눈물 연고 </td><td> 피닉스 제약 </td><td> NDC 번호 : 57319-760 - 25 </td><td> 윤활유 </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 어부 </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> 맥퍼슨 - Westcott 가위 </td><td> 세계 정밀 인 스트 루먼트 </td><td> 555500S </td><td> 곡선, 야기한 팁 가위 </td></tr><tr><td> 스트레이트 집게 </td><td> 세계 정밀 인 스트 루먼트 </td><td> 555047FT </td><td> 톱니 팁 포셉 </td></tr><tr><td> 작은 용기가 부식 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, 화이자 주식 회사 </td><td> 믹서 밀 MM400 </td><td></td></tr><tr><td> 컴팩트 척수 클램프 </td><td> Narishige </td><td> STS - A </td><td></td></tr><tr><td> 머리 들고 어댑터 </td><td> Narishige </td><td> MA - 6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences 주식 회사 </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated Ringers </td><td> 박스터 헬스케어 &lt;/ TD&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser 제약 주식 회사 </td><td> NDC 번호 : 12496 - 6757-1 </td><td> Buprenorphine, 주사용 </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> 바이엘 </td><td> 나다 140-913 </td><td> Enrofloxacin, 항균 주사용 2.27 % (20ml) </td></tr><tr><td> 생리대 - 대형 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

유전자 특정 세포 타입 2-3가 크게 생체내 4-7의 수많은 조직의 생리와 병리 학적 과정을 우리의 지식을 넓혀이에 형광 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다 생쥐 두 - 광자 현미경 하나를 사용하여 생체내 이미징에. 중추 신경계 (CNS)의 연구에서는 소설의 과다 등에 따라 뉴런, astrocytes, microglia로 세포의 행동에 대해 종종 예상치 못한 결과를 생산했다 두뇌의 생체내 이미징의 광범위한 응용 프로그램을 찾고있다 생리적 또는 병적인 상태 8-17. 그러나, 대부분 기술적인 합병증은 살아있는 마우스 척수 연구에서 생체내 이미징의의 구현을 제한합니다. 특히, 폐, 심장에 척수의 해부 가까이 이미징 살아있는 척수 도전 과제 만들어 상당한 운동 유물을 생성합니다. </P&gt; 우리는 척추를 안정화 호흡 유도 동작을 감소시키고 생체내에서 이미지를 마우스 척수를 두 광자 현미경의 사용을 촉진하여 척수 이미징의 고유의 한계를 극복 소설 방법을 개발했습니다. 이것은 호흡 유도 동작을 크게 감소 그 결과, 깊은 마취의 방법으로 사용자 정의 척추 안정화 장치를 결합하여 이루어진다. 이 비디오 프로토콜은 조직 부상을 유지하고 최소한으로 출혈하여 장시간 동안 안정적인 생리 조건 하에서 유지 수있는 살아있는 척수의 작은 영역을 노출하는 방법을 보여줍니다. 대표 원시 이미지는 고해상도의 생체내 자세히 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 인수했다. timelapse 시퀀스가​​ 살아있는 마우스 척수에있는 microglial 프로세스의 역동적인 동작을 보여줍니다. 또한, 같은 Z - 프레임의 연속 스캔이 입증이 방법은 이미지 정렬 후 획득을 필요로하지 않는 이미지 및 / 또는 timelapse 영화 스택을 생성 달성할 수있는 뛰어난 안정성의. 마지막으로, 우리는 생체내에 지속적인 생리적 또는 병적인 프로세스 종단 연구 있으므로이 방법은 나중에 timepoints에서 척수의 동일한 영역을 다시 방문하고 reimage하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서 프로토콜<em&gt; 생체내에</em두 광자 현미경을 사용하여&gt; 척수 이미징이 설명되어 있습니다. 이 방법은 호흡 유발 움직임을 최소화하고 더 정렬 또는 후처리 다른 필요하지 원시 영상 자료를 생산하기 위해 척추 안정화 장치와 마취 처방을 결합한 제품입니다.

특정 세포 유형에서 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 생쥐 2-3를 이용한 이광자 현미경 1 기반의 생체 내 이미징은 ...

본 절차의 목적은 이광자 현미경을 사용하여 마우스 척수에서 안정적인 인비보(in vivo) 이미징을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 일정하고 차분한 호흡 리듬을 유지할 수 있는 혼합 마취제로 동물을 마취합니다. 절차의 두 번째 단계는 원하는 높이에서 척주를 노출시킨 후, 하부의 척수를 노출시켜 인비보 이미징이 가능하도록 층판절제술(laminectomy)을 수행하는 것입니다.세 번째 단계는 동물을 척수 고정 장치에 배치하는 것입니다. 마지막 단계는 노출된 척수 분절을 격리하는 것입니다. 생체 내(in vivo) 영상 촬영을 준비함으로써, 궁극적으로 이광자 현미경을 이용한 시계열 생체 내 영상 촬영을 통해 살아있는 척수 내 세포의 동적 거동과 다른 세포 유형 또는 구조와의 상호작용에 대한 상세한 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술이 이전의 생체 내 척수 영상 촬영 시도보다 가지는 주요 장점은, 후처리가 필요 없으며 즉각적인 평가와 추가 분석에 활용 가능한 생체 내 영상 데이터를 생성한다는 점입니다. 이 기술의 함의는 척수 손상 또는 질환 이후의 치료까지 확장되는데, 예를 들어 척수 손상 외에도 부상 후 축삭 변성이나 재생의 진행 과정을 실시간으로 연구할 수 있게 해주기 때문입니다. 또한, 이 기술은 다발성 경화증이나 근위축성 측색 경화증과 같이 척수에서 질병 병리가 두드러지게 나타나는 질환 동물 모델에서 염증성 또는 신경퇴행성 과정의 진행을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.동물의 무게를 측정하는 것으로 실험 절차를 시작합니다. 그다음, 마취제를 복강 내로 주입하여 동물을 마취시킵니다. 실험 전반에 걸쳐 동물이 깊은 마취 상태를 유지하는지 확인하기 위해 정기적으로 발가락 집기 반응을 확인하며, 필요에 따라 매시간 또는 수시로 초기 마취 용량의 절반을 추가 투여합니다.그 다음 각막의 탈수와 손상을 방지하기 위해 안구에 인공눈물 연고를 도포합니다. 트리머를 사용하여 동물의 등 부분 털을 다듬고, 남은 털은 날카로운 면도날로 제모합니다. 제모한 부위를 소독한 후, 동물을 현미경 아래에 배치하고 원하는 척수 높이 위로 약 1.5 centimeters 정도의 작은 세로 절개를 만들어 시술을 시작합니다.피하 결합 조직을 조심스럽게 견인하여 등 근육층을 노출시킵니다. 그다음, 원하는 높이에서 척추 기둥으로부터 척추 주변 근육을 조심스럽게 분리합니다. 각 극돌기의 양측에서 근육을 분리할 때 절개 횟수를 최대한 최소화합니다.그 후, 박리된 근육을 라미나 표면에서 긁어내어 제거합니다. 필요한 경우 소형 혈관 소작기를 사용하여 미세 출혈을 제어하십시오. 하부 라미나가 충분히 노출되어 제거하려는 부위를 명확하게 식별할 수 있을 때까지 근육을 계속 긁어냅니다.척주 양측의 척수 클램프 삽입 부위를 준비하려면, 곡선 가위의 끝을 척추 주변 근육 사이에 삽입하고 근육 조직을 조심스럽게 밀어내어 클램프가 삽입될 네 개의 포켓을 만듭니다. 척수를 건드리지 않고 층판 아래로 곡선 둔단 가위를 안전하게 삽입할 수 있도록 직선 치아 팁 포셉으로 척주를 들어 올립니다. 그런 다음 한쪽 뼈를 천천히 절단하고 이어 반대쪽을 절단하여 층판 절제술을 수행하며, 약간의 출혈을 제한하기 위해 면봉을 사용하거나 절개 부위 옆에 미리 잘라둔 작은 젤 폼 흡수성 젤라틴 스펀지 조각을 삽입합니다.그 후, 예열된 멸균 인공 뇌척수액을 사용하여 조직을 세척합니다. Nagate STSA 복합 척수 클램프와 Nagate MA 6-N 머리 고정 어댑터를 주요 구성 요소로 하여 척수 안정화 장치를 맞춤 제작하였습니다. 동물의 척주와 꼬리가 고정되는 동안 머리가 지지될 수 있도록 두 개의 naga 부품을 정렬하여 고정하는 스테인리스 스틸 베이스 플레이트를 제작하였습니다.동물을 안정시키기 위해 현미경 스테이지를 낮춘 상태에서 장치 전체가 현미경 렌즈 아래에 들어와야 함을 유의하십시오. 먼저, 척수 고정 장치의 베이스 플레이트에 있는 높이 조절 패드 위에 동물을 배치합니다. 헤드 홀딩 어댑터로 머리를 고정한 후, SDSA 장치의 척수 클램프를 척추궁 절제술 부위 양옆의 미리 준비된 포켓에 맞춰 동물의 전후축을 따라 배치하십시오.노출된 척수 위로 수침 렌즈를 내릴 수 있는 충분한 공간을 확보하기 위해, 동물의 ROS 척수 축을 기준으로 약 45도 각도로 두 개의 클램프를 배치합니다. 그런 다음, 영상 촬영 실험 시 높이 조절 패드를 제거한 후 동물의 몸을 매달 수 있도록 꼬리 기부에 세 번째 클램프를 배치합니다. 다음으로, 노출된 척수를 A CSF 상태로 유지하기 쉽도록 척수 주변에 젤 씰로 작은 웰을 만듭니다.그다음 In vivo 이미징을 시작할 준비가 되면 고정 패드를 제거하고, 안정화 장치를 예열된 현미경 챔버로 가져가 낮춰진 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 척추궁 절제술 부위가 렌즈와 일직선이 되도록 정렬하십시오. 수침 렌즈를 A CSF 용액 속으로 조심스럽게 내리되, 척수 클램프나 겔 씰에 닿지 않도록 주의하십시오.에피 형광(epi fluorescence)을 사용하여 관심 영역을 확인한 후 해당 부위에 초점을 맞춥니다. 레이저 스캐닝 모드로 전환하고, 이미지 조직 내에 존재하는 형광 물질에 적합한 이광자 레이저 여기, 파장, 다이크로익 미러 및 밴드패스 필터를 사용하여 인비보(in vivo) 이미징을 수행합니다. 이미징 실험이 끝나면 척수 고정 장치에서 동물을 분리합니다.laminectomy 주변 영역에서 겔 씰을 조심스럽게 닦아내고 세척합니다. laminectomy 부위 위로 등 근육을 잘 봉합합니다. 그런 다음 피부 절개 부위를 봉합하고, 여기 Zack 이미지의 투영으로 표시된 것처럼 Betadine으로 닦아냅니다. 이 이미지는 in vivo에서 필요에 따라 촬영된 후 이미지 정렬 없이 Z축을 따라 투영되었습니다.이미지는 척수 내 혈관(빨간색)과 밀접하게 인접하여 분포하는 고밀도의 GFP 양성 미세아교세포(녹색)를 보여줍니다. 여기는 혈관 벽에 부착된 단일 미세아교세포의 고배율 이미지로, 혈관 주위로 뻗어 나가는 돌기와 척수 실질 쪽으로 뻗어 나가는 돌기의 세부 모습을 보여줍니다. 여기는 동일한 YFPH 라인 마우스의 척수에서 5일 간격으로 두 번에 걸쳐 촬영한, 위치가 변경된 동일한 YFP 표지 축삭 분절의 반복적인 생체 내(in vivo) 이미징 예시입니다. 이것은 이틀 연속으로 척수 내에서 생체 내로 촬영한 동일한 혈관 구조와 미세아교세포를 보여주는 또 다른 반복 이미징 예시입니다.다음은 척수에서 in vivo로 획득한 대표적인 타임랩스 시퀀스입니다. 이 시퀀스는 녹색으로 표시된 미세아교세포(microglial cells)의 미세 돌기들의 역동적인 거동과 빨간색으로 표시된 혈관과의 상호작용을 상세히 보여줍니다. 시간이 지남에 따라, 원본 이미지는 배경 노이즈, 밝기 및 대비만 보정되었으며, 이미지 정렬 없이 순차적으로 이미지 스택을 거부함으로써 타임랩스 영상을 제작하였습니다.개별 평면의 평균적인 선택 기준에 따라, 혈관은 미세아교세포 이미지와 유사한 범위의 Z 평면을 통과합니다. 이미지 볼륨의 깊이는 38 microns입니다. 이 영상은 단일 Z 평면 수준에서 이미징 방법의 안정성을 보여주는 타임랩스 시퀀스입니다.KXA 혼합물로 마취하고 척수 고정 장치에 배치한 CX3CR1 GFP 이형접합체 마우스의 척수에서 동일한 단일 Z 평면을 빠르게 획득한 결과, 연속된 프레임 간의 이미지 변위가 최소화되었음을 보여줍니다. 특히, 이 시퀀스의 속도는 초당 1프레임이었으며, 이는 마우스의 호흡률보다 빠른 속도입니다. 소량으로 남은 잔여 변위는 아마도 동물의 심장 박동으로 인한 것일 가능성이 높습니다.이 절차를 수행할 때, 절개 횟수를 최소한으로 제한하고 미세 출혈이 발생하면 즉시 이를 억제하는 것이 중요합니다. 이제 이 영상을 통해 이광자 현미경을 이용하여 마우스 전전두엽 피질에서 안정적인 생체 내(in vivo) 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Source: Nishimura, C.  외. HIV-induced Neuroinflammation의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 대뇌 혈관 건축의 정량화. J. Vis. 특급. (2016). 이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 피질 모세혈관의 생체 내 시각화를 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창이 있는 마취된 마우스에 형광 염료를 주입하고, 이미징을 위한 설정을 준비하고, 분석을 위해 뇌 미세혈관 구조의 상세한 이미지를 획득하는 단계를 간략하게 설명합니다.

 마우스 뇌 미세혈관 구조의 생체 내 이미징을 위한 이광자 현미경 

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상

Two-photon intravital imaging은 등쪽 기둥 외상성 척수 파쇄 손상이 있는 골수 키메라 동물의 원래 조직 환경에서 척수의 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

이 프로토콜은 쥐의 척수에 유리 창을 이식하여 분사 내 현미경 검사법에 의한 시각화를 용이하게 합니다.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

배우세요 마우스 척수의 생체내 이미징 방법을 두 광자 현미경과 맞춤형 척수 고정 장치를 활용하여 세포 역학을 고해상도로 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 호흡으로 인한 움직임 인공물을 최소화하여 장기간 연구가 가능합니다.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

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